TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ DUYÊN
Mã sinh viên: 1101089
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG
CAO HOẠT TÍNH TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 184.21
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ DUYÊN
Mã sinh viên: 1101089
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG
CAO HOẠT TÍNH TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 184.21
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh- Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI- 2016
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo,
PGS.TS Cao Văn Thu- người đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu
tiên nghiên cứu khoa học tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên
giảng dạy công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược
trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường
Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô
giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều
kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện khóa luận này.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý
kiến từ thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016.
Sinh viên
NGUYỄN THỊ DUYÊN
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
2
1.1.
Đại cương về kháng sinh
2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
2
1.1.2. Phân loại kháng sinh
2
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh
4
1.2.
Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
4
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước
4
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn
5
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn
6
1.3.
Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
6
1.4.
Cải tạo, bảo quản giống vi sinh vật
7
1.4.1. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn
7
1.4.2. Bảo quản giống
8
1.5.
Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
8
1.5.1. Khái niệm lên men
8
1.5.2. Phương pháp lên men
8
Chiết tách, tinh chế kháng sinh
10
1.6.1. Chiết xuất kháng sinh (chiết lỏng-lỏng)
10
1.6.2. Tách và tinh chế kháng sinh.
10
1.6.
1.7.
Sơ bộ nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
12
1.7.1. Phổ hồng ngoại (IR)
12
1.7.2. Phổ tử ngoại (UV)
12
1.7.3. Phổ khối (MS)
12
1.7.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
12
Một số nghiên cứu liên quan.
13
1.8.
1.8.1. Tìm hiểu bộ gen của Streptomyces ambofaciens.
13
1.8.2. 13-Deoxytetrodecamycin, một kháng sinh mới chống lại
13
Staphylococcus aureus kháng thuốc.
1.8.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm chuyển hóa của
14
Streptomyces AP-123 và hiệu ứng độc tế bào.
1.8.4. Actinomycin X2, chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên
14
men sinh tổng hợp Streptomyces micoflavus
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
2.1.
Nguyên vật liệu, thiết bị
16
2.1.1.
Nguyên vật liệu
16
2.1.2.
Máy móc, thiết bị, dụng cụ
18
2.2.
Nội dung nghiên cứu
19
2.3.
Phương pháp thực nghiệm
19
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống
19
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
19
2.3.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
20
2.3.4.
Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng chọn lọc ngẫu
nhiên
20
2.3.5. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV
21
2.3.6. Phương pháp đột biến hóa học bằng HNO2
22
2.3.7. Phương pháp lên men chìm trên máy lắc
23
2.3.8. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ
23
2.3.9. Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh
23
2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký
24
2.3.11. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết
25
2.3.12. Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu được
25
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
26
3.1.
Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy và VSV kiểm định
26
3.2.
Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
27
3.3.
Kết quả đột biến cải tạo giống
28
3.3.1. Kết quả đột biến UV lần 1
28
3.3.2. Kết quả đột biến UV lần 2
29
3.4.
Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh
30
3.4.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất
30
3.4.2. Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất
31
3.4.3. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh với biến chủng và môi
32
trường tốt nhất.
3.5.
Dung môi và pH chiết xuất.
32
3.6.
Kết quả sắc ký lớp mỏng
33
3.7.
Kết quả sắc ký cột
34
3.7.1. Chạy cột lần 1
34
3.7.2. Chạy cột lần 2
36
3.7.3. Chạy cột lần 3
37
3.8.
Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ
38
các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
42
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ADN
Acid 2’-deoxyribonucleic
B.subtilis
Bacillus subtilis
CW
Cell wall (thành tế bào)
D
Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn
DAP
Diaminopimelat
DMHC
Dung môi hữu cơ
E.coli
Escherichia coli
G(+)
Gram dương
G(-)
Gram âm
IR
Infrared (hồng ngoại)
ISP
International Streptomyces Project
(Chương trình Streptomyces Quốc tế)
KS
Kháng sinh
MS
Mass Spectrometry (phổ khối)
MT
Môi trường
MTdt
Môi trường dịch thể
NMR
Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)
s
Sai số thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
UV
UtraViolet (tử ngoại)
UV-VIS
UtraViolet- Visible (tử ngoại- khả kiến)
V
Thể tích
VK
Vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1.
