Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
--------

TRẦN THỊ HUẾ
MÃ SINH VIÊN: 1101219

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINHTỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 184.225
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Hà Nội –2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HUẾ
MÃ SINH VIÊN: 1101219

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES184.225
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh & Sinh học
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội

Hà Nội –2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền
đạt những kiến thức quý báu và luôn luôntạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành tốt khóa luận của mình.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi cũng nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt
tình của các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ
môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược nói riêng, trường Đại học Dược
Hà Nội nói chungvà cả bộ môn Hóa Vật liệu – khoa Hóa – Đại học Khoa học Tự
nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội. Tôi chân thành cảm ơn các Thầy Cô.
Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng
hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân
còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tôi rất
mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được
hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Trần Thị Huế


MỤC LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)........................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptpmyces ......................... 2
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn .......................................................... 3
1.1.3. Đặc điể

i

1.1.4.

i

.......................................................................................... 3
i

củ

e

ce .................. 3

1.2. Đại cương về kháng sinh .................................................................................... 3
1.2.1. Đị

ĩ

1.2.2. P â

ại

1.2.3. Cơ c ế
1.3.

i
i

c dụ

.............................................................................. 3
................................................................................. 3

củ

i

.............................................................. 4

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng

sinh.................................................................................................................................4
1.3.1. C c
1.3.2. B
1.4.

ươ
qu

iố

vi i

iố

……………………………………... .............. 4

vậ ....................................................................... 5

Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh ................................................... 6
1.4.1.

i iệ

1.4.2. C c
1.4.3.
1.5.

c i ạ

ê

e ..................................................................................... 6

ươ

ê

ố ếu ố

ư

e ........................................................................ 6
đế qu

ê

e ............................... 7

Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ............................... 7
1.5.1. P ươ
1.5.2. P ươ

c iế xuấ ............................................................................ 8
i

c ế . ............................................................................. 8


1.6.

Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh ...................................... 9
1.6.1. P

ử

1.6.2. P

ồ

1.6.3. P

ại-

ại (IR) ................................................................................... 9

ối ư

1.6.4. P

iế (UV-VIS) ............................................................ 9

c

(

) ............................................................................... 10

ư

ừ ạ

â (N R) ................................................... 10

1.7. Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225............11

1.8. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2. ................................... 11
1.9. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D.........................................12
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 14

2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị .......................................................................... 14
2.1.1. Giố

xạ

2.1.2. Vi i

uẩ .......................................................................................... 14

vậ

iể

đị

................................................................................ 14

2.1.3.

ôi

ườ

uôi cấ V V iể

2.1.4.

ôi

ườ

uôi cấ xạ

đị

.................................................... 14

uẩ .............................................................. 14

2.1.5. Dung môi ..................................................................................................... 15
2.1.6.
2.2.

c

iế

ị ....................................................................................... 16

Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 16
2.2.1. C
2.2.2. ê

c c i ạ
e

iố

c iế

c

.............................................................................. 16
i

2.2.3. Bư c đ u x c đị

c ế

i

............................................. 16

ố

c ấ v cấu

c củ

i

u đư c……………………………………………………………………………16
2.3.

Phương pháp th c nghiệm ........................................................................ 16
2.3.1. P ươ
2.3.2. Đ

uôi cấ
i

ạ

iữ iố
i

.......................................................... 17
ươ

uếc

.. 17


2.3.3. P ươ

c

2.3.4. P ươ

c i ạ v c

2.3.5. P ươ

ê

2.3.6. P ươ

x c đị

i

dịc

2.3.7. C c

ươ

uôi cấ
iố

c

ê

..................................................... 18

ề

Hv đ

ề

........................... 21
iệ đ củ

e . ....................................................................... 21

c iế

cấu

........................ 18

i

đ

u i
x c đị

ườ

e c

c dịc

2.3.8. P ươ
2.3.9. ơ

ôi

c

i

ể

i

c

i

............................................. 22
i

i

iế ............................. 23
iế

u đư c ................ 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN .................................... 24
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ............................................................................. 24
3.2. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1. ..................................................... 24
3.3. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2....................................................... 25
3.4. Kết quả đột biến hóa học ................................................................................. 27
3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm tốt nhất .................................... 28
3.6. Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất ..................................... 288
3.7. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của
kháng sinh trong dịch lọc. ......................................................................................... 29
3.8. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh. ......................... 30
3.9. Kết quả lên men chìm thu dịch lên men ..................................................... 31
3.10. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng..................................... 32
3.10.1. C ạ

