GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HOA
1101190

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO
KHẢ NĂNG TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 182.15
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

LÊ THỊ HOA
1101190

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO
KHẢ NĂNG TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 182.15
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS. TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Cao Văn Thu đã
trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang
giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược
trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên
Quốc gia Hà Nội, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội. Nhân dịp này, tôi
cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo,
cán bộ nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt kiến thức
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại
trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động
viên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.
Do còn hạn chế về thời gian, phương tiện, kinh phí và trình độ của bản
thân, chắc chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận
được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để khóa luận này được
hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, Ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

LÊ THỊ HOA


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................. 2
1.1 Đại cương về kháng sinh ............................................................................. 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ........................................................................ 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh.......................................................................... 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ........................................................ 3
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh............................................................ 3
1.1.5. Giới thiệu về tính kháng kháng sinh ................................................. 4
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh ........................................ 4
1.2

Đại cương về xạ khuẩn ............................................................................ 4

1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. ..................................................... 5
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ............................... 5
1.2.3. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn ................................................. 6
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces ..................... 6
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ...................................... 6
1.3.1. Mục đích ............................................................................................ 6
1.3.2. Chọn giống có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên ....................... 7
1.3.3. Đột biến cải tạo giống ....................................................................... 7
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................. 8
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ............................................................ 8
1.4.1. Khái niệm lên men ............................................................................ 8
1.4.2. Các phương pháp lên men ................................................................. 9
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................. 10
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ................................. 10
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh.................................. 10
1.5.2. Chiết xuất......................................................................................... 11
1.5.3. Tinh chế ........................................................................................... 11


1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ............................................... 12

1.6.1. Phổ tử ngoại – khả kiến ................................................................... 12
1.6.2. Phổ hồng ngoại ................................................................................ 12
1.6.3. Phổ khối MS .................................................................................... 13
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.................................................. 13
1.7. Các nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces trong nước
và trên thế giới................................................................................................. 14
1.7.1. Nghiên cứu kháng sinh kháng nấm mới từ Streptomyces setonii ..... 14
1.7.2. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces
microflavus. .................................................................................................. 15
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ....................................................................... 16
2.1.1. Nguyên vật liệu .................................................................................. 16
2.1.2. Máy móc, thiết bị ............................................................................... 19
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 19
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống ...................................................................... 19
2.2.2. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh ........................................... 19
2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của KS thu được .......... 20
2.3. Phương pháp thực nghiệm ....................................................................... 20
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ........................................................ 20
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán .......... 20
2.3.3. Phương pháp chọn chủng có HTKS cao bằng SLNN ....................... 21
2.3.4. Đột biến bằng tia UV ......................................................................... 22
2.3.5. Đột biến bằng tác nhân hóa học HNO2 .............................................. 23
2.3.6. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ................................................... 23
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ................. 24
2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ............................... 24
2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ........................................... 24


2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng SKLM ....................... 25

2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được ............................... 26
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN . 27
3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ......................................... 27
3.1.1. Kết quả SLNN chủng Streptomyces 182.15 ...................................... 27
3.1.2. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 ........................................... 28
3.1.3. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 ........................................... 29
3.1.4. Kết quả đột biến hóa học cải tạo giống lần 3..................................... 30
3.2. Kết quả chọn chủng lên men .................................................................... 31
3.3. Kết quả sắc ký cột .................................................................................... 31
3.3.1. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 ............................................................ 31
3.3.2. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 ............................................................ 33
3.3.3. Kết quả chạy sắc ký cột lần 3 ............................................................ 34
3.3.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 4 ............................................................ 34
3.4. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ............................................................... 35
3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy ............................................................................ 35
3.4.2. Phổ UV-VIS ....................................................................................... 35
3.4.3. Phổ hồng ngoại .................................................................................. 35
3.4.4. Phổ khối MS ...................................................................................... 36
3.4.5. Phổ cộng hưởng từ NMR ................................................................... 36
BÀN LUẬN .................................................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 39
Kết luận ........................................................................................................ 39
Kiến nghị ..................................................................................................... 40


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

AND

Acid 2’- deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

DM

Dung môi

ĐB

Đột biến

Gr

Gram

Gr(+)

Gram dương

Gr(-)

