tiểu luận phương pháp nghiên cứu khoa học

bộ giáo dục và đào tạo
trờng đại học s phạm hà nội ii
*****************
Đào thị ngọc anh
Bài tiểu luận phơng pháp nghiên cứu khoa học
" đề cơng luận văn thạc sĩ "
Tên đề tài: tìm hiểu khả năng tái sinh cây ngô từ phôi non và
noãn cha thụ tinh của một số dòng ngô bằng phơng pháp nuôi
cấy mô tế bào
Chuyên ngành đào tạo: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
hà nội - 2008
1
1. lý do chọn đề tài
1.1. Ngô là cây lơng thực giàu dinh dỡng; các sản phẩm từ ngô có nhiều ứng dụng trong thực
tiễn: sản xuất bánh kẹo, đờng, sợi tổng hợp, xà phòng, sơn keo chất dẻo, chất cách điện, thuốc
chữa bệnh...
1.2. Xuất phát từ thực trạng của việc lấy hạt là giống theo phơng pháp cổ truyền có nhiều
điểm gây lãng phí: mỗi hạt chỉ phát triển thành một cây, còn những hạt không đủ khả năng
nảy mầm thì hỏng. Do vậy, đã gây tổn thất lớn cho ngời nông dân nói riêng và cho ngành
nông nghiệp nói chung.
1.3. Xuất phát từ thực tế của việc nuôi cấy mô trên thực vật trong những năm gần đây đã đem
lại nhiều lợi ích to lớn trong việc tạo ra các cây giống chỉ từ mảnh mô thực vật: nhóm tế bào
sinh dỡng; mô phân sinh hoặc bao phấn và noãn trong môi trờng nuôi cấy thích hợp để phát
triển thành cây hoản chỉnh chỉ từ một tế bào.
Nh vậy, đã hạn chế đợc những lãng phí trong việc tạo cây ngô giống từ hạt theo phơng
pháp truyền thống. Đồng thời tạo ra đợc những cây giống sạch bệnh. Xuất phát từ những lí do
trên và căn cứ vào đặc điểm u thế của phơng pháp nuôi cấy mô chúng tôi đã chọn đề tài: "Tìm
hiểu khả năng tái sinh cây ngô từ phôi non và noãn cha thụ tinh của một số dòng ngô bằng
phơng pháp nuôi cấy mô".
2. Mục đích nghiên cứu

+ Nghiên cứu khả năng thích nghi của giống ngô trên các môi trờng nuôi cấy khác
nhau. Nhằm xác định đợc khả năng tạo callus, embryo và tái sinh cây của noãn ngô cha thụ
tinh trong những loại môi trờng nào là tốt nhất.
+ Nghiên cứu sự hình thành callus và tái sinh của noãn đã thụ tinh và phôi non trong
giai đoạn phôi sớm ( 3 - 4 ngày sau thụ tinh); trong giai đoạn 14 - 24 ngày sau thụ tinh.
Để xác định đợc phôi non ở giai đoạn nào có khả năng tái tạo tốt nhất, khắc phục khả
năng già về mặt sinh lý của chồi cây ngô trong môi trờng nuôi cấy, tức là cây ngô trổ cờ ngay
trong ống nghiệm.
3. Đối tợng nghiên cứu
3.1 Đối tợng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 10 giống ngô bao gồm: LVN5, LVN8, LVN10,
LVN9, LVN4, SW2, CV1, D1, D2, D3. Các giống ngô đem nghiên cứu đợc tạo ra từ Viện Di
Truyền Nông Nghiệp, giống nhập nội từ Nhật Bản và từ Trung tâm ngô mì thế giới
(CYMMY). Chúng có đặc điểm chung là phát triển tốt trong điều kiện bình thờng, đã đợc
gieo trồng đại trà, thích hợp với khí hậu miền Bắc Việt Nam.
2
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Dùng phôi non và noãn cha thụ tinh.
4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu xác định khả năng tạo callus, embryo và tái sinh cây ngô
từ phôi non và noãn cha thụ tinh trong loại môi trờng nuôi cấy nào là thích nghi nhất.
5. Phơng pháp nghiên cứu
5.1 Phơng pháp nghiên cứu lý thuyết
Nghiên cứu xác định cơ sở lý thuyết của đề tài: các tài liệu về nuôi cấy mô, thông tin
từ trang web những t liệu về nuôi cấy mô về ngô trên thế giới và ở Việt Nam; những thành tựu
đã đạt đợc về nuôi cấy mô trên cây ngô. Trên cơ sở của mục đích là tạo ra những giống ngô
tốt, những giống sạch bệnh, đồng đều về di truyền giữ nguyên đặc tính tốt của cây mẹ ban
đầu.
5.2 Phơng pháp tiến hành thực nghiệm
5.2.1 Xác định thành phần của môi trờng nuôi cấy

- Các nguyên tố đa lợng
- Các nguyên tố vi lợng
- Nguồn Cacbon
- Các vitamin
- Các chất tự nhiên
- Các chất điều tiết sinh trởng
- Chất làm đông cứng môi trờng - Agar
- Độ pH của môi trờng.
5.2.2 Môi trờng nuôi cấy noãn và phôi non của ngô
Vì ngô là cây thuộc họ hoà thảo nên môi trơng thích hợp chủ yếu cho nuôi cấy mô ở ngô đó
là môi trờng cơ bản(MS) và môi trờng Chu(N6).
Bảng 1: Thành phần môi trờng dùng trong nuôi cấy mô
của noãn và phôi non của ngô
Thành phần (mg/l) MS N6 Thành phần (mg/l) MS N6
Các nguyên tố đa lợng Các chất hữu cơ và vitamin
KNO
3
1900 2830 Glyxin 2,0 2,0
KH
2
PO
4
170 - Thiamin.HCl 0,4 1,0
MgSO
4
.7H
2
O 370 90,35 Mio - Inositol 100 100
CaCl
2

