Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÚY DIỆU
MSV: 1101077

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÚY DIỆU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Th.S Trần Thị Lan Hương
2. Th.S Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược- ĐH Dược HN
Trung tâm đánh giá TĐSH - VKN thuốc TW

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
Th.S Trần Thị Lan Hương - Giảng viên bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược
Hà Nội và Th.S Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung tâm Tương đương sinh học Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn em thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược
Hà Nội, Trung tâm Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương,
thầy cô và các anh, các chị đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời
gian thực hiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược
Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình
học tập để em có được thành quả ngày hôm nay.
Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn ở bên
động viên, cổ vũ và giúp đỡ em trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Trần Thị Thúy Diệu


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Tổng quan về Pantoprazol ...................................................................................2
1.1.1. Công thức hóa học ............................................................................................2

1.1.2. Tính chất hóa lý .................................................................................................2
1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của PAN ........................................2
1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường .......................................................................3
1.1.5. Một số phương pháp định lượng PAN trong dịch sinh học ..............................4
1.2. Tổng quan về HPLC và thẩm định phương pháp định lượng thuốc
trong dịch sinh học ......................................................................................................5
1.2.1. Tổng quan về HPLC..........................................................................................5
1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học .......................9
CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................11
2.1. Điều kiện thực nghiệm .......................................................................................11
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................13
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................13
2.4. Phương pháp xử lí kết quả .................................................................................19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ...............................................................20
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng.......................................................20
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ........................................................27
3.3. Bàn luận .............................................................................................................40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................41
4.1. Kết luận ..............................................................................................................41
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PAN

: Pantoprazol

CV

: Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

IS

: Chất nội chuẩn (Internal standand )

LLOQ

: Nồng độ giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification)

ULOQ

: Nồng độ giới hạn định lượng trên (Upper Limit of Quantification)

QC

: Mẫu kiểm tra chất lượng (Quality Control Samples)

LQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Lower Quality Control Samples)

MQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples)

HQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

SKĐ

: Sắc ký đồ

Cmax

: Nồng độ đỉnh

T1/2

: Thời gian bán thải

UV–VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visble)
US–FDA : Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
(United States of American Food and Drug Administration)
EMA

: Cơ quan quản lý thuốc Châu âu (European Medicine Agency)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số chế phẩm pantoprazol trên thị trường

3

1.2

Một số nghiên cứu định lượng pantoprazol trong dịch sinh học

4

2.1

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

11

2.2

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

11

2.3

Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu

12

2.4

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

12

2.5

Chuẩn bị đường chuẩn

14

2.6

Chuẩn bị mẫu kiểm tra

14

3.1

Kết quả đáp ứng mẫu trắng

28

3.2

Kết quả thẩm định đường chuẩn

29

3.3

Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới

30

3.4

Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày

31

3.5

Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác khác ngày

32

3.6

Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn

33

3.7

Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi pantoprazol

34

3.8

Độ ổn định dung dịch nội chuẩn trong thời gian ngắn

35

3.9

Độ ổn định dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày

35

3.10

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã

36

3.11

Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

37

3.12

Độ ổn định của nồng độ 90 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian
dài

38

3.13

Độ ổn định của nồng độ 3500 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian
dài

38

3.14

Độ ổn định của mẫu trong auto – sampler

39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình

Nội dung

Trang

3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của PAN

20

3.2

SKĐ PAN và omeprazol

21

3.3

SKĐ PAN và rabeprazol

21

3.4

SKĐ PAN và lansoprazol

22

3.5

SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 30:70

23

3.6

SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 36:64

23

3.7

SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3
(36:64) với tốc độ dòng 1,3 mL

24

SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3
3.8

(36:64) với tốc độ dòng 1,5 mL

24

3.9

Quy trình xử lý mẫu

25

SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS với quy trình xử lý mẫu

3.10

được chọn

26

3.11

SKĐ mẫu huyết tương trắng

27

3.12

SKĐ mẫu huyết tương trắng có chứa nội chuẩn

27

3.13

SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa PAN

27

3.14

SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml.