ắc

1 ..................................................................................... 32

3.10.2. C ạ

ắc

2 ...................................................................................... 34

3.10.3. C ạ

ắc

3 ....................................................................................... 35

3.10.4. Hiệu uấ qu

c v

i

c ế

i

............................ 36

3.11. Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được ...................... 37
3.11.1. Kháng sinh 2. ......................................................................................... 377

3.11.2. Kháng sinh 1 ........................................................................................... 388
3.12. Bàn luận .............................................................................................................. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................42
PHỤ LỤC .................................................................................................................466


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ADN

Acid 2'- deoxyribonucleic

B.subtilis

Bacillus subtilis

DM

Dung môi

DMHC

Dung môi hữu cơ
Đường kính vòng vô khuẩn

ĐBUV

Đột biến UV

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr(-)

Gram âm

Gr(+)

Gram dương

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

HT

Hình thái

ISP

International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc
tế)

KS

Kháng sinh

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

MC

Mẫu chứng

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

P.mirabilis Proteus mirabilis
s

Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

TB

Tế bào

UV

Ultra violet (tử ngoại)

V

Thể tích


VSV

Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.........................................4
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định.....................................................................14
Bảng 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định..................................................14
Bảng 2.3. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)...............14
Bảng 2.4. Các dung môi đã sử dụng.....................................................................15
Bảng 3.1. Kết quả thử HTKS sau SLNN..............................................................24
Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 1....................................................25
Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 2....................................................26

Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS sau ĐBHH............................................................27
Bảng 3.5. Kết quả chọn môi trƣờng lên men.......................................................28
Bảng 3.6. Kết quả lên men chìm của các dạng và biến chủng trên MT2dt.....29
Bảng 3.7a. Kết quả ảnh hƣởng của pH đến độ bền kháng sinh.........................30
Bảng 3.7b. Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trong
dịch lọc.....................................................................................................................30
Bảng 3.8. Kết quả HTKS pha DM và pha nƣớc ở pH = 7.................................31
Bảng 3.9. Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1...............32
Bảng 3.10. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 1...........................33
Bảng 3.11. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2.....................34
Bảng 3.12. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2...........................35
Bảng 3.13. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 3.....................35
Bảng 3.14. Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3............36
Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của actinomycin X2 (1) và actinomycin D
(1a)...39s