Các chủng VSV kiểm định.
Bảng 2.2.
Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.3.
Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 3. 1.
Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy và VSV kiểm định
Bảng 3.2.
Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
Bảng 3.3.
Kết quả đột biến UV lần 1.
Bảng 3.4.
Kết quả đột biến UV lần 2.
Bảng 3.5.
Kết quả chọn môi trường lên men
Bảng 3.6.
Kết quả thử hoạt tính dịch lên men của các dạng chủng, biến
chủng.
Bảng 3.7.
Kết quả thử hoạt tính dịch lên men của biến chủng UV2.27
trên môi trường MT2dt.
Bảng 3.8.
Kết quả lựa chọn dung môi chiết dịch lọc
Bảng 3.9.
Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Bảng 3.10.
Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột
lần 1.
Bảng 3.11.
Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 1.
Bảng 3.12.
Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2.
Bảng 3.13.
Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 3.
Bảng 3.14.
So sánh phổ NMR của actinomycin X2 với KS1.
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Nội dung
Tên hình
Hình P1
Dịch lên men thu được
Hình P2
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh.
Hình P3
Kháng sinh tinh khiết
Hình P4
Phổ UV của kháng sinh do Streptomyces 184.21 sinh tổng
hợp.
Hình P5
Phổ IR của kháng sinh do Streptomyces 184.21 sinh tổng
hợp.
Hình P6
Phổ MS của kháng sinh do Streptomyces 184.21 sinh tổng
hợp
Hình P7
Hình P8
Phổ NMR 13C + DEPT của kháng sinh do Streptomyces
184.21 sinh tổng hợp.
Phổ NMR 1H của kháng sinh do Streptomyces 184.21 sinh
tổng hợp.
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1928, khả năng kháng khuẩn của nấm Penicilium notatum được
Alexander Fleming phát hiện ra, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh.
Ngày nay kháng sinh đã và đang được sử dụng rất phổ biến trên toàn thế giới.
Ngoài việc kháng sinh được sử dụng cho người thì kháng sinh cũng được
sử dụng trong chăn nuôi, trồng trọt và công nghệ thực phẩm. Do tình trạng sử
dụng kháng sinh tràn lan và bừa bãi như hiện nay, vấn đề kháng kháng sinh
ngày càng trở nên nghiêm trọng. Vi khuẩn không chỉ kháng một thuốc mà còn
đa kháng kháng đồng thời nhiều loại kháng sinh làm cho việc sử dụng kháng
sinh trở thành khó khăn. Khi kháng sinh trở nên vô dụng, thì con người có nguy
cơ chết vì vi khuẩn nhiều hơn là chết vì ung thư, những căn bệnh thông thường
có thể trở thành những kẻ giết người thầm lặng nếu không có những biện pháp
kịp thời trong trận chiến chống lại các vi khuẩn kháng thuốc. Do đó mà các nhà
khoa học vẫn đang ngày đêm tìm kiếm kháng sinh mới để đưa vào sử dụng,
nâng cao hiệu quả chữa bệnh tuy rằng công cuộc đó còn vô vàn khó khăn.
Để góp phần vào công cuộc tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề tài:
“Góp phần nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp kháng sinh từ
Streptomyces 184.21” với mục tiêu:
Cải tạo giống nâng cao khả năng tổng hợp KS của Streptomyces 184.21.
Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS do Streptomyces 184.21 tổng
hợp.
Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh chế.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.
1.1. Đại cương về kháng sinh.