27

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Loét dạ dày - tá tràng là bệnh khá phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Hiện
nay, đây đang là bệnh đứng đầu về tỉ lệ mắc trong số các bệnh về đường tiêu hóa.
Trên thế giới, ước tính khoảng 10% dân số mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân
biệt giới tính, tỉ lệ mắc bệnh ở người lớn cao hơn trẻ em và hàng năm tăng khoảng
0,2% [18]. Có nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm thuốc
kháng acid, nhóm thuốc kháng H2, nhóm thuốc ức chế bơm proton... Trong đó,
nhóm thuốc ức chế bơm proton tác dụng nhanh, hiệu quả, tỷ lệ làm lành vết loét có
thể đạt tới 95% sau tám tuần điều trị. Thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự
bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày[1]. Do đó, nhóm thuốc này
được sử dụng rất nhiều trong các phác đồ điều trị loét dạ dày - tá tràng.
Pantoprazol là thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton, thuốc dung nạp tốt, ít
để lại tác dụng phụ nên là một trong những thuốc đang được sử dụng phổ biến tại
Việt Nam. Để có được liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc
kiểm soát nồng độ hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết. Ngoài ra, việc
giám sát chất lượng thuốc cũng như đánh giá tương đương sinh học thuốc chứa
pantoprazol là vô cùng quan trọng nhằm nâng cao chất lượng thuốc và giúp bác sĩ
lựa chọn được các thuốc an toàn, hiệu quả, kinh tế. Tuy vậy, hiện nay ở nước ta vẫn
chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định
lượng pantoprazol trong huyết tương.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng phương pháp xác
định nồng độ pantoprazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và
đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất pantoprazol chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài : “Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol
trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 nội dung
chính:
1. Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng

phương pháp HPLC.
2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy
để định lượng pantoprazol trong huyết tương theo tiêu chuẩn US-FDA và
EMA.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ PANTOPRAZOL
1.1.1. Công thức hóa học
- Pantoprazol (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S
- Khối lượng phân tử : 383,37
- Công thức cấu tạo :

- Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – 2 – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl)
methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12].
1.1.2. Tính chất hóa lý
- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng.
- Khó tan trong nước, log P = 2,18.
- Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri
ngậm 1,5 phân tử nước.
- Hấp thu UV do có liên kết đôi liên hợp [3,12,14].
1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của pantoprazol
* Cơ chế tác dụng:
Sau khi được hấp thu, PAN tích lũy trong ống tiết acid của tế bào thành dạ dày.
Ở đây, nó gắn kết với nhóm sulfhydryl của hệ enzyme H+/ K+ - ATPase trên bề
mặt tiết gastrin của tế bào vách, gây ra sự ức chế tiết acid cơ bản và tiết acid do kích
thích. PAN có thể ức chế sự tiết acid dạ dày mà không kể đến bản chất của kích
thích (acetylcholin, histamin, gastrin…) [1,2,20].

* Dược động học:
- Hấp thu: PAN được hấp thu nhanh. Nồng độ đỉnh Cmax của PAN là 2400
ng/mL đạt được sau khoảng 2 – 2,5 giờ khi dùng PAN liều 40mg chia liều hoặc


3

dùng liều duy nhất. Thức ăn làm tăng thời gian hấp thu nhưng không làm thay đổi
Cmax và diện tích dưới đường cong AUC của PAN.
- Phân bố: 98% PAN gắn kết với protein huyết tương. Thể tích phân bố
khoảng 0,17 l/kg, phân bố chủ yếu trong dịch ngoại bào.
- Chuyển hoá: PAN được chuyển hoá chủ yếu ở gan nhờ enzym CYP2C19
của cytochrom P450 để thành demethylpantoprazol.
- Thải trừ: Chất chuyển hoá bài tiết chủ yếu qua nước tiểu (80%), lượng còn lại
thải trừ qua mật và phân. T1/2 khoảng 1 giờ và kéo dài trong suy gan, ở bệnh nhân
xơ gan là 3 - 6 giờ.Vì vậy, cần xem xét hiệu chỉnh liều cho bệnh nhân suy gan
[1,2,14,20].
* Chỉ định
- Loét dạ dày - tá tràng.
- Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản.
- Hội chứng tăng tiết acid (hội chứng Zollinger Ellison).
- Dự phòng loét dạ dày - tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do
stress [1,2,20].
1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường
Các chế phẩm có chứa PAN trên thị trường chủ yếu ở dạng: bột pha tiêm
truyền tĩnh mạch, viên nang tan trong ruột hàm lượng 40mg [1]. Ngoài ra còn một
số dạng như viên nén, viên giải phóng kéo dài... đáp ứng nhu cầu đa dạng của người
sử dụng. Một số chế phẩm chứa PAN trên thị trường được trình bày cụ thể tại bảng
1.1 [19].
Bảng 1.1: Một số chế phẩm PAN trên thị trường