PHỤ LỤC
Hình P.1

Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh

Hình P.2

Hình ảnh khuẩn lạc sau ĐBUV1

Hình P.3

Hình ảnh chạy sắc kí cột lần 1

Hình P.4

Hình ảnh bản mỏng sau chạy SKLM

Hình P.5

Phổ tử ngoại của kháng sinh 1

Hình P.6

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 1

Hình P.7

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 2

Hình P.8

Phổ khối lƣợng của kháng sinh 2

Hình P.9

Phổ khối lƣợng của kháng sinh 1

Hình P.10

Phổ cộng hƣởng từ của kháng sinh 1

Bảng P.11

Kết quả thử HTKS sau SLNN

Bảng P.12

Kết quả thử HTKS sau ĐBUV1

Bảng P.13

Kết quả thử HTKS sau ĐBUV2

Bảng P.14

Kết quả thử HTKS sau ĐBHH


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thực tế thế giới cho thấy nhu cầu đối với kháng sinh ngày một tăng cao. Kể từ
khi được phát hiện tác dụng lần đầu bởiAlexander Fleming năm 1928, kháng sinh
đã làm giảm đáng kể nguy cơ của các bệnh truyền nhiễm, dẫn đến sự gia tăng tuổi
thọ cho những người mắc các bệnh mà nguy cơ tử vong rất cao. Tuy nhiên, bệnh
truyền nhiễm vẫn là nguyên nhân hàng đầu thứ hai dẫn đến tử vong trên toàn thế
giới, riêng bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra khoảng 17 triệu người chết mỗi
năm. Không những thế, tình trạnglạm dụng kháng sinh là một nguyên nhân quan
trọng, góp phần tăng đề kháng, giảm tác dụng của kháng sinh. Từ đây, việc liên tục
nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng sinh mới là vô cùng cấp thiết.
Phần lớn kháng sinh hiện nay là do xạ khuẩn tạo ra và Streptomyces chiếm
khoảng 60%. Đây là một chi xạ khuẩn lớn, được đánh giá cao bởi các nhà khoa học
bởi vì chúng sản xuất một loạt các “chất chuyển hóa thứ cấp", có tác dụng kháng

khuẩn rất cao.
Sau khi nắm bắt rõ được thực trạng này, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài:
“Góp phần lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225” vớicác mục
tiêu sau:
-

Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh.

-

Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, lựa chọn dung môi chiết
xuất tốt nhất, tinh chế kháng sinh.

-

Bước đầu xác định một số đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp
được.


2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.Đại cƣơng về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng trong đất, nước, bùn… và cả cơ chất mà vi khuẩn cũng như nấm mốc không
phát triển được. Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ khuẩn.
Đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân
nhánh, thuộc nhóm VK Gr(+), có tỷ lệ G + C > 55%. Trong số 1000 chi và 5000
loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn[10].

1.1.1.Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces
Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh.
Đường kính của khuẩn ti khoảng 0,2 -1,0µm đến 2-3µm. Đa số khuẩn ti không có
vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc của khuẩn ti xạ khuẩn rất đa dạng : trắng,
vàng, da cam, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen…
Khuẩn ti cơ chất còn có khả năng tiết ra các sắc tố vào môi trường.Khuẩn ti cơ
chất là khuẩn ti cơ bản, phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành
khuẩn ti khí sinh.
Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi
bào tử. Chuỗi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau (thẳng, lượn sóng, xoắn,
mọc đơn, mọc vòng (vòng đơn cấp hoặc hai cấp), các đặc điểm này có ý nghĩa quan
trọng khi định tên xạ khuẩn.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình tròn, bầu dục, hình que,
hình trụ… Bề mặt của bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông.
Khuẩn lạc xạ khuẩn có những đặc điểm riêng biệt: thô ráp, dạng phấn trong
suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [8],[10].


3

1.1.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Cấu tạo tế bào xạ khuẩn chia làm ba phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế
bào chất. Trong đó thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I, có chứa
L-diaminopimelic acid (L–ADP) và glycin, không chứa acid mycolic[8],[19].
1.1.3. Đặc điể

sinh

Streptomyces là sinh vật dị dư ng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển, ch ng
phân giải các hydratcacbon làm ngu n cung cấp vật chất và năng lượng, đ ng thời

thủy phân các hợp chất như gelatin, casein... khử nitrat thành nitrit.Streptomyces là
loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. hiệt độ tối thích là 22- 32oC, pH tối thích thường là
6,8 – 7,5. Ngoài ra chúng còn có khả năng tạo sắc tố: sắc tố hòa tan, sắc tố của
khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid[10],[25],[30].
1.1.4. h năng sinh tổng h p h ng sinh của Strepto

ces

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh
nhất và có cấu tr c phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã tìm thấy do xạ khuẩn
tổng hợp thì có tới 60

được tổng hợp từ Streptomyces[10],[25].

1.2.Đại cƣơng về kháng sinh
1.2.1.Định nghĩa h ng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các ngu n
khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn
lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ...) hay tế
bào ung thư ở n ng độ thấp [17].
1.2.2. Phân oại h ng sinh
a. Dựa vào cấu trúc hóa học.