Gram âm

ISP

Chương trình Streptomyces quốc tế

IR

Hồng ngoại – Infrared

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

KS

Kháng sinh

MC

Mẫu chứng

MS

Phố khối – Mass spectrometry

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

UV

Tử ngoại – Ultraviolet

VSV

Vi sinh vật

B. pumilus

Bacillus pumilus

S. flexneri

Shighella flexneri

̅
𝐷

Đường kính trung bình

S

Sai số chuẩn có hiệu chỉnh

WHO

Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.3: Các dung môi hóa học
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 3 bằng hóa học
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men chìm tốt nhất
Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.7: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng 3.8: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy cột lần 3
Bảng 3.9: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy cột lần 4
Bảng 3.10: Kết quả phổ IR


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình P1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Hình P2: Sơ đồ phân loại xạ khuẩn
Hình P3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

Hình P4: Nuôi cấy giữ giống trên thạch nghiêng
Hình P5: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch
Hình P6: Khuẩn lạc sau đột biến UV
Hình P7: Bình chứa dịch lên men
Hình P8: Chạy sắc ký cột
Hình P9: Phổ UV-VIS
Hình P10: Phổ IR
Hình P11: Phổ MS
Hình P12: Phổ NMR


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ khi kháng sinh được tìm ra và ứng dụng rộng rãi thì đã có rất nhiều căn
bệnh do vi khuẩn gây ra từng được coi là nan y đã được chữa trị thành công.
Nhưng hiện nay kháng kháng sinh đang là vấn đề của toàn cầu, đặc biệt nổi trội
ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Mỗi năm, WHO xác định thế
giới có hàng trăm nghìn người chết do kháng thuốc và phải chi ra hàng tỷ USD
[1]. Điều này là thách thức của các nhà khoa học cần nghiên cứu cải tiến nâng
cao hoạt tính kháng sinh hơn nữa.
Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ, khoa học kỹ thuật, kháng sinh
mới thường được tổng hợp theo 3 hướng chính: tổng hợp hóa học, bán tổng
hợp và sinh tổng hợp.
Vi sinh vật có khả năng tổng hợp kháng sinh rất đa dạng và phong phú có
thể là vi khuẩn, xạ khuẩn hay vi nấm. Trong đó, chi xạ khuẩn Streptomyces có
nhiều loài xạ khuẩn có khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và
khả năng kháng khuẩn hơn cả. Ngoài ra một số loài trong chi này còn tổng hợp
được các chất chữa trị ung thư.
Do đó, tại Bộ môn Vi Sinh – sinh học trường Đại học Dược Hà Nội chúng tôi

lựa chọn đề tài:
“Góp phần nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp kháng sinh từ
Streptomyces 182.15” với những mục tiêu sau:
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
- Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh
- Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn
khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách
chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh,
...) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [8], [14].
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm
của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học…
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho
người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng
sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời
gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác [6],[8],[16].
Sau đây là một số nhóm kháng sinh phân loại theo cấu trúc hóa học: [6],[8],[16].
Bảng 1.1 : Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Nhóm kháng sinh

Kháng sinh cụ thể

- lactam

Penicillin, Cephalexin....

Phenicol

Chloramphenicol...

Aminosid

Streptomycin, Tobramycin..

Macrolid

Erythromycin, Clarithromycin..

Lincosamid

Lincomycin, Lindamycin...

Tetracyclin

Tetracyclin, Doxycyclin...

Peptid

Vancomycin, Polymycin...

Quinolon

Floxacin, Levofloxacin...


3

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trị chính xác hay
các phân tử đích của tế bào VSV, làm biến đổi các phản ứng đó [16].
Có 6 cơ chế tác dụng chủ yếu: [6],[14],[16]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh
Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác như:
- Trong chăn nuôi: dùng kháng sinh trong thú y để chữa bệnh cho động vật:
griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò…. Kháng sinh còn
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí
thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà vịt [8].
- Trong trồng trọt: kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus gây
bệnh cho cây trồng: validamycin dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh
khô vằn hại lúa [8].
- Trong công nghiệp thực phẩm: bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt
VSV trong thực phẩm: subtilin (do B. subtilis tạo ra) [8].

4

1.1.5. Giới thiệu về tính kháng kháng sinh
Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong
một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu [14],
[16].
Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận.
Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng giống VSV nhất định đối với một
số kháng sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính
thấm tế bào, do các enzym vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc
do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác
dụng [14], [16].
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh được giới thiệu ở hình P1 phần
phụ lục [9], [13].
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương có cấu tạo sợi dạng phân
nhánh, có tỷ lệ G+C trên 55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường chứa hàng
triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh. Do có
thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ
khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều [5], [11], [14].
Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng
55-60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều
loại enzym (amylase, cellulose, protease…), cũng như các hợp chất khác [14].
Xạ khuẩn được phân loại theo sơ đồ hình P2 phần phụ lục [5].


