Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh giống cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. Mor). tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bằng phương pháp in vitro.

HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HẰNG
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH GIỐNG CÂY XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor.) TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI
NGUYÊN BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2011 - 2015

Thái Nguyên - năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH GIỐNG CÂY XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor.) TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI
NGUYÊN BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:
Chuyên ngành:
Khoa:
Lớp:
Khóa học:

Chính quy
Công nghệ sinh học
CNSH - CNTP
K43 - CNSH
2011 - 2015

Giáo viên hƣớng dẫn: 1. PGS. TS. Ngô Xuân Bình
Bộ Khoa học và Công nghệ
2. ThS. Nguyễn Thị Tình
Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

Thái Nguyên - năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông
lâm, Ban chủ nhiệm Khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: thầy giáo Ngô Xuân Bình và cô giáo
Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong quá trình học tập và thực
hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks. Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các bạn trong
phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên,
giúp đỡ tạo điều kiện cả về vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành đề tài này.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai
sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 05 tháng 06 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu Hằng


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng.................................................11
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nuôi cấy mô ...............................................19
Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 1% đến khả
năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen ......21
Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến khả

năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen ......22
Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, ½MS, WPM, B5 đến
khả năng tái sinh chồi Xạ đen ..................................................................23
Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi Xạ đen .............23
Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + KIN đến khả năng nhân chồi ................24
Bảng 3.7: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + TDZ đến khả năng nhân chồi ...............24
Bảng 3.8: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro .... 25
Bảng 3.9: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro... 25
Bảng 3.10: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của
cây Xạ đen ở giai đoạn vườn ươm ...........................................................26
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của NaOCl 1% đến khả năng tạo vật liệu
vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy)....... 29
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu
vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) ........ 30
Bảng 4.3: Ảnh hưởng ảnh hưởng của môi trường MS, ½MS, WPM, B5 đến khả
năng tái sinh chồi Xạ đen (sau 2 tuần nuôi cấy) ......................................31
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen tái sinh từ
đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ...............................................................33
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BA + KIN đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen tái
sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................34
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BA + TDZ đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen tái
sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................36


iii

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro (sau 4
tuần nuôi cấy) ..........................................................................................38
Bảng 4.8: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ
đen in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ...............................................................39

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của cây Xạ đen ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm (sau
4 tuần theo dõi) ........................................................................................41


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cây Xạ đen ..................................................................................................4
Hình 2.2: Cây Xạ vàng ................................................................................................4
Hình 2.3: Lá cây Xạ đen .............................................................................................5
Hình 2.4: Hoa và quả Xạ đen ......................................................................................6
Hình 4.1: Chồi tái sinh từ đoạn thân cây Xạ đen tái sinh trên môi trường (sau 1 tuần
nuôi cấy) .................................................................................................32
Hình 4.2: Chồi cây Xạ đen trong môi trường MS bổ sung các nồng độ BA đến khả
năng nhân chồi của cây Xạ đen (sau 4 tuần nuôi cấy) .............................34
Hình 4.3: Chồi Xạ đen trên môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l với các nồng độ
KIN khác nhau (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................................................35
Hình 4.4: Chồi Xạ đen trên môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l với các nồng độ
TDZ khác nhau (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................................................36
Hình 4.5: Rễ cây Xạ đen trên môi trường MS có bổ sung NAA các nồng độ ..........39
Hình 4.6: Rễ cây Xạ đen trên môi trường MS có bổ sung IBA các nồng độ ...........40
Hình 4.7: Cây Xạ đen trong vườn ươm trên các giá thể ...........................................42


v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
B5:

Gamborg’s

BA:

6- Benzylaminopurin

Cồn:

C2H5OH

Cs:

Cộng sự

CT:

Công thức

CV:

Coefficient of Variation

Đ/C:

Đối chứng

HSN:

Hệ số nhân

KIN:

6- Furfuryaminopurin

LSD:

Least Singnificant Difference Test

MS:

Murashige and Skoog’s

MT:

Môi trường

NAA:

Naphlene axetic acid

Nxb:

Nhà xuất bản

RE:

Robert Ernst

TDZ:

Thidiazuron

TLMC:

Tỉ lệ mẫu chết

TLMSKN:

Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm

TLMSN:

Tỉ lệ mẫu sống nhiễm

WPM:

Wood Plant Medium


vi

MỤC LỤC
Phần 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................2
1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................2
1.4. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây Xạ đen ......................................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................................3