STT

1

2

Dạng bào chế

Viên nén bao tan
trong ruột

Bột đông khô pha
tiêm

Tên biệt dược

H/lượng

Nhà sản xuất

Bio-panto

40mg

Biodeal Laboratories

Hasanloc

40mg

Hasan- Dermapharm

Pantoloc

40mg

Nycomed

Pantostad

40mg

STADA- VN J.V

SP Extream

40mg

Shinpoong Daewoo

Sozol

40mg

Atlantic Pharma

Pantoloc

40mg

Nycomed

Pantosec

40mg

Cipla


4

PMS-Pantoprazol

40mg

Pharmascience Inc

3

Viên nén GPKD

Proton-P

40 mg

Aristopharma

4

Viên nén

Nolpaza

40mg

KRKA

1.1.5. Một số phương pháp định lượng pantoprazol trong dịch sinh học
Hiện nay, định lượng PAN nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang
hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định lượng PAN trong dịch
sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như HPLC, điện di mao
quản, phóng xạ miễn dịch. Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn
được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số phương pháp
định lượng PAN trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng PAN trong dịch sinh học
Điều kiện sắc ký
PP

Mẫu

1 Huyết
[17] tương
chó

2
[6]

Huyết
tương
người

Xử lý mẫu
Tủa
protein

IS

Omeprazol

bằng
acetonitril
Tủa
protein
bằng
acetonitrilmethanol=

Rofecoxib

Cột

Huyết
3
tương
[10]
người

Omeprazol

Detector

Diamosil
C18
(250
mm×4
mm)

Acetonitril:
10mM amoni
UV,
acetat pH 6,0 λ 290nm
Tốc độ dòng:
1ml/phút

Chromasil
C18
(250 mm x
4.6 mm)

Acetonitril :
đệm phosphat
UV,
pH 3,15 =
λ 272nm
42 :58 (v/v)
Tốc độ dòng:
1ml/phút

Diamosil
ODS C18
(150mm×4

,6mm)

Acetonitril:
đệm phosphat
UV,
pH 6,8 =
λ 288nm
32:68 (v/v)
Tốc độ dòng:
1,5 ml/phút

50:50 (v:v)
Tủa
protein
bằng
methanol
(MeOH)

Pha động


5

Nhận xét:
Phương pháp 1, 2 và 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung
môi MeCN, MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa
sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ, không thuận
lợi cho quá trình phân tích mẫu.
Ngoài ra, với phương pháp 2 dùng nội chuẩn là rofecoxib, là một thuốc
NSAID cấu trúc không có nhiều điểm tương đồng với pantoprazol nên dùng làm nội

chuẩn là chưa thực sự hợp lý.
Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý
hóa của PAN, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng PAN trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội
chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân
tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm
nghiệm của Việt Nam.
1.2. TỔNG QUAN VỀ HPLC VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
1.2.1. Tổng quan về HPLC
1.2.1.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chếphân bố [4,5].
* Pha tĩnh:
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách
của hỗn hợp các chất.
Loại pha tĩnh phổ biến được chế tạo trên nền Silica. Nhóm OH trên bề mặt hạt
silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan:

Ở đây, R có thể là mạch thẳng có 18 hoạc 8 carbon hoặc nhóm hữu cơ khác
như hydrocarbon thơm... Tính phân cực của pha thay đổi tùy thuộc gốc R [4,5].


6

* Pha động:
Pha động là dung môi rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Yêu cầu của
pha động:
- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

- Hòa tan chất cần phân tích.
- Có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường [5,16].
* Phân loại sắc ký: dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà chia làm
2 loại:
- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân cực hơn.
Trong sắc ký pha thuận thì chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ
phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần.
- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực hơn. Trong sắc
ký pha đảo thì các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực
của pha động thì thời gian lưu tăng dần [4,5].
1.2.1.2. Cấu tạo máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản, bao gồm các bộ phận chính sau:
* Hệ thống cấp dung môi:
Hệ thống cấp dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ.
Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan.
* Bơm:
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định,
phù hợp với quá trình sắc ký.
* Bộ phận tiêm mẫu:
Để đưa mẫu phân tích vào cột, có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng
hệ thống tiêm tự động.
* Cột sắc ký:
Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ
với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác
nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký.
* Detector:

