Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------------

HỒ VĂN HOÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN
SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG
VEN BIỂN VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2013
i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ........................................... Error! Bookmark not defined.
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................ Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC HÌNH VẼ .................................. Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về xạ khuẩn .......................................................................... 3
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ............................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .................................................... 3
1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn .................................................... 6
1.2. Phân loại xạ khuẩn ................................................................................. 7
1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .............. 7

1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) ................................... 8
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................. 8
1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy) .............................................. 9
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16SrDNA ......................................................................................................... 9
1.3. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển.................................................. 10
1.3.1. Nhóm chất kháng sinh polyketide ................................................. 10
1.3.2. Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide..................................... 11
1.3.3. Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide ... 12
1.3.4. Nhóm kháng sinh isoprenoid......................................................... 12
1.3.5. Các chất kháng sinh khác ............................................................. 13
1.4. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ........................................... 15
1.4.1. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ........................... 15
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ
khuẩn ....................................................................................................... 16
1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ....................... 17
1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong
nước ......................................................................................................... 17
1.5.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới
................................................................................................................. 18
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21
2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu ........................................ 21
2.1.1. Vật liệu .......................................................................................... 21
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ....................................................................... 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 22

ii


2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................... 22
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong

mẫu .......................................................................................................... 22
2.2.3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh .............................. 23
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn ........... 24
2.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ............ 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 29
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh ..... 29
3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn ........................................ 32
3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy......................................................................... 32
3.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 34
3.3. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa................................................................... 35
3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn nitơ ....................................................... 35
3.3.2. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon ............................................... 36
3.3.3. Khả năng chịu muối NaCl ............................................................. 38
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng ...................... 38
3.3.5. Ảnh hưởng của độ pH ................................................................... 39
3.4. Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ........................ 40
3.4.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa ............... 40
3.4.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân
tử.............................................................................................................. 43
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men ........................................................... 48
3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ ............................... 49
3.5.3. Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí ......................... 51
3.6. Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu ............... 52
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 53
KẾT LUẬN ................................................................................................. 53
ĐỀ NGHỊ..................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 54
PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN .. Error! Bookmark not
defined.
PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI..... Error!

Bookmark not defined.
PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH..... Error! Bookmark not defined.
PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA Error! Bookmark not
defined.

iii


MỞ ĐẦU
Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 và 3.260 km bờ
biển (không tính các đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nƣớc ta
tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật. Với mong muốn
khám phá, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú của biển, nhiều
nghiên cứu khoa học gần đây, nhất là công nghệ sản xuất sinh học đã chuyển dần từ
khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng và đƣa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ những
vùng nƣớc ngập mặn, biển xa bờ, thậm chí cả đáy biển sâu để sinh trƣởng bền vững
dựa trên cơ sở của các công nghệ mới.
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rất rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn đƣợc quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả
năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng. Trong số hơn 8000 chất kháng
sinh hiện đã đƣợc biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ
yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora. Giai đoạn những năm 1980 trở
về trƣớc các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩn
trên mặt đất. Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng
xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý nhƣ: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ
kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thƣ… có ý nghĩa ứng dụng trong y học
[1].
Cùng với sự sinh trƣởng của công nghệ sinh học hiện đại, các nghiên cứu về
ứng dụng xạ khuẩn biển đã thu đƣợc rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh
khối, dƣợc phẩm… đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp, y dƣợc học, nông

nghiệp… Trong lĩnh vực y dƣợc, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn trong đời
sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật và nâng cao sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, việc
lạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến hiện tƣợng nhờn thuốc làm ảnh hƣởng đến
kết quả điều trị bệnh. Việc tìm ra các chất kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn
cao từ các nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết hiện nay.
Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng rất

1


quan trọng, các nghiên cứu cơ bản này giúp định hƣớng sản xuất các sản phẩm hữu
ích từ các chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá sự đa dạng của các vi sinh vật
biển.
Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt
Nam”.
Mục tiêu:
Tuyển chọn và phân loại các chủng xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợp
kháng sinh cao định hƣớng ứng dụng trong y dƣợc.
Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nƣớc, bùn ở các vùng
biển Bắc, Trung, Nam.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn.
- Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phƣơng pháp giải trình tự gene
16S-rRNA
- Nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn
tuyển chọn trong phòng thí nghiệm.