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Có nhiều định nghĩa khác nhau về KS. Song có thể nêu lên một định nghĩa
được coi là hoàn chỉnh nhất: “ Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận
được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao,
có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật
xác định ( vi khuẩn, nấm, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.” [4].
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách khác nhau để phân loại các kháng sinh: phân loại theo nguồn
gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh bán tổng hợp), theo phổ tác
dụng (phổ rộng hay hẹp), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách tế bào,
tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, thay đổi
tính thấm màng tế bào, ức chế tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học… [3],
[4], [10], [15].
Song cách phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học được sử dụng nhiều
nhất.Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.
Phân loại
1. Kháng sinh có chứa
Nhóm kháng sinh
Kháng sinh cụ thể
Aminoglycosid
Streptomycin, Neomycin
Orthosomycin
Everninomycin
N-glycosid
Streptothrinin
C-glycosid
Vancomycin
đường trong phân tử
3
2. Kháng sinh chứa
vòng
lacton
Glycolipid
Moenomycin
KS macrolid
Erythromycin
lớn KS polyen
(macrocyclic
lacton)
Asamycin
Rifamycin
Macrotetrolid
Tetralactin
Anthracyclin
Adriamycin
3. Quinon và kháng Naphthoquinon
sinh cùng họ
4. Các
kháng
amino
acid
sinh
5. Kháng sinh dị vòng
chứa N
6. Kháng sinh dị vòng
Actinortidin
Benzoquinon
Mitomycin
Các tetracyclin
Tetracyclin, Terramycin
Dẫn xuất amino acid
Cycloserin
KS β-lactam
Penicillin, Cephalosporin
và KS peptid
peptid
Candicidin, Nystatin
Bacitracin, Polymycin
Chromopeptid
Actinomycin
Depsipeptid
Valinomycin
Các KS nucleotid
Polyoxin
Các KS polyether
Monensin
chứa O
7. Các
kháng
nhân thơm
sinh Dẫn xuất benzen
Các ether thơm
Chloramphenicol
Novobiocin
4
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh [4], [10], [16]
Trong y học: Kháng sinh được sử dụng cho người để điều trị các bệnh do
vi khuẩn, nấm gây ra. Ngày nay kháng sinh còn được mở rộng điều trị các bệnh
ung thư, dự phòng trong phẫu thuật và nhiều bệnh khác nữa.
Không chỉ sử dụng kháng sinh trong y học, kháng sinh còn được sử dụng
trong nhiều lĩnh vực khác của đời sống.
+ Trong chăn nuôi
KS được sử dụng để phòng, điều trị các bệnh cho động vật ( viêm phổi cấp,
viêm vú ở trâu bò…). Bên cạnh đó kháng sinh còn được sử dụng như chất kích
thích tăng trưởng cho gia súc, gia cầm giúp giảm chi phí và tăng sản lượng của
vật nuôi.
+ Trong trồng trọt
Việc sử dụng KS để bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả kinh tế cao, giúp cây
trồng chống lại được tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn gây bệnh.
+ Trong công nghiệp thực phẩm
Kháng sinh giúp bảo quản tốt các thực phẩm đóng hộp, giảm thời gian tiệt
trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử trùng giảm xuống làm cho chất lượng sản phẩm
tốt hơn, các chất không bền với nhiệt không bị phá hủy.
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là các
VK G(+), có tỷ lệ G+C >55%. Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại
sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Xạ khuẩn phân bố ở rộng khắp mọi nơi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, bùn, thậm chí cả ở những nơi mà
vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được [5].
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật nhưng chúng phát triển thành dạng sợi.
5
Hệ sợi của xạ khuẩn được chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm
nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng.
- Khuẩn ty khí sinh: có thể phát triển mạnh hoặc yếu, thậm chí hầu như
không phát triển tùy theo từng chi từng loài.
Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn.
Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt, không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà
thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra
theo hình phóng xạ [5], [16].