4

Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.
Nhóm kháng sinh
β – lactam
Fluoroquinolon

Aminoglycosid
Tetracyclin
Macrolid
Polypeptid
Imidazol
Lincosamid
Sulphonamid
Nhóm khác

Ví dụ
Penicillin, cephalosporin,…
Ciprofloxacin, ofloxacin,…
Streptomycin, gentamicin
Tetracyclin, doxycyclin
Erythromycin, clarithromycin, …
Polymycin, vancomycin,...
Metronidazol,…
Lincomycin, clindamycin,..
Cotrimoxazol
Mupirocin

b. Dựa vào nguồn gốc của kháng sinh.
-Kháng sinh có ngu n gốc tự nhiên.
-Kháng sinh có ngu n gốc bán tổng hợp tổng hợp.
-Kháng sinh có ngu n gốc tổng hợp [5],[7].
1.2.3. Cơ chế t c dụng của h ng sinh
Có 5 cơ chế chính:
-

Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: β –lactam, Vancomycin...

-

Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: Polyen, Amphotericin,...

-

Ức chế tổng hợp AD của vi khuẩn : Actinomycin, anzamycin.

-

Ức chế chuyển hóa : Co-trimoxazol,…

-

Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: Macrolid...[8],[33].
Sơ đ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lụcHìnhP.1.

1.3.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh

1.3.1. C c phương ph p c i tạo giống
1.3.1.1. Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên (chọn chủng có hoạt tính cao)
Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh lên 20-30

những cá thể khác.

5

Ch ng ta cần chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống nghiên cứu
tiếp để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất.
1.3.1.2. Đột biến nhân tạo (cải tạo giống)
 Tác nhân gây đột biến:
+ Tác nhân hóa học: Ethylenamin, acid nitrơ (H O2), hydroxyamin,
dimethylsulphat,..
+ Tác nhân vật lý: tia X, tia neutron hay electron và ánh sáng tử ngoại (UV)
tuy khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật có kích thước nhỏ
(0,5-3,0μm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân.
=> Ánh sáng tử ngoại là tác nhân vật lý hay được dùng nhất, khả năng đột biến còn
phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
+ Tác nhân sinh học: Transponson, Bacteriophage Mu,....
 Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hết hầu hết các VSV.

hững cá thể nào còn sống sẽ có sự đột biến gen

làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng
sinh(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên
nhiều lần(đột biến dương).
 Phải sàng lọc, thu lấy biến chủng tốt đem nghiên cứu tiếp. Để tạo ra biến
chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang,
kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính và dung hợp
tế bào trần [5],[10],[41],[42].
1.3.2. B o qu n giống vi sinh vật
-

Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không

bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ.
-

Các phương pháp bảo quản: bảo quản lạnh, làm khô, đông khô, đông lạnh.

-

Trong phòng thí nghiệm thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch

nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kì 3-6 tháng cấy


6

chuyền [2],[7],[9],[18].
Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh

1.4.

h i niệ

1.4.1.

ên

en

ên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
VSV nhờ sự x c tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp

chất trung gian cho ch ng.
Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành l c gần kết th c quá trình sinh
trưởng của xạ khuẩn,gần hoặc vào chính pha cân b ng [10],[17],[23].
1.4.2. C c phương ph p ên

en

Dựa vào thành phần đ ng nhất của môi trường có thể chia làm 2 phương pháp:
1.4.2.1
-

Lên men bề mặt

à quá trình VSV được nuôi cấy trên bề mặt rắn, đặc, lỏng. VSV hấp thu các
chất dinh dư ng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề
mặt môi trường.

=>Yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và không quá sâu (510cm).
-

Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị
ban đầu thấp.

-

hược điểm: hiệu suất sử dụng môi trườngthấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự
động hóa, tốn nhân công [9],[17],[23].

1.4.2.2.
-

Lên men chìm

à phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men bình phản ứng
sinh học, trong điều kiện sinh lý tối thích, VSV phát triển cả 3 chiều.

-

Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.


7

Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ

-

cần chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường.
Các phương pháp lên men chìm: ên men mẻ, lên men bán liên tục, lên men

-

liên tục, lên men có bổ sung[17],[20],[23],[24].
t số ếu tố nh hư ng đến qu tr nh ên

1.4.3.

pH môi trường:

-

en

nh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực

tiếp của các ion H+ hay OH-đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc là
tác dụng gián tiếp.
hiệt độ:

-

hiệt độ không những ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng mà còn

ảnh hưởng đến kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất và nhu cầu dinh dư ng của
VSV.

nhiệt độ thấp, VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao VSV bị chết do

biến tính protein và kể cả AR . Thiết bị lên men cần có bộ phận trao đổi nhiệt hữu
hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối thích cho VSV.
-

Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá v trao đổi chất

trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tương thích với
tốc độ sử dụng oxy của VSV.
hư vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để tìm các điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh
tổng hợp chất mong muốn [17],[20],[23],[24].