2.1.2. Sự phân bố cây Xạ đen ..................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm hình thái cây Xạ đen ......................................................................4
2.2. Giá trị của cây Xạ đen ..........................................................................................6
2.2.1. Giá trị về kinh tế ............................................................................................6
2.2.2. Giá trị dược liệu .............................................................................................6
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................................7
2.3.1. Cở sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật ..........................................................8
2.3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cây mô tế bào thực vật .............9
2.3.3. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro .............................................14
2.4. Tình hình nhân giống và sử dụng cây Xạ đen ....................................................15
2.5. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen trong và ngoài nước .....................................16
2.5.1. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen trong nước .............................................16
2.5.2. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ngoài nước ............................................18
Phần 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 19
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................19
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................19
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nuôi cấy mô ........................................................19
3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................20
3.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................20


vii

3.5.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng ng NaClO 1%
và HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh cây Xạ đen 20
3.5.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, ½MS,
WPM, B5 đến khả năng tái sinh chồi Xạ đen ........................................................22
3.5.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả
năng nhân chồi từ cây Xạ đen ................................................................................23
3.5.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây

hoàn chỉnh của chồi Xạ đen in vitro ......................................................................24
3.5.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh
trưởng của cây Xạ đen ở giai đoạn vườn ươm ......................................................25
3.6. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................26
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 28
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng bằng NaOCl
1% và HgCl2 1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh cây Xạ đen
(sau 1 tuần nuôi cấy) .................................................................................................28
4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 1% đến khả năng tạo vật
liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) ................... 28
4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng của HgCl2 0,1% đến khả năng tạo
vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) .......... 29
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, ½MS, B5, WPM,
đến khả năng tái sinh chồi Xạ đen (sau 2 tuần nuôi cấy) ..........................................31
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ..........................................32
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi
cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) .........................................33
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với KIN đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ............................34
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................35


viii

4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số Auxin đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh (sau 4 tuần nuôi cấy) .......................................................................................37
4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in
vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) .....................................................................................37

4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in
vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) .....................................................................................39
4.5. Kết quả ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của cây Xạ đen ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm (sau 4 tuần
theo dõi).....................................................................................................................41
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 43
5.1. Kết luận ..............................................................................................................43
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44
I. Tiếng Việt ..............................................................................................................44
II. Tiếng Anh .............................................................................................................45


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) còn được gọi là cây Dót. Xạ đen
thường mọc ở độ cao 1000 -1500 m, phân bố tập trung ở Trung Quốc, Myanmar,
Thái Lan, Việt Nam... Ở nước ta, Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà
Nam, Quảng Ninh, Quảng Bình, Hòa Bình, Vườn Quốc gia Cúc Phương, Vườn
Quốc gia Ba Vì... mọc tự nhiên trong rừng. Theo y học cổ truyền và nghiên cứu lâm
sàng của Lê Thế Trung và cs cây Xạ đen có vị chát, tính hàn, có tác dụng trong giải
độc, tiêu viêm, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng; điều trị mụn nhọt, ung thũng và
ung thư; tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, trong nghiên cứu còn khẳng định Xạ đen
là một trong số ít vị thuốc nam có tác dụng hỗ trợ bệnh nhân ung thư [13].
Trong Xạ đen có một số hợp chất có tác dụng dược lý như: Phylamin,
Fanavolnoid, Quinon có tác dụng phòng chống ung thư làm cho tế bào ung thư hóa
lỏng dễ tiêu; Saponin Triterbenoid có tác dụng chống nhiễm khuẩn, hai hợp chất

Phenolic: acid rosmarinic và methyl rosmarinat có tác dụng ức chế tế bào ung thư
gan [13]. Các hợp chất chiết xuất từ cây Xạ đen kết hợp với các loài dược liệu khác
như: Linh chi, Tam thất, Lược vàng, Thông đỏ, Hồng Sâm,.. tạo nên các chế phẩm
có tác dụng phòng chống ung thư như: Ancan, Kỳ tích, Trà Xạ đen- Tam thất.
Chính vì giá trị dược liệu của Xạ đen dẫn đến tình trạng khai thác quá mức,
do đó số lượng quần thể trong tự nhiên giảm sút nghiêm trọng. Bên cạnh đó
phương pháp nuôi trồng cây Xạ đen chủ yếu hiện nay là giâm hom cho số lượng
cây giống còn hạn chế, mang nhiều bệnh từ cây mẹ [5]. Trong khi phương pháp
nhân giống in vitro-phương pháp nhân giống hiện đại. Quy trình nhân giống đơn
giản hệ số nhân giống cao và các nghiên cứu đều khẳng định không có sự thay đổi
về hình thái và đặc điểm di truyền.
Xuất phát từ thực tế trên, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân
nhanh giống cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) tại Trƣờng Đại học
Nông lâm Thái Nguyên bằng phƣơng pháp in vitro”.