5

1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt mà thường có dạng thô ráp,
dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [5], [14].
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3 – 1,0 μm đến 2-3 μm.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết
sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám..[5], [14].
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
- Đặc điểm hình thái:[5], [14], [19]
Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh:
Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào MT nuôi cấy, không phân cắt trong suốt
quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra MT một số loại sắc
tố, có loại tan trong nước, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
Chuỗi bào tử (sợi bào tử): khuẩn ty khí sinh sau một thời gian phát triển trên
đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có rất nhiều hình dạng khác
nhau: thẳng, uốn cong, móc câu, xoắn; phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ
quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn,
xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc.
- Đặc điểm sinh lý: [5], [14], [19]
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển,
chúng phân giải các hydrocacbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng,
đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành
nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của
chúng là 22-32oC, pH tối thích thường là 6,8 – 7,5.
- Khả năng tạo sắc tố: [5], [14], [18]


6

Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc
tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.
1.2.3. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn
Có khá nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên
cứu và phát triển, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, khóa phân
loại của Krassilnhikov (Nga), khóa phân loại của Gauze,… Khóa phân loại
Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (International
Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) đã được sử dụng
rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ
Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được sử
dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc
tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử và khả năng tiêu thụ các nguồn
hydratcarbon [5], [14], [18].
Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kỹ thuật xác định trình tự gen 16s rADN
để phân loại xạ khuẩn đã và đang được áp dụng. Ưu điểm là cho kết quả khá
chính xác, đáng tin cậy [14].
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng
sinh nhất và có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã tìm thấy do
xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% được tổng hợp từ Streptomyces. Một số kháng
sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn được trình bày ở bảng phụ lục 1 [5], [14].
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước,
mô thực vật...) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do
đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo,


7

chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy,
bảo quản thích hợp [9], [13].
1.3.2. Chọn giống có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có HTKS tăng lên 20-30% so với những cá thể khác. Cần
phải chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [9],
[12], [13].
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng
có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột
biến nhân tạo [9], [13], [14].
1.3.3. Đột biến cải tạo giống [9], [12], [13], [14].
Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:
- Tác nhân hóa học: ethylenimin, HNO2, dimethylsulfat, hydroxylamin,…
- Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β.
- Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon,..
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ
giết chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến
gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến làm mất hoặc làm giảm khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh lên mạnh mẽ (đột biến dương).
Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng
đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách đột biến, thời gian và cường độ bức
xạ. Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với các tế bào VSV có
kích thước nhỏ thì tia UV có thể đâm tới vùng nhân. Tia UV có thể làm cho các
base pyrimidin trên cùng 1 mạch của ADN hình thành các cấu trúc dimer T-T,


8

C-C, T-C. Các dimer ảnh hưởng tới sự ghép đôi bổ sung trong sao chép để lại
một vết khuyết trên mạch bổ sung gây ĐB gen.
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV rất cần thiết với mục đích cụ thể là: giữ giống
VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không
bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ [9], [11], [12], [13].
Thông thường có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
- Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang ống
(hoặc lọ) MT mới.
- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng).
- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh).
- Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp).
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ
lạnh 2oC và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [9], [11], [12], [13].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động
của VSV nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và
các hợp chất trung gian cho chúng [5], [8], [12].
Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh học trong bình lên men trong môi
trường dịch thể (lên men chìm) là các hệ thống đảm bảo sinh trưởng, phát triển
của VSV theo 4 pha đặc thù là pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa),
pha cân bằng và pha suy tàn. Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo ra lúc gần kết