7

Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [4,5].
1.2.1.3. Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC
* Thời gian lưu tR
Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.
Thời gian lưu càng lớn, chất tan càng bị lưu giữ mạnh, thời gian phân tích kéo
dài. Nếu tR quá nhỏ thì khả năng tách kém [4,5].
* Hệ số chọn lọc α
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số
chọn lọc α :
α =

=

=

Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α >1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [4,5].
* Hệ số đối xứng của pic F
F=
Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [4,5].
* Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột:

Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [4,5].
* Hệ số bất đối AF
Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:
AF =
Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic
a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao
pic[4,5]


8

* Độ phân giải Rs
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
Rs =
Trong đó:
t(R)A; t(R)B

hoặc

: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).

WA; WB
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2A; W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: RS > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [4,5].
1.2.1.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic. Có 4 phương pháp
thường được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn

nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Do đặc điểm của nền mẫu huyết tương có chứa nhiều thành phần khác nhau
nên các phương pháp định lượng hoạt chất trong huyết tương thường có giai đoạn
xử lý chiết tách hoạt chất, loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng nên gây ra rất nhiều sai số.
Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc
trong huyết tương do phương pháp này có thể hạn chế được các sai số vừa nêu trên
và các sai số gây ra do máy móc và kỹ thuật.
Phương pháp chuẩn nội:
* Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử lượng bằng nhau của một
chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là
nội chuẩn.
* Yêu cầu với chất nội chuẩn:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất nội chuẩn phải được tách hoàn toàn và có
thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử.
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
* Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm:
Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa lượng chất chuẩn khác nhau nhưng cùng
chứa một lượng nội chuẩn. Tiến hành sắc ký và ghi lại đáp ứng pic, từ đó vẽ đường


9

chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (chiều cao) pic của chuẩn trên
nội chuẩn với tỷ số nồng độ chuẩn trên nội chuẩn. Song song tiến hành sắc ký mẫu
thử cũng được thêm chuẩn với lượng như trên. Tính tỷ số diện tích ( chiều cao ) pic
của chất thử trên diện tích ( chiều cao ) pic của chất nội chuẩn rồi dựa vào đường
chuẩn tìm nồng độ của chất thử [4,5].

1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học
1.2.2.1. Khái niệm
Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá
trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng
của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích
thực tế.
1.2.2.2. Một số phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong
dịch sinh học
Do dịch sinh học chứa nhiều thành phần khác nhau nên khác với định lượng
các dạng bào chế hay định lượng nguyên liệu, định lượng dược chất trong dịch sinh
học thì khâu xử lý mẫu đóng vai trò rất quan trọng, nó có tính quyết định đến kết
quả phân tích. Hiện nay thường áp dụng 3 phương pháp chính để xử lí mẫu huyết
tương là :
- Phương pháp chiết pha rắn: là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng chất
rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp.
- Phương pháp kết tủa protein: là quá trình loại protein trong mẫu bằng tác
nhân gây tủa protein như acid mạnh (percloric, tricloracetic, trifluoracetic) hoặc
dung môi (MeOH, MeCN).
- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan
trong một dung môi sang dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất.
1.2.2.3. Nội dung thẩm định
* Tính chọn lọc – đặc hiệu
Độ chọn lọc hay tính đặc hiệu thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể
xác định (định tính - định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các
thành phần khác có trong mẫu thử như các chất nội sinh, chuyển hóa, sản phẩm
phân hủy hay các thuốc uống cùng [7,8,13,15].
* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều
cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ

10

thấp nhất đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn phải
gồm ít nhất 6 nồng độ chất chuẩn pha trên cùng một mẫu dịch sinh học [7,8,13,15].
* Giới hạn định lượng dưới ( LLOQ)
Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (1/30-1/10 Cmax) thường
được chấp nhận là LLOQ [7,8,13,15].
* Độ đúng
Độ đúng: giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của
mẫu đã biết [7,8,13,15].
* Độ chính xác
Độ chính xác: là độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân
tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV
(%)[7,8,13,15].
* Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui
trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không qua chiết tách, được pha trong
dung môi phù hợp [7,8,13,15].
* Độ ổn định
Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá
trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong
thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử.
Đánh giá độ ổn định gồm:
- Độ ổn định của dung dịch nội chuẩn gốc và dung dịch gốc: Độ ổn định thời
gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài.
- Độ ổn định của dung dịch làm việc: Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ
phòng, độ ổn định thời gian dài.
- Độ ổn định của mẫu dịch huyết tương: sau 3 chu kỳ đông - rã, ở nhiệt
độ phòng trong thời gian ngắn, trong thời gian dài, sau xử lý [7,8,13,15].