2

1.2. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân nhanh giống cây Xạ đen (Ehretia
asperula Zoll. & Mor.) tại Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên bằng phương
pháp in vitro.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định được hóa chất và thời gian khử trùng mẫu Xạ đen để tạo vật liệu
vô trùng tái sinh in vitro.
- Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh
chồi cây Xạ đen.
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả
năng nhân chồi cây Xạ đen.
- Xác định được ảnh hưởng của một số Auxin đến khả năng ra rễ tạo cây Xạ

đen hoàn chỉnh.
- Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của cây Xạ đen ở giai đoạn vườn ươm.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá được ảnh hưởng của một số chất kích
thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh và ra rễ của cây Xạ đen; góp
phần xây dựng và hoàn thiện kỹ thuật nhân giống cây Xạ đen bằng phương pháp
in vitro.
-Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung cho kĩ thuật nhân giống Xạ đen, nhân
nhanh cây giống sạch bệnh, chất lượng đảm bảo và bảo tồn nguồn gen quý hiếm.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Xạ đen
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Xạ đen là một loại cây thuốc nam quý mọc tự nhiên trong các khu rừng ở
nước ta. Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mort thuộc [14]:
Giới:

Thực vật

Ngành :

Magnoliophyta

Lớp:

Magnoliopsida

Bộ :

Solanales

Họ:

Borraginaceae

Chi:

Ehretia

Theo Hoàng Quỳnh Hoa (2010) dựa trên phân tích 111 số hiệu tiêu bản
thực vật có nguồn gốc từ các phòng tiêu bản trong và ngoài nước và được thu hái
từ thực địa đã phân loại và xác định tên khoa học của các loài trong chi Ehretia P.
Br. ở miền Bắc Việt Nam, bao gồm: E. acuminata R. Br.; E. asperula Zoll. &
Mor.; E. dichotoma Blume; E. dicksonii Hance.; E. laevis Roxb.; E. longiflora
Champ. ex Benth. và E. tsangii Johnst. Trong luận án tác giả Hoàng Quỳnh Hoa
đã kiểm tra về mặt phân loại một loài mang tên “Xạ đen” mọc ở Hòa Bình và
khẳng định tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor. [7], [15].
Trong tự nhiên có 2 loài cùng họ Vòi voi đó là Xạ đen và Xạ vàng, hai loài
này có hình dáng gần giống nhau. Nếu không quan sát kỹ thì sẽ dễ bị nhầm lẫm.
Về mặt y học hiện nay chỉ có cây Xạ đen là có tác dụng chữa bệnh còn Xạ vàng
thì không. Một số đặc điểm khác nhau giữa 2 loài như sau: Xạ đen nhìn bề ngoài
lá có 1 màu Tím Đen, còn Xạ vàng chỉ có 1 màu xanh. Nếu để ý kỹ sẽ thấy lá của
cây Xạ đen có màu đen tím, búp cây cũng màu tím. Còn hình cây Xạ vàng thì

không. Nếu lấy lá của 2 loại cây này vò trên bàn tay Xạ đen sẽ cho ra 1 màu nhựa
đen dính vào tay còn Xạ vàng thì không có. Nếu chặt thân hai loại cây này ra, thân
loại cây nào sau khoảng 5 phút có chuyển sang xỉm đen thì đó mới là cây Xạ đen,
còn không có màu xỉm đen thì đó là Xạ vàng [5].