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào của VK G(+), có một số đặc điểm sau:
Thành tế bào xạ khuẩn: Có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20nm. Có
chức năng bảo vệ tế bào và giữ hình dáng của khuẩn ty.
Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào chia làm 4 loại: Nhóm CW I
(chứa L-DAP ( L-diaminopimelat), glycin), chi Streptomyces thuộc nhóm này;
nhóm CW II (chứa meso-DAP, glycin); nhóm CW III (chứa meso- DAP); nhóm
CW IV (chứa meso- DAP, arabinose và galactose).
Màng tế bào chất: Dày khoảng 7,5-10nm. Thành phần chính là protein
và phospholipid. Chức năng: Là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan trong
nước, là nơi mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp.
Mesosom: Nằm phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng,
hình ống. Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc của tế bào chất, qua đó làm tăng
hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử.
Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất gồm: hạt phosphat, hạt polysacharid
[5], [6].
6
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn
Có khá nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên
cứu phát triển để phân loại các xạ khuẩn, trong đó phải kể đến khóa phân loại
của Waksman, Krassilnhikov, Gauze…
Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế
(ISP) do Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử dụng rộng rãi để phân
loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Trong khóa phân loại này, các đặc
trưng phân loại được sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty
cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử,
khả năng tiêu thụ các loại đường.
Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kĩ thuật xác định trình tự gen để phân
loại xạ khuẩn cũng đã, đang được áp dụng, nhất là ở các phòng thí nghiệm tiên
tiến. Ưu điểm là cho kết quả chính xác, đáng tin cậy. Yếu điểm là làm cho các
nhà nghiên cứu trở nên giấy tờ, xa lạ với các đặc trưng sống của VSV [5], [8].
1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập VSV sinh KS người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác
nhau: Đất ở ruộng, đất ở quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia súc, gia cầm, bùn,
nước ở sông hồ… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh
KS mà ta mong muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các môi trường
chọn lọc (MT1, MT2 đối với xạ khuẩn) [4].
Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:
• Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch [4].
• Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa VSV kiểm định [4].
• Phương pháp làm giàu đất bằng VSV kiểm định [16].
• Phương pháp thêm KS vào trong môi trường phân lập [4].
• Phương pháp phân lập VSV sinh KS chống ung thư [4].
7
1.4. Cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn
VSV tổng hợp KS phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính
thấp. Vì vậy để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh đưa
vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau
và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp.
1.4.1. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn
Mục đích của cải tạo giống:
Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp KS.
Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt hơn, rút
ngắn thời gian lên men, …
VSV chỉ tổng hợp một sản phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
tách chiết và tinh chế.
Sinh tổng hợp được các chất mới với tác dụng mới.
a.
Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên.
Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10 -10 – 10-5 trong ống
giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau. Trong đó có biến chủng có
hoạt tính KS mạnh hơn 20-30% những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể
có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [4], [7], [11].
Đột biến cải tạo giống.
b.
Chọn lọc ngẫu nhiên chưa đáp ứng được yêu cầu nâng cao hiệu suất sản
xuất kháng sinh để áp dụng trong công nghiệp. Vì vậy để thu được các chủng
có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao cần phải dùng đến phương pháp đột
biến nhân tạo.
Các tác nhân đột biến bao gồm:
-
Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hóa khác.
Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ, khoảng
cách chiếu và thời gian chiếu.
8
-
Tác nhân hóa học: Nitrozoguanidin, HNO2, Hydroxylamin,…
-
Tác nhân sinh học: các yếu tố di truyền vận động.
Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải
tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử
như tái tổ hợp cận hữu tính, kỹ thuật tạo và dung hợp TB trần.
Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến, phần lớn các VSV chết.
Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS
tăng (đột biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm). Cần chọn
lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng cao để nghiên cứu tiếp [4],
[7], [11].