1.5.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Với riêng đặc tính của các loài khác nhau mà kháng sinh đó được tiết vào môi

trường nuôi cấy (penicilin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nystatin...).
Vì vậy để thu lấy hoạt chất có độ tinh khiết cao cần chọn phương pháp chiết tách,
tinh chế thích hợp để sản phẩm đạt chất lượng cao, độ bền lâu và gi p hạ giá thành
sản phẩm.
Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:


8

-

Phương pháp chiết b ng dung môi hữu cơ không đ ng tan với nước.

-

Phương pháp tạo phức kết tủa.

-

Phương pháp trao đổi ion.

-

Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột,..).

1.5.1. Phương ph p chiết xuất
à phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình

-

chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai
pha lỏng không đ ng tan (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ).
Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào

-

nhau [21],[22].
+ Kháng sinh ngoại bào t n tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng
chiết lỏng lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng.
+ Kháng sinh nội bào t n tại trong tế bào nên tiến hành chiết lỏng rắn
1.5.2. Phương ph p tinh chế


à một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nh m đi từ một hỗn

hợp phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng
chất.
 Phương pháp bao g m: chiết, thẩm thấu, sắc ký [21],[22].
 Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha
động chạy qua pha tĩnh, phát hiện vết cần tách.
 Nguyên lý tách:
Mẫu phân tích hòa tan trong pha động => đưa lên pha tĩnh 1 cách liên tục và
không hòa lẫn với nó => các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ
tùy thuộc sự tương tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan =>các thành phần sẽ được
tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đ nhờ tốc độ di chuyển khác nhau.

 Một số phương pháp sắc ký thường dùng:
 Sắc ký lớp mỏng:


9

+ Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là
chủ yếu) khác nhau của ch ng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ).
+ Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf:
Rf =

dv
trong đó: dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
d dm

ddm: Khoảng cách dung môi chạy.
Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của
dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
 Sắc ký cột:
+ Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của
các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim
màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nh i vào cột,
pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
+ Quá trình rửa giải được thực hiện b ng cách thêm liên tục một lượng mới
của pha động[1],[2],[3],[10],[21].
1.6.

Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh

1.6.1. Phổ tử ngoại- h

iến (UV-VIS)

à đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng
hay số sóng là phổ tử ngoại.
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn làm thay đổi mức năng lượng của
các electron từ trạng thái cơ bản lên kích thích.
Phổ UV-VIS được sử dụng định tính b ng cách so sánh với phổ của chất
chuẩn đã có sẵn (so sánh vị trí các cực đại, cực tiểu và tỉ lệ mật độ quang giữa các
bước sóng đó), tuy nhiên phổ UV-VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu tr c, thông
thường vẫn sử dụng phổ IR để xác định cấu tr c [3],[6].
1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ bức xạ h ng


10

ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng bức xạ.
Ánh sáng h ng ngoại có năng lượng thấp nên chỉ dẫn đến sự thay đổi các mức
năng lượng và chuyển động quay.
Sử dụng để nhận dạng các nhóm chức đặc biệt trong phân tử và định tính b ng
cách so sánh với phổ chuẩn. Đối với hầu hết các hợp chất dạng của phổ IR là đơn
nhất và đặc trưng trong vùng 1350-750cm-1 được gọi là “vùng vân tay”.

gười ta

thường dựa vào tín hiệu trong vùng này để xác định sự “không” có mặt của một
nhóm chức [1].
1.6.3. Phổ hối ư ng ( S)
Khối phổ khác với các kĩ thuật quang phổ, không sử dụng bức xạ điện từ.

Là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ b ng cách đo chính xác khối
lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Tỷ số này được biểu thị b ng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc b ng Dalton.
Các ion được tạo thành trong bu ng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được
thể hiện b ng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành khối phổ
đ hay phổ khối.