9

thúc quá trình sinh trưởng, vào pha cân bằng. Đường cong sinh trưởng phát
triển của xạ khuẩn được trình bày ở hình P3 phần phụ lục [5], [8], [12].
1.4.2. Các phương pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể
rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxy
không khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao
tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có
nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó cơ giới
hóa tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt
trong chọn giống và giữ giống trong phòng thí nghiệm [4], [8], [12].
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển
trong không gian 3 chiều của môi trường. Phương pháp này dùng cho cả VSV
hiếu khí và kị khí. Đối với VSV kị khí trong quá trình lên men không cần sục
khí, còn VSV hiếu khí thì phải vừa khuấy trộn vừa sục khí liên tục. Phương
pháp này có ưu điểm là hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng
triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa. Tuy nhiên
vẫn có nhược điểm là phải có thiết bị chuyên dụng, chi phí đầu tư lớn, đòi hỏi
phải làm trong điều kiện vô trùng tuyệt đối [8], [9], [12].
 Có 4 kiểu lên men chìm như sau: [8], [9], [13]
 Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên
men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo
ra sản phẩm. Kết thúc qua trình, người ta thu lấy sản phẩm.
 Lên men bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm MT dinh
dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng cao
hiệu quả sử dụng bình lên men.


10

 Lên mên bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT

dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà
định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định.
 Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã
phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên
men và đồng thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình.
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [8], [9], [13]
- pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng
trực tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của
enzym hoặc là tác dụng gián tiếp.
- Nhiệt độ: Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng mà
còn ảnh hưởng đến kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất và nhu cầu dinh dưỡng
của VSV. Ở nhiệt độ thấp, VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao VSV bị
chết do biến tính protein và kể cả ARN. Thiết bị lên men cần có bộ phận trao
đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối thích cho VSV.
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi
chất trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tương
thích với tốc độ sử dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm
tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm tàng.
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố
tới quá trình lên men để tìm các điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi nhất
cho sinh tổng hợp chất mong muốn.
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá
trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men


11

thường thấp. Tùy vào đặc tính của loài vi sinh vật mà kháng sinh có thể nằm

trong sinh khối hoăc trong dịch lọc. Vì vậy, để thu được sản phẩm mong muốn
phải lựa chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp [2], [9].
1.5.2. Chiết xuất
Chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác, thường dùng
dung môi hữu cơ (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất
từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào
nhau
Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dịch lên men người ta ứng dụng
phương pháp chiết lỏng – lỏng với các phép chiết: chiết đơn, chiết lặp, chiết
ngược dòng.
Với kháng sinh nội bào: Tiến hành chiết lỏng – rắn. Nguyên tắc của
phương pháp này là dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh vào dung môi chiết
[10], [11].
1.5.3. Tinh chế
Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một
hỗn hợp phức tạp đến một hỗn hợp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách
riêng từng chất. Đối với hỗn hợp đồng nhất, dùng phương pháp chuyển pha,
dùng dung môi thích hợp để chuyển một chất từ pha này sang pha khác.
Phương pháp bao gồm: chiết, thẩm thấu, sắc ký [10], [11].
Quá trình tách sắc ký dùng để tách từng phần ra khỏi hỗn hợp. Dựa trên
sự phân chia khác nhau của các thành phần khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc
và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động. Quá trình sắc ký
trải qua ba giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh
và phát hiện chất cần tách [2], [7], [10],[11].


12

Một số phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp

kháng sinh: [2], [7], [10]
 Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp
phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn hấp phụ.
Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại
lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.
 Sắc ký cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác
nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành màng
phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ)
được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ tử ngoại – khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các điện tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích.
Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ
có mối quan hệ chặt chẽ (ví dụ: những phân tử càng có nhiều liên kết đôi thì sự
hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các
phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O, … có khả năng
hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS [2], [3], [7], [11], [18].
1.6.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của các electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân
tử.


13

Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử.
Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức
[2], [7], [11], [18].
1.6.3. Phổ khối MS

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỉ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các ion tạo thành
trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối.
Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng các pic có cường độ khác
nhau tập hợp thành phổ khối. Phổ khối cung cấp thông tin định tính về khối
lượng phân tử, nhận dạng các chất, xác định cấu trúc và định lượng các chất
[2], [7], [11], [18].
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một kỹ thuật ưu việt trong xác định cấu trúc
các hợp chất hữu cơ, là phương pháp triệt để nhất trong phân tích và biện giải
toàn bộ phổ. Kỹ thuật NMR có thể nghiên cứu nhiều nguyên tử, nhưng hydro
và carbon là phổ biến nhất.
 Nguyên lý:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do
sự phụ thuộc cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số μ của từ trường
biến thiên.
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay
đổi từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của từ trường biến thiên, và xuất
hiện phổ NMR
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có
khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có moment từ và
cho tín hiệu cộng hưởng hạt nhân.