.2H
2
O 440 125,3 Pyridoxin.HCl 0,5 0,5
Các nguyên tố vi lợng
Nicotinic axit 0,5 0,5
3
H
3
PO
4
6,2 1,6
Chất điều hoà sinh trởng
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 - Edamin 1000 -
FeSO
4
.H
2
O 27,8 27,8 Đờng saccaroza 30000 20000
NaEDTA.2H
2
O 37,3 37,3 UYK 2,0 -
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 - Kinetin 0,2 -

CuSO
4
.5H
2
O 0,025 - Agar 8,0 8,0
ZnSO
4
.7H
2
O 8,6 1,5 pH 5,6 5,8
Na
2
MO
4
.2H
2
O 0,25 -
KI 0,83 0,8
5.2.3 Các bớc tiến hành
+ Chọn mẫu và xử lý mẫu: Các giống ngô đem nghiên cứu đợc bố trí thí nghiệm trồng ngoài
đồng ruộng sau đó thu mẫu và nuôi cấy trong ống nghiệm. Các dòng đợc bối trí theo hàng,
mỗi giống gieo thành 3 hàng. Mỗi hàng gieo cách nhau 3 ngày tránh hiện tợng hạt phấn trên
các cây chín cùng một lúc.
- Chọn những noãn to đều khi râu phun đợc 5 - 7cm, bóc vỏ ngoài của noãn, cắt đoạn khoảng
2-2,5cm, rửa sạch bằng cồn etanol 70
o
C. Sau đó đa vào buồng vô trùng, dùng H
2
O
2

10% để
diệt trùng trong khoảng thời gian vài phút.
- Chọn những phôi non của noãn đã thụ tinh đợc 3 - 4 ngày cắt đoạn có kích thớc 2-3mm,
phôi non của noãn đã thụ tinh 14 - 24 ngày cắt đoạn 0,5 - 2mm. Cũng làm sạch thao tác nh
trên. Nhằm tạo giống sạch bệnh.
+ Môi trờng nuôi cấy: Môi trờng nuôi cấy đợc sử dụng là môi trờng khoáng MS và môi trờng
N6.
+ Môi trờng tái sinh: Sau khi nuôi cấy các callus hình thành đem chuyển sang môi trờng tái
sinh.
+ Môi trờng ra rễ: Sau khi cây đợc tái sinh đa ra môi trờng ra rễ. Đó là môi trờng MS bổ sung
thêm 1mg/1NAA.
+ Điều kiện nuôi cấy:
Nhiệt độ 26
o
C trong tối với thời gian 2 - 4 tuần
ánh sáng: 2000 - 3000 lux với thời gian chiếu sáng 14/24h.
Độ ẩm bình thờng
Trớc khi chuyển cây ra vờn ơm chúng tôi chuyển các bình ra nhiệt độ bình thờng bên
ngoài, để ở mái hiên nơi có mái che hoặc phủ cót. Tránh ánh nắng trực tiếp mục đích để cây
quen dần với nhiệt độ ngoài trời trong thời gian 1-2 tuần tuỳ thuộc vào độ cứng của cây.
4
Sơ đồ tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô trên một số dòng ngô
5.3 Phơng pháp thống kê toán học
Kết quả thu đợc đem khảo sát, thống kê, phân tích và đối chiếu kết quả giữa các giống
trong môi trờng thực nghiệm và giống đối chứng để làm rõ hiệu quả của việc tạo cây giống
bằng phơng pháp nuôi cấy mô. Xác định giống nào thích nghi với môi trờng nuôi cấy nào và
cho kết quả tạo cây giống đảm bảo năng suất nh thế nào.
6. Những đóng góp mới của luận văn
Xác định đợc quy trình và kỹ thuật tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô của một số dòng
ngô.

Xác định đợc môi trờng nuôi cấy thích nghi với từng thời kỳ của noãn và phôi non của
một số dòng ngô.
Vận dụng vào quy trình sản xuất tạo ngô giống bằng phơng pháp nuôi cấy mô.
7. Triển vọng và kết quả của đề tài
Một trong những vấn đề khó khăn trong thực tiễn hiện nay là làm thế nào để tạo đợc
giống ngô cho năng suất cao và phẩm chất tốt mà không lãng phí hạt để làm giống. Chính vì
vậy, những kết quả nghiên cứu về lý luận và thực tiễn của đề tài góp phần giải quyết hiệu quả
vấn đề khó khăn trên.
8. Nơi thực hiện đề tài
- Phòng nuôi cấy mô của Viện Di truyền Nông nghiệp
- Vờn thực nghiệm khoa Sinh - Trờng ĐHSP Hà Nội II...
9. Dự kiến kết quả nghiên cứu
9.1 Khả năng tạo callus, embryo và tái sinh cây của noãn cha thụ tinh
9.1.1 ảnh hởng của môi trờng nuôi cấy đối với các giống khác nhau trong quá trình tạo
callus
5