4

Hình 2.1: Cây Xạ đen

Hình 2.2: Cây Xạ vàng

2.1.2. Sự phân bố cây Xạ đen
Ở nước ta, Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình,
Hòa Bình, Phú Thọ, Vườn Quốc gia Ba Vì,... mọc tự nhiên trong rừng. Xạ đen là một
loại cây thuốc nam mọc tự nhiên trong các khu rừng già của nước ta [5], [7].
Xạ đen là loài cây thích hợp khí hậu nhiệt đới gió mùa, có mùa đông lạnh.
Xạ đen sống được trong môi trường chịu bóng, nó có thể mọc tự nhiên dưới tán
rừng tự nhiên, hoặc được gây trồng dưới tán rừng trồng, dưới tán cây ăn quả. Ngoài
ra, nó cũng có thể sinh trưởng phát triển bình thường trong điều kiện chiếu sáng
hoàn toàn [5].
Xạ đen có thể mọc được trên nhiều loại đất có nguồn gốc đá mẹ khác nhau
(sa thạch, phiến thạch, trầm tích, mắc ma ...). Xạ đen có thể sinh trưởng và phát
triển trên nhiều nhóm đất như: đất dốc tụ, đất feralit, đất đen, đất bạc màu. Có thể
chịu được điều kiện đất nghèo dinh dưỡng nhưng yêu cầu phải thoát nước tốt. Xạ
đen phân bố cả trên núi đá và đồi đất, thường mọc ở các khe dưới chân núi đá nơi
đất ẩm, xốp, thành phần cơ giới thịt trung bình. Đất hơi chua đến trung tính [5].
2.1.3. Đặc điểm hình thái cây Xạ đen
2.1.2.1 Thân, lá
Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn, không lông. Dài

trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi và lá
non có màu tím đỏ [5].


5

Hình 2.3: Lá cây Xạ đen
Lá đơn mọc cách, hình trái xoan dài 10-20 cm, rộng 5-10 cm, trên mặt lá
xanh đậm, mặt dưới lá xanh nhạt, mép lá có răng cưa. Gân mạng lưới hình lông
chim, có một gân chính ở giữa và 10-15 gân phụ. Chiều dài cuống lá biến động
trong khoảng 0,8-1,4 cm [6].
2.1.2.2 Hoa, quả
Xạ đen có hoa, quả và hạt. Xạ đẹn ra hoa trong khoảng thời gian từ tháng
3 tới tháng 5 [5].
Hoa dạng hình xim, mọc cụm ở ngọn (đầu cành) hay nách lá. Tràng hoa
màu trắng, dính liền nhau ở phía dưới, phân 5 cánh ở phía trên, dài 5-10 cm,
đường kính 4-6 cm, có lông mịn. Lá bắc hình dải đến ngọn giáo, dài 3-10 mm.
Hoa nhỏ có cuống dài 1,5-3 mm. Đài hoa màu nâu, cao 1,5-2,5 mm, 5 thuỳ, có
lông mịn. Tràng màu trắng, phần dưới dính liền thành hình phễu, dài 3,5-4 mm,
họng rộng 5 mm, 5 thuỳ hình trứng hay tam giác, dài 2-2,5 mm. Nhị 5, chỉ nhị
dài 3,5-4 mm, đính cách gốc tràng khoảng 1 mm. Bao phấn hình mũi tên, dài
khoảng 1 mm. Bầu gần hình cầu. Vòi nhuỵ dài 3-4 mm, xẻ nhánh dài khoảng 1
mm [5].
Cây ra quả vào khoảng thời gian từ tháng 8 đến tháng 9. Quả chín khoảng
tháng 10 tới tháng 11 [5].
Quả non màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng. Quả nang hình trứng,
dài cỡ 1cm, nổ thành 3 mảnh. Khi chín màu đỏ hay màu cam, đường kính 3-4
mm. Mỗi quả có 4 hạch, mỗi hạch chứa một hạt [5].