11

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được
trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3.
Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
Tên

Nơi sản xuất

Số kiểm soát

Hàm lượng

Pantoprazol

VKNT TP HCM

QT219011212

93,87%

Pantoprazol natri

VKNTTW

0114306.01

93,72%

Lansoprazol

VKNTTW

WS. 0106203

99,5%

Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Hóa chất

Độ tinh khiết

Nơi sản xuất

Acetonitril

HPLC

Merck, Đức

Methanol

HPLC

Merck, Đức

Dikali hydrophosphat

P.A

Merck, Đức

Tertbutyl methyl ether

P.A

Merck, Đức

Triethyelamin

P.A

Merck, Đức


12

Bảng 2.3: Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu
Mẫu

Lô

Nơi cung cấp

Bảo quản

01

13PN00493

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

02

13PN00196

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

03

13PN00237

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

04

13PN00343

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

05

13PN00083

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

06

13PN00228

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

07

15P006178

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Thiết bị
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nhà sản xuất
Shimadzu, Nhật

Cân phân tích

Sartorius-CP224S, Đức

Máy ly tâm lạnh

Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức

Tủ lạnh sâu -35oC ± 5oC

Sanyo MDF – 236, Nhật

Tủ lạnh bảo quản chất chuẩn

Haier, Trung Quốc

Thiết bị lọc nước

TKA, Đức

Máy lắc xoáy

Velp, Ý

Máy lắc cơ học

GFL, Đức

Micropipet

Eppendorf, Đức

Đầu típ cho micropipet

Isolab, Đức

Ống chiết thủy tinh 15 mL

SUPELCO, Đức

Bình định mức, pipet class A

Prolabo, Pháp


13

Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Shimadzu gồm: Interface CBM - 2A; bơm
cao áp LC - 20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL - 20AC; Detector DAD SPD M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO - 20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC
Solution Shimadzu.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng
HPLC: lựa chọn phương pháp xử lí mẫu, điều kiện sắc ký, lựa chọn nội chuẩn cho

phép định lượng PAN trong mẫu với độ chính xác thích hợp.
- Thẩm định phương pháp về các chỉ tiêu: Tính chọn lọc - đặc hiệu, đường
chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu
suất chiết, độ ổn định.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo
2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc
- Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn PAN trong methanol (MeOH) để
thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ PAN chính xác khoảng 1000 µg/mL.
- Dung dịch nội chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn lansoprazol trong MeOH để thu
được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1 mg/mL.
2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu đường chuẩn
- Từ dung dịch chuẩn gốc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc
trong huyết tương (CC1 và CC2) có nồng độ PAN lần lượt khoảng 4000 ng/mL và
1000 ng/mL.
- Từ dung dịch nội chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc trong
hỗn hợp MeOH : H2O (1:1) có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/mL.
Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết
tương trắng có pha nội chuẩn (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn PAN và
IS. Tiến hành pha loãng CC1 VÀ CC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu
chuẩn có nồng độ từ 30 – 4000 ng/mL như ở bảng 2.5.


14

Bảng 2.5: Chuẩn bị đường chuẩn
Mẫu

Nồng độ (ng/mL)

VHTtrắng (L)

VCC1 (L)

VCC2 (L)

Blank

-

1000

-

-

Zero

-

1000

-

-

S1

30

970

-

30

S2

100

900

-

100

S3

500

500

-

500

S4

1000

0

-

1000

S5

2000

500

500

-

S6

2500

375

625

-

S7

3000

250

750

-

S8

4000

-

1000

-

2.3.1.3. Chuẩn bị mẫu kiểm tra
Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác có nồng độ PAN chính xác khoảng
1000 µg/mL. Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc (QC1,
QC2) trong huyết tương có nồng độ PAN chính xác khoảng 4000 ng/mL và 1000
ng/mL.
Tiến hành pha loãng QC1 và QC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu
LQC (90 ng/mL), MQC (1800 ng/mL), HQC (3500 ng/mL) như ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Chuẩn bị mẫu kiểm tra
Ký hiệu

LQC

MQC

HQC

Nồng độ (ng/mL)