ó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng

các chất) xác định cấu tr c và định lượng các chất[1],[10],[26].
1.6.4. Phổ c ng hư ng từ hạt nhân (N R)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một kỹ thuật ưu việt trong xác định cấu tr c
các hợp chất hữu cơ, là phương pháp triệt để nhất trong phân tích và biện giải toàn
bộ phổ. Kỹ thuật

MR có thể nghiên cứu nhiều nguyên tử, nhưng hydro và carbon

là phổ biến nhất.
 Tiến hành phối hợp các phương pháp trên sẽ gi p xác định cấu tr c hóa học của
kháng sinh đang nghiên cứu.


11

1.7. Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225.
Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces 184.225trên 5 môi trường khác nhau,
sau đó thử HTKS b ng phương pháp đặt khối thạch với 10 VSV kiểm định, thu
được MT2 là MT nuôi cấy bề mặt, lưu giữ chủng và Bacillus subtilis Gr (+),

Proteus mirabilis Gr (-) là 2 VSV kiểm định đại diện cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sau khi cải tạo giống theo phương pháp S

và đột biến, HTKS đã ổn định và

tăng lên đáng kể.Đề tài cũng khảo sát được ở pH=5, KS được chiết kiệt với dung
môi Ethyl acetat và cho HTKS cao nhất.
Tiến hành tinh chế 2 lần với hệ dung môi 3 để loại tạp và hệ dung môi
Ethylacetat: Methanol: n-Hexan (25:1:1) để chạy sắc ký cột thu được 3 kháng sinh
KS1, KS2, KS3. Kháng sinh 2có hiệu suất cao nhất trong số đó (H=17,27 ) được
đem đi đo phổ IR, sơ bộ xác định được một số nhóm chức như amide, alcohols,
phenols, ester, amin, aromatic, ankanes... [14].
1.8. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2.
Chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29 được phân lập tại phòng thí nghiệm Vi
sinh vật học tại Bộ môn Vi sinh và Sinh học, trường Đại học Dược Hà

ội. Tên

khoa học đã được xác định chính xác khi giải trình tự gen 16S AR

là

Streptomyces microflavus.
Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất b ng ethylacetat ở pH 5,0.
Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít nhất 4 thành phần.
Trong đó thành phần chính được tinh chế thu được hiệu suất 66 . Bước đầu các tác
giả đã xác định giá trị MIC của kháng sinh này khá thấp: từ 0,11-0,30 µg/ml đối với
S. aureus, P. mirabilis, S. flexneri, S. typhi.
Tác giả sử dụng phương pháp chiết b ng DMHC ethyl acetat và phân lập b ng
các phương pháp sắc ký kết hợp sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường, pha

đảo, với các hệ dung môi thích hợp thu được chất kháng sinh chính 1 (1,0 g).
Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ, tác giả xác định
được hợp chất 1 là actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ chủng


12

Streptomyces spp. và có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng sinh rất
mạnh [27].
1.9. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D
Một nhóm tác giả tại Brazil thực hiện nghiên cứu với mục đích sản xuất được lượng
lớn nhất actinomycin D từ 3 biến chủng Streptomyces: S. parvulusDAUFPE 3124, S.
felleus DAUFPE 3079, S. regenesis DAUFPE 3053.Môi trường phát triển được sử
dụng giống nhau g m có: tryptone 5 g/l và cao nấm men5 g/l.
S. parvulus ATCC 12434 sinh ra actinomycin, có hoạt tính sinh học lớn nhất
(152mg/l) và chỉ cung cấp actinomycin D. ghiên cứu nh m cải thiện khả năng sản
xuất kháng sinh trong các bình lắc b ng việc thay thế glucose b ng fructose n ng độ
20, 30 và 40g/l. Sự thay thế này làm gia tăng khả năng sản xuất kháng sinh, đạt
n ng độ cao nhất 635mg/l với n ng độ fructose 30g/l. Thí nghiệm trong bình lên
men với các mức cấp khí khác nhau (0,5; 1 và 1,5vvm), tốc độ khuấy khác nhau
(300 và 500 rpm). Môi trường lên men cho thấy hoạt động lưu biến của dung dịch
dạng chất dẻo.
Kết quả cho thấy lượng kháng sinh được sản xuất lớn nhất (1530 mg/l) với vận tốc
cấp khí là 1,5vvm và tốc độ khuấy 500rpm phần lớn sản phẩm thu được từ chủng
S.parvulusDAUFPE 3124 khi nuôi cấy trong trong bình lắc.[35].
Trong một nghiên cứu được công bố bởi nhóm tác giả thuộc Bộ Khoa học và Công
nghiệp của Ấn Độ, b ng phương pháp giải trình tự gen 16S rR A các tác giả đã xác
định được chủng xạ khuẩn mới được phân lập Streptomyces sindenensis có khả
năng sinh tổng hợp actinomycin D. Trong nghiên cứu nhóm tác giả đã tiến hành tối
ưu hóa các điều kiện và thành phần môi trường lên men kết quả thu được từ chủng