14

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự là số chẵn thì không
có moment từ và không cho tín hiệu NMR.
Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào
mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó.

 Biện giải phổ NMR: Thông qua việc phân tích các yếu tố sau:
Độ chuyển dịch hóa học (vị trí của tín hiệu cộng hưởng): của phổ

1

H-

NMR nằm trong khoảng từ 0-12 ppm.
Tương tác spin-spin: cho biết số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh và mối
tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau. Trong đó người ta quan tâm
tới: Đội bội của tín hiệu cộng hưởng, tỷ lệ cường độ của các vạch tín hiệu,
hằng số tương tác spin-spin.
Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho tín
hiệu.
 Phổ 13C-NMR
Về nguyên lý cũng giống như 1H-NMR nhưng ở đây hạt nhân cho tín hiệu
cộng hưởng là 13C. Thang độ chuyển dịch hóa học từ 0-200ppm [2], [7], [18].

1.7. Các nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces trong
nước và trên thế giới
1.7.1. Nghiên cứu kháng sinh kháng nấm mới từ Streptomyces setonii
Xạ khuẩn được phân loại theo khóa phân loại ISP cho thấy Streptomyces
setonii có các đặc điểm hình thái như chuỗi bào tử thẳng hơi cong, bề mặt bào
tử trơn nhẵn, không sản xuất sắc tố hòa tan, không sản xuất sắc tố melanoid.
Streptomyces setonii có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-34°C, tuy
nhiên nhiệt độ tối ưu là 25-30°C. Streptomyces setonii thủy phân được tinh bột,
có thể hóa lỏng gelatin nhưng không đông sữa. Lên men sinh tổng hợp kháng
sinh được tiến hành trong môi trường (chứa tinh bột 2%, cao nấm men 1%), ở

15

nhiệt độ 30°C trong 1 tuần. Kháng sinh tạo thành được tinh chế và xác định
tính chất lý học, hóa học, sinh học. Kết quả cho thấy: Kháng sinh tan trong
nước, methanol nhưng ít tan trong aceton, chloroform. Kháng sinh có phản ứng
với ninhydrin, KMnO4. Công thức phân tử của KS: C6H11NO2. Nhiệt độ nóng
chảy 195-196°C. Khi tiến hành thử HTKS của KS trên chuột nhận thấy: KS có
tác dụng bảo vệ chuột khỏi nhiễm nấm C.albican tương đương như aphotericin
B và với liều 1g/kg thì không xuất hiện độc tính [17].
1.7.2. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces
microflavus.
Streptomyces 15.29 là xạ khuẩn gốc được phân lập từ đất việt nam. Phân
loại theo ISP và giải trình tự gen 16s rADN chúng tôi đã cơ bản xác định được
Streptomyces 15.29 có tên khoa học là Streptomyces microflavus. Cải tạo
giống qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến ánh sáng UV kết hợp với sàng lọc
sau đột biến đã làm tăng trưởng được hiệu suất tổng hợp kháng sinh của chủng.
Biến chủng Streptomyces 15.29.21.23 là biến chủng tốt nhất hiện tại mà chúng
tôi tạo được. Từ dịch lọc dịch lên men kháng sinh chiết được tốt nhất bằng
etylacetat ở pH 5,0. Kết quả kiểm tra sắc ký TLC cho thấy hỗn hợp kháng sinh
có ít nhất 4 thành phần, trong đó thành phần chính chiếm khoảng 66%. Thành
phần chính đã được phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột silica gel, cột oxyt
nhôm, YMC và cột Sephadex, và có hoạt tính kháng sinh mạnh với giá trị MIC
của từ 0,11 – 0,30 g/ml đối với chủng S. aureus, P. mirabilis, S. flexneri và S.
typhi.[15]


16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng xạ khuẩn Streptomyces 182.15 được phân lập từ
mẫu đất ở Quận 2, thành phố Hồ Chí Minh.
 Giống VSV kiểm định: các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh- Sinh
học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp: Bacillus pumilus ATCC6633,
Shighella flexneri DT112
 Môi trường
 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.
Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần

NaCl

Cao
thịt

Pepton

Thạch

Nước

(g)

(g)

(ml)

MT

(g)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

0

100(vđ)

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,6-1,8

100(vđ)

(g)

pH

7,0-7,4