1.4.2. Bảo quản giống
Việc bảo quản giống đóng vai trò rất quan trọng. Nếu việc bảo quản giống
không tốt thì tỉ lệ sống sót thấp, không duy trì được các tính trạng tốt đã được
phát hiện.
Các phương pháp bảo quản: Phương pháp bảo quản lạnh, phương pháp lạnh
sâu, phương pháp đông khô, phương pháp cấy truyền giữ giống [5].
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.5.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm
tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành
phần tế bào.
1.5.2. Phương pháp lên men
a.
Lên men bề mặt [4], [7], [11]
9
VSV được nuôi cấy trên bề mặt dịch thể hoặc bán rắn. VSV hấp thu các
chất dinh dưỡng của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT
dinh dưỡng.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp, dễ xử lí cục bộ.
Nhược điểm: Hiệu suất sử dụng thấp, khó giữ vô trùng, khó cơ giới hóa, tự
động hóa, tốn diện tích, nhân công.
Phương pháp lên men chìm [4], [7], [11]
b.
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong MT
lỏng.
Ưu điểm: Hiệu suất quá trình lên men cao; giữ vô trùng, dễ kiểm soát toàn
bộ, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp.
Nhược điểm: Kinh phí cho trang thiết bị lớn ( trang thiết bị chuyên dụng,
chịu áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối), cần cán bộ chuyên môn hóa, có kinh
nghiệm. Không thể xử lý cục bộ.
Các kiểu lên men chìm:
•
Lên men mẻ (gián đoạn): Thể tích MT nuôi cấy không thay đổi trong
suốt quá trình lên men, thu sản phẩm cuối quá trình. Các điều kiện lên men
được đảm bảo, VSV phát triển theo 4 pha: pha tiềm tàng, pha log ( lũy thừa),
pha dừng (pha cân bằng), pha suy tàn.
•
Lên men có bổ sung: Bổ sung MT nuôi cấy trong quá trình lên men, nên
thể tích MT nuôi cấy thay đổi.
•
Lên men liên tục: Liên tục cung cấp chất dinh dưỡng và thu sản phẩm,
nên thể tích MT nuôi cấy không thay đổi có thể coi là cân bằng động. Khi đảm
bảo các điều kiện, VSV sẽ kéo dài pha dừng.
•
Lên men bán liên tục: Định kỳ bổ sung chất dinh dưỡng và định kỳ thu
sản phẩm.
10
1.6. Chiết tách, tinh chế kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc trưng
của loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB. Để thu
được các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách, tinh chế
thích hợp [4].
Một số phương pháp thường dùng [4]:
Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
Phương pháp trao đổi ion.
Phương pháp tạo phức kết tủa.
Phương pháp sắc ký.
Phương pháp chưng cất.
Phương pháp kết tinh.
1.6.1. Chiết xuất kháng sinh (chiết lỏng- lỏng)
Chiết xuất là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi hỗn hợp. Đó là
quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng
và một pha rắn (cân bằng lỏng-rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng-lỏng,
thường một pha là nước) [13], [16].
1.6.2. Tách và tinh chế kháng sinh
Phương pháp sắc ký: là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách
các chất riêng rẽ từ một hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là
mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một
cách liên tục và không hòa lẫn vào nó. Pha tĩnh được cố định trên cột hay bề
mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với
tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ
tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt
11
thành dải trên sắc ký đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng [2],
[13].
Sắc ký lớp mỏng
Ưu điểm chính của kỹ thuật này là thực hiện nhanh, chi phí thấp nên được
sử dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc trong phòng thí nghiệm.
Nguyên tắc:
-
Pha tĩnh: là một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết
dính trên một giá đỡ bằng nhôm, thủy tinh hay chất dẻo. Các hạt trong pha tĩnh
tách theo cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,…
-
Pha động: là một hệ thống dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi. Pha
động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf.
dv
Rf = d
dm
dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
ddm :Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm).
Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng: Xác định trực tiếp chất khi
dùng ánh sáng kích thích; đưa thêm vào các chất phát huỳnh quang và dùng
ánh sáng UV chiếu vào để ghi nhận mẫu hoặc hiện hình bằng các thuốc thử đặc
hiệu: Ninhydrin, VSV, …
Sắc ký cột:
Pha tĩnh: là cột chứa chất nhồi như: Silicagel, cellulose, nhôm oxyd,…
Pha động: dung môi đơn hoặc hỗn hợp, thường sử dụng hỗn hợp dung môi
để làm tăng sức rửa giải. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc
trọng lực.
12
1.7. Sơ bộ nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.7.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại (IR) là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp
thụ bức xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau [2].
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay
đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương
quan giữa nhóm nguyên tử và giải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của
dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải
phổ hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng IR [2].
1.7.2. Phổ tử ngoại
Phổ tử ngoại là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV
vào bước sóng hay số sóng. Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến
đổi năng lượng điện tử của phân tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E0 chuyển
sang trạng thái kích thích E1, E2. Các electron tham gia vào hiệu ứng này có
thể là các electron trong liên kết đơn, liên kết đôi, hệ thống thơm…hay cặp
electron tự do không tham gia liên kết của O, N, các halogen [2].
1.7.3. Phổ khối
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ
bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion
được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành
phổ khối (MS) [2].
1.7.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Hiện tượng một hạt nhân nguyên tử nằm trong từ trường hấp thu hoặc phát
xạ một bức xạ điện từ. Cộng hưởng từ hạt nhân cũng được xem là một nhóm
13
các phương pháp khoa học áp dụng vào việc nghiên cứu các phân tử. Có rất
nhiều hạt nhân được nghiên cứu nhưng hydro và cacbon là phổ biến nhất [21].
1.8. Một số nghiên cứu liên quan
1.8.1. Tìm hiểu bộ gen của Streptomyces ambofaciens [17].
Kể từ khi phát hiện ra các Streptomycin sản xuất bởi Streptomyces griseus
ở giữa thế kỷ trước, các thành viên của chi này đã được sử dụng chủ yếu để sản
xuất các chất chuyển hóa trung gian dùng rộng rãi trong y học và trong nông
nghiệp. Chúng thậm chí còn được công nhận là một trong những VSV sản xuất
nhiều nhất các sản phẩm tự nhiên. Với sự khởi đầu của kỷ nguyên di truyền,
chúng tôi thấy rõ ràng rằng các vi sinh vật vẫn còn là một nguồn quan trọng
cho việc phát hiện ra các chất chuyển hóa trung gian mới. Điều này đã được
nhấn mạnh với trình tự bộ gen hoàn chỉnh của Streptomyces coelicolor A3 (2)
cho thấy một tiềm năng bất ngờ của sinh vật này để tổng hợp các sản phẩm tự
nhiên không được phát hiện bằng phương pháp sàng lọc cổ điển. Kể từ đó, phân
tích trình tự bộ gen từ Streptomyces đã chỉ ra rằng một loài duy nhất có thể thực
hiện hơn 30 cụm gen chuyển hóa thứ cấp, củng cố ý tưởng rằng khả năng sinh
tổng hợp của chi này đang được khai thác đầy đủ. Chúng tôi nhấn mạnh về tiềm
năng của Streptomyces ambofaciens ATCC 23.877 để tổng hợp các sản phẩm
tự nhiên. Tìm hiểu về bộ gen của nó cho phép xác định 23 cụm có khả năng
tham gia vào việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp.
1.8.2.
13-Deoxytetrodecamycin,
một
kháng
sinh
mới
chống
lại
Staphylococcus aureus kháng thuốc [20].