6

Hình 2.4: Hoa và quả Xạ đen
2.2. Giá trị của cây Xạ đen
2.2.1. Giá trị về kinh tế
Xạ đen là cây thuốc nam quý mọc tự nhiên trong các khu rừng ở nước ta.
Không chỉ có tác dụng y học, cây Xạ đen còn có giá trị về mặt kinh tế và đây
cũng là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” tăng thu nhập cho người dân ở một số
huyện của tỉnh Hòa Bình. Thị trường tiêu thụ sản phẩm từ cây thuốc nam Xạ đen
rất rộng lớn [5].
Xạ đen có hai cách chế biến: Xạ đen sau khi thu hái về sẽ được phơi khô,
đối với thân, cành sẽ được chặt thành lát mỏng. Giá bán các sản phẩm từ thân,
cành cây Xạ đen khô dao động trung bình từ 120.000-150.000 đồng/kg; còn các
sản phẩm từ lá phơi khô dao động từ 150.000-170.000 đồng/kg. Nấu Cao xạ đen:
Cây xạ đen còn được kết hợp với cây bán chi liên, bạch hoa xà thiệt thảo để nấu
thành cao xạ đen hay cao ung thư [5].
Hiện nay, ở một số địa phương của tỉnh Hòa Bình đang mở rộng phát triển
diện tích vườn trang trại trồng cây Xạ đen. Phát triển mở rộng diện tích trồng Xạ
đen không những nhằm đáp ứng nhu cầu của thị trường cung cấp dược liệu quý
mà còn giảm bớt nạn khai thác, chặt phá bừa bãi cây xạ đen trong nhân dân
các địa phương, bảo tồn phát huy được nguồn gen cây thuốc nam quý [5].
2.2.2. Giá trị dược liệu
Theo y học cổ truyền, cây Xạ đen có vị thơm mát, là vị thuốc đa công dụng
có tác dụng hữu hiệu trong điều trị mụn nhọt, tiêu u thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm
tiết dịch, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể [7], [13]. Trước đây, mế Hậu (cụ Bùi


7

Thị Bẻn, dân tộc Mường, ở huyện Kim Bôi, Hoà Bình, là mẹ của lương y Đinh

Thị Phiển) đã dùng cây Xạ đen để chữa bệnh vô sinh. Nay bà Phiển là người thừa
kế bài thuốc Xạ đen của mế Hậu để chữa bệnh ung thư. Do đó mà cây này còn có
tên là cây ung thư. GS Lê Thế Trung (Viện Quân y 103) đã cho điều tra 14 cây
thuốc Nam mà dân gian cho là có tác dụng trị bệnh ung thư. Năm 1999, Xạ đen
được công nhận là một trong số ít các vị thuốc chữa ung thư [13].
Trong cây Xạ đen có một số hoạt chất quý có tác dụng hạn chế sự phát triển
của khối u, đặc biệt là các khối u ác tính (ung thư). Nghiên cứu cho thấy trong cây
Xạ đen có hoạt chất Fanavolnoid, Quinon có tác dụng phòng chống ung thư và làm
cho tế bào ung thư hóa lỏng dễ tiêu; hợp chất Saponin Triterbenoid có tác dụng
chống nhiễm khuẩn. Đây là một trong một số những hoạt chất rất quý hiếm mà ít
thấy ở các cây thuốc như: Trinh nữ hoàng cung, cây hoàn ngọc hay cây thông đỏ…
Xạ đen có tác dụng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư vòm họng, ung thư dạ dày, ung
thư phổi, ung thư trực tràng và nhiều căn bệnh ung thư khác Xạ đen đề có tác dụng
hỗ trợ điều trị rất hiệu quả. Ngoài tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư cây Xạ đen còn
ứng dụng vào điều trị một số bệnh khác như: cao huyết áp, dùng làm thuốc mát gan
giải độc, hạ men gan; làm thuốc trị viêm, cẩm máu; dùng uống hàng ngày để tăng
cường sức khỏe, phòng chống bệnh tật và ngăn ngừa ung thư [6], [7], [13], [22].
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80
của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính
in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo
quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo… [2].
Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và
đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng
khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được
khoảng 5 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào
khoảng 15% [2].


8

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác
nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây
dược liệu…
Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều
nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ
cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt quy trình
nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây
giống có chất lượng tốt.
2.3.1. Cở sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi
cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [10].
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc
ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận
khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ [10].
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô
và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các
phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích
khác nhau [10].
2.3.1.2 Tính toàn năng của tế bào
Nguyên lý cơ bản của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do nhà sinh lý học thực vật người Đức Gottlieb Haberlandt nêu
ra vào năm 1902 đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật
đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.Theo
quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ
đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn

chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [18].


9

2.3.1.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên
hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau của cơ thể.
Sự phản phân hóa là quá trình ngược lại với quá trình phân hóa tế bào. Sự
chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh trong những điều kiện thích
hợp để thực hiện chức năng phân chia mạnh mẽ và tạo thành cơ thể mới [11].
Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
2.3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cây mô tế bào thực vật
2.3.2.1 Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào
thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ
quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá), các cấu trúc của phôi (lá
mầm, trụ lá mầm), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ) [18].
Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau
trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì
vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của
mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng
nuôi cấy [16].
Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp
phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng
tiêu diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều
kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu
quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt
vi sinh vật của hóa chất. Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô

trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl 2thủy ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) [18].