90

1800

3500

VHT trắng (µL)

910

550

125

VQC1 (µL)

-

450

875

VQC2 (µL)

90

-

-

2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích
2.3.2.1. Xác định điều kiện sắc ký
Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như:


15

- Lựa chọn bước sóng phát hiện
- Lựa chọn cột sắc ký
- Lựa chọn pha động
- Lựa chọn tốc độ dòng
- Lựa chọn chất nội chuẩn
Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến
hành định lượng PAN trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector
DAD.
2.3.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu,
chiết tách PAN từ huyết tương trên các mẫu chuẩn PAN hòa tan trong huyết tương
trắng bằng các phương pháp như:
- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: MeOH,
MeCN, acid perclorid
- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: chloroform, tert butyl methyl
ether.
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.3.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc
Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với 6 mẫu có nguồn

gốc khác nhau và huyết tương trắng có pha chuẩn PAN ở nồng độ 30 ng/mL và IS.
So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn
toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu ( hệ số bất đối ~ 1; độ phân giải (Rs) giữa pic của
chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn 1,5).
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của
từng mẫu phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu phải
gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng [7,8,13,15].
2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính
Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung
dịch có nồng độ như sau: 30 - 100 - 500 - 1000 - 2000 - 2500 - 3000 - 4000 ng/mL.


16

Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Từ đáp ứng pic của
các chất tại các nồng độ, xác định tương quan giữa đáp ứng pic với nồng độ đã pha.
Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Từ phương trình
hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng của mỗi
nồng độ.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm
LLOQ được chấp nhận 80% - 120%.
- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó
LLOQ và ULOQ phải đạt tiêu chuẩn.
- Khoảng tuyến tính: có hệ số tương quan r ≥ 0,98 [7,8,13,15].
2.3.3.3. Giới hạn định lượng dưới
Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL. Dựa theo

đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại
nồng độ của các mẫu vừa khảo sát.
Nồng độ chuẩn thấp nhất được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn điều kiện
sau:
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic trung
bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic trung bình của mẫu trắng.
- Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80% - 120% so với nồng độ thực.
- Độ chính xác CV ≤ 20% [7,8,13,15].
2.3.3.4. Độ đúng
Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương có nồng độ theo bảng 2.6.
Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện. Phân tích các mẫu theo
phương pháp cần đánh giá. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Tính lại nồng độ
các mẫu QC theo đường chuẩn. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so
sánh nồng độ phân tích được so với nồng độ thực đã pha.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ đúng trung bình của
từng lô mẫu phải nằm trong khoảng 85% - 115% nồng độ thực đã pha
[7,8,13,15].
2.3.3.5. Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày( độ chính xác)
Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng. Xác định kết
quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện.


17

Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị các
lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày.
Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị
các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ lặp lại giữa các nồng
độ phân tích được của mỗi lô mẫu có giá trị CV ≤ 15% [7,8,13,15].

2.3.3.6. Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC, HQC trong dịch sinh
học, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 6 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các lô mẫu
QC trong pha động (phân tích định lượng trực tiếp không qua giai đoạn chiết tách).
Tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của
PAN và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học (có qua chiết tách) với đáp
ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách).
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ khác nhau không được quá 15%.
- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC có
qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%.
- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC
không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 5% [7,8,13,15].
2.3.3.7. Độ ổn định

 Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng
Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong
một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ). Phân tích, so sánh nồng độ của dung
dịch nội chuẩn sau bảo quản với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.
Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha
không quá 2%.

 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC trong một
thời gian nhất định (khoảng 6 ngày). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch
chuẩn PAN gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC những khoảng thời gian
nhất định (khoảng 6 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.
Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha
không quá 2%.

18

 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã
Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và
HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35oC ± 5oC và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau
khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12-24 giờ. Lặp lại chu kì
đông - rã 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông - rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ
PAN có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ PAN có trong các mẫu
tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu).
Nồng độ PAN trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban
đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải
nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

 Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn
Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để
ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu
được xử lý ngay sau khi rã đông.
Nồng độ PAN trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định
ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá
trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
* Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài
Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35oC ±
5oC, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo
quản nhất định khoảng sau 30, 53, 68 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết
tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu.
Nồng độ PAN trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai
khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng
ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)
So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong autosampler sau một thời gian xác định (khoảng 25 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay
sau xử lý.
Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai
khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả
định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.