WAC04657 là một chủng Streptomyces sinh kháng sinh chống lại các vi
khuẩn Gram âm và Gram dương đa kháng thuốc. Nuôi cấy chủng xạ khuẩn này
trên môi trường thạch, chúng tôi tìm được 13-deoxytetrodecamycin, một kháng
sinh kháng khuẩn mới. Đây là một trong ít nhất ba hợp chất kháng sinh được
14
tách riêng biệt. Các phân tử có công thức phân tử C18H22O5 liên quan đến các
hợp chất tetrodecamycin phát hiện trước đây. 13-Deoxytetrodecamycin có hoạt
tính sinh học mạnh chống lại các vi khuẩn Gram dương bao gồm cả
Staphylococcus aureus đa kháng.
1.8.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm chuyển hóa của
Streptomyces AP-123 và hiệu ứng độc tế bào [22].
Streptomyces AP-123 có dạng sợi, có nguồn gốc từ khu vực biển của Andra
Pradesh, Ấn Độ. Streptomyces AP-123 có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với
tất cả các VK thử nghiệm so với các chủng Streptomyces khác. Sự có mặt của
glycin và acid L-diaminopimelic trong thành tế bào chỉ ra các chủng thuộc về
chi Streptomyces sp. Giải trình tự gen 16S rADN của Streptomyces AP-123 cho
thấy 13,99% trình tự tương đồng với Streptomyces flavogriseus. Các chất KS
được chiết xuất bằng hexan và ethylacetat. Một hợp chất thu được bằng cách
chiết xuất sử dụng dầu thô với các nồng độ khác nhau của dung môi sau đó
được tinh chế bằng sắc ký. Hợp chất thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao đối
với VK G(+), G(-), đồng thời thực nghiệm cho thấy khả năng gây độc tế bào
mạnh với các dòng tế bào ác tính - tế bào Vero ( thận khỉ xanh ) và HEP2 (tế
bào ung thư thanh quản) trong ống nghiệm. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
của hợp chất chống lại VK B. subtilis và S. aureus tương ứng là 25 và 37,5
μg/mL; chống lại VK E. coli và P. aeruginosa tương ứng là 50 và 37,58 μg/
mL. Với Candida albicans và Aspejjrgillus niger tương ứng các giá trị MIC là
12,5 và 25 μg/ mL.
1.8.4. Actinomycin X2, chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men
sinh tổng hợp Streptomyces micoflavus [9].
Streptomyces là chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc tính kháng sinh, một số loài trong chi
15
này còn có khả năng sinh tổng hợp các kháng sinh chữa ung thư và điều trị
HIV/AIDS. Trong đó các Streptomyces mà phân lập từ cơ chất Việt Nam có
Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn có độ ổn định di truyền học tốt, có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng và có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh
vực phòng bệnh và chữa bệnh. Bằng phương pháp lên men chủng Streptomyces
15.29, từ dịch chiết Ethylacetat của dịch lên men này, đã phân lập và xác định
cấu trúc hóa học của chất kháng sinh thu được là Actinomycin X2. Cấu trúc hóa
học của nó được xác định bằng phương pháp phổ NMR và MS. Bài báo này đã
giới thiệu quá trình phân lập và xác định cấu trúc của kháng sinh Actinomycin
X2 với các dữ liệu phổ NMR 1D và 2D của Actinomycin X2.
16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng xạ khuẩn.
Giống xạ khuẩn Streptomyces 184.21 được phân lập từ mẫu đất tỉnh Tây
Ninh tại bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội.
Giống vi sinh vật kiểm định .
Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược
Hà Nội cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các chủng VSV kiểm định.
Vi khuẩn Gr(+)
Vi khuẩn Gr(-)
Bacillus cereus ATCC 9946
Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 10241
Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Sarcina lutea ATCC 9341
Salmonella typhi DT 220
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112
Các môi trường nuôi cấy.
Gồm MT kiểm định, nuôi cấy xạ khuẩn.
Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần của môi trường được trình bày ở bảng 2.2.