10

2.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo
điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm.
Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in
vitro [16].
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết
định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng
thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao.
+ Điều kiện phòng nuôi cấy
Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định
về ánh sáng và nhiệt độ [18].
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích
hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [16].
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng
và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Thành
phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu
và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:
a) Nguồn Cacbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh
nhân tạo và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào môi


11

trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông
dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [10].
b) Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
- Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg,
Ca, Na, S [10].
Bảng 2.1: Các nguyên tố đa lƣợng và dạng sử dụng
Nguyên tố
Nitơ

Phospho
Kali

Dạng sử dụng
Thường được sử dụng ở dạng NO 3- hoặc NH4+ , hầu hết các
loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tổng
hợp nên các sản phẩm hữu cơ.
Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có
tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường
Thường dùng ở dạng KNO 3, KH2PO4, KCl.6H2O

Canxi

Sử dụng chủ yếu là CaNO 3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

Magie

Sử dụng chủ yếu là MgSO 4

Lưu huỳnh

Chủ yếu là SO4-

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố
vi lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng
đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế
bào nuôi cấy.
c) Vitamin
Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ
về lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [18].
- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi
trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino
acid [18].


12

- Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng
trao đổi chất [18].
- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [18]
- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào,
tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon [18].
d) Các chất hữu cơ tự nhiên
- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,

đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin… [18].
- Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid [18].
- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [18].
- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh… [18].
e) Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi
trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật.
Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của
chất điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [18].
Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm:
Nhóm chất kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi
cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử
dụng [11].
- Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai
là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch. Sau đó,
nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này.
Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong
phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên
cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực
vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế
đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc
hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì-nơi


13

rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì. Ngoài ra, auxin còn có tác động đến
việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [8].
Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo),
IAA (auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến

mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân
hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy
mô. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ
gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [10].
- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất
đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội
nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu,
dương xỉ, cây lá kim. Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi
khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh.
Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với
auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ
auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin
cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn
dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra, cytokinin còn làm
chậm sự già hóa [8].
Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ
biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả
năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra
có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea… [10].
- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi
các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp
trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có
tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng
cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy.
GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [10].


14

f) pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng
của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong
khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do
mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ.
g) Các thành phần khác
- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số chất
hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn…
Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường agar cũng cung cấp 1 số chất dinh dưỡng
cho tế bào, mô nuôi cấy [18].
2.3.3. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro
Theo Goer (1993) quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước sau [17]:
2.3.3.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ.
Các cây này cần phải sạch bệnh đặc biệt là bệnh vi rút và ở giai đoạn sinh
trưởng mạnh. Việc trồng các cây trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ
chăm sóc và phòng bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu
nhiễm và tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
2.3.3.2 Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt.
Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của, bộ phận lấy
mẫu: chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn
thân, mảnh lá.
2.3.3.3 Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng
thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vấn đề là phải xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có
hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích

15

thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày,
cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy
đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau như nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu
sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phaleanopsis ở giai đoạn đầu cần che tối.
2.3.3.4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin.
Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh
giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Theo
Murashige, giai đoạn này là giai đoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi để sau đó có
thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên. Tạo rễ cho chồi là một phần
rất quan trọng của bất kì quy trình nhân giống in vitro nào. Đôi khi một số chồi
cần kéo dài trước khi tạo rễ. Để giảm chi phí nhân giống, nhiều phòng thí nghiệm
chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro và tạo rễ ở bên ngoài bình nuôi cấy.
2.3.3.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng
như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
2.4. Tình hình nhân giống và sử dụng cây Xạ đen
Theo kết quả khảo sát ở một số vùng của tỉnh Hòa Bình đã trồng xen lẫn các
loại cây bản địa với Xạ đen như: cây trầm Aquilaria, cây sấu, cây trám trắng... Xạ đen
không đòi hỏi tốn công sức chăm bón, không yêu cầu kỹ thuật cao và nhiều diện tích
đất. Việc trồng xen dưới tán cây rừng và cây ăn quả sẽ làm tăng thêm giá trị thu trên
một đơn vị diện tích đất.

Tình hình trồng Xạ đen hiện nay ở nhiều nơi cây Xạ đen trong tự nhiên bị
chặt phá, khai thác rất bừa bãi bởi người dân tại các địa phương. Hầu hết xạ đen