ban đầu có hoạt tính kháng sinh 80mg/ l, sau quá trình tối ưu, áp dụng vào lên men
thu được 365 mg/ l sinh khối với tốc độ cấp khí 1.5 vvm, tốc độ khuấy 660 rmp[38],
[40].
Trong một nghiên cứu khác được công bố bởi các tác giả trên tạp trí công nghệ
sinh học Châu Phi, các tác giả đã tiến hành phân lập mẫu đất lấy từ Sudan phân lập


13

chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. Qua quá trình nghiên cứu lên men, tinh chế sản
phẩm thu được được xác định cấu tr c b ng phổ UV, MS,

MR đã xác định được

cấu tr c kháng sinh thu được là actinomycin D. [29]
Sử dụng phương pháp đột biến b ng ánh sáng UV với chủng xạ khuẩn
Streptomyces sindenensis có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D, các tác giả Ấn
Độ đã nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp actinomycin D gấp 400% ( 400 mg/l so với
ban đầu là 80mg/l). Kết quả cho thấy việc sử dụng UV và các tác nhân gây đột biến
vẫn là những tác nhân quan trọng trong việc nâng cao hiệu xuất sinh tổng hợp
kháng sinh từ vi sinh vật [39].


14

CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.

2.1.1. Giống xạ huẩn
Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 đã được
phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh– Sinh học Trường Đại học Dược Hà
ội cung cấp.
2.1.2. Vi sinh vật iể

định

VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà

ội

cung cấp (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định.
Đặc trƣng

Tên VSV kiểm định

Tên viết tắt

VK Gram (+)

Bacillus subtilis ATCC 10241

B. subtilis

VK Gram (-)

Proteus mirabilis BV108

P. mirabilis

2.1.3. Môi trường nuôi cấ VSV iể định
Bảng 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định.
Thành phần

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nƣớc

(g)

(g)

(g)

(g)

(ml)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

0

100(vđ)

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,6-1,8

100(vđ)

MT

2.1.4.

pH

7,0-7,5

ôi trường nuôi cấ xạ huẩn
Bảng 2.3. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml).

Thành phần

MT2

MT5

MT6

Tinh bột

2

2,4

2

1

1

Glucose
Saccarose


15

Bột đậu tương

1,5

Bột ngô
Pepton

0,3

Cao thịt

0,3

KNO3
KCl

0,05

NaNO3

0,2

NH4NO3

0,4

CaCO3

0,2

FeSO4,7H2O
K2HPO4

0,1

MgSO4,7H2O

0,05

NaCl

0,1

Cao nấm men
Thạch
ước
pH

2

2

2

100

100

100

6,8- 7,2

7,0 - 7,2

7,0 - 7,2

 Các môi trường dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như MT nuôi cấy xạ
khuẩn nhưng không có thạch.
Ch

: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định

được tiệt trùng ở 118-120oC trong 30 ph t.
2.1.5. Dung môi
Các dung môi đã sử dụng được giới thiệu trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dung môi đã sử dụng.
Dung môi

Khối lƣợng riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (oC)

Methanol

0,791-0,793

64,50

Ethylacetat

0,789- 0,901

70,40

Ethanol

0,789-0,791

78,30

n- Butanol

0,81

116- 118

Aceton

0,790

56