2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về xạ khuẩn
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố
rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nƣớc, một phần trong bùn và trong các chất
hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trƣởng
đƣợc.
Số lƣợng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ
thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh
dƣỡng và lớp đất bề mặt thƣờng có số lƣợng lớn xạ khuẩn. Trong 1 gam đất canh
tác có thể phân lập đƣợc 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn
mầm. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [7].
Xạ khuẩn cũng thƣờng sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơm rạ)
nhƣng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc rễ cây.
Xạ khuẩn biển thƣờng đƣợc phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích
biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật khác nhƣ san hô, rong biển.
Trƣớc đó, ngƣời ta tin rằng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ trên cạn. Tuy nhiên, sau
đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển.
Xạ khuẩn biển thƣờng có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng
Streptomyces ssp. có thể sinh trƣởng đƣợc ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc
chi Streptomyces và Nocardia sinh trƣởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%,
Micromonospora sp. và Salinospora sp. cũng có khả năng chịu mặn cao [24, 25].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
Ở trên môi trƣờng đặc, xạ khuẩn sinh trƣởng thành những khuẩn lạc khô,
kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc xạ
khuẩn không trơn, ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, có các
nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes,

3

tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da,
dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có 3
lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tƣơng đối xốp và lớp giữa có cấu
trúc tổ ong. Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy
thuộc vào loài và điều kiện dinh dƣỡng.
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhƣng lại là cơ thể
đơn bào, không có nhân thực và kích thƣớc giống vi khuẩn. Trên môi trƣờng đặc, hệ
sợi của xạ khuẩn sinh trƣởng thành 2 hƣớng tạo thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti
khí sinh. Khuẩn ti cơ chất sinh trƣởng cắm sâu vào trong môi trƣờng với chức năng
chủ yếu là lấy nƣớc và thức ăn. Khuẩn ti cơ chất sinh trƣởng một thời gian thì dài ra
trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh. Ngƣời ta gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn
ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp là loại khuẩn ti sinh trƣởng từ các loại
bào tử nảy mầm [4]. Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti khí
sinh, nhƣng cũng có loại nhƣ chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh. Khi đó
khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản.
Khuẩn ti của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc, đƣờng kính thay đổi
trong khoảng 0,2 – 1 m đến 2 – 3 m. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có vách
ngăn và không tự đứt đoạn. Sau một thời gian sinh trƣởng, ở đầu các khuẩn ti khí
sinh thƣờng hình thành các sợi bào tử. Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung là
khuẩn ti dinh dƣỡng.
Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lƣới dày khoảng 10 – 20 nm,
có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ti và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu hóa
học ngƣời ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:
- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có
Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides.
- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có
Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella.
- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP. Gồm các chi Dermatophilus,

Geodermatophilus,

Frankia,

Actinomadura,

4

Nocardiopsis,

Microbispora,


Thermoactinomyces,

Thermomonospora,

Planomonospora,

Planobispora,

Streptosporangium, Actinosynnema.
- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose. Gồm các chi
Nocaridia,

Oerskovia,

Promicromonospora,

Pseudonocardia,

Rhodococcus,

Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [4].
Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dầy 60 – 120 Å, khi già
có thể dầy tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50 Å và lớp trong dầy 50 Å. Thành tế
bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptid gồm các gốc N-acetylglucozamin liên
kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glicozit. Khi xử lí bằng lysozym, các liên
kết này bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng nguyên sinh chất bao bọc phần
còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần. Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lí bằng hỗn
hợp ether và chloroform và các dung môi hòa tan lipit. Điều đó chứng tỏ lớp ngoài
thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa
cellulose hay chitin [7].
Đối với xạ khuẩn phân lập từ các vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy
và độ bền cơ học cao, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trƣờng (nồng
độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC). Thành tế
bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều axit polyme
nhƣ axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic và axit phosphoric. Với điện tích
âm của các thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào có thể
hấp thụ các ion Na+, H+ trong khi đẩy các ion OH-. Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp
peptidoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhƣng lại khác
nhau về thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ƣa kiềm chứa nhiều hesoamin và
axit amin [20].
Màng sinh chất của xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ
yếu là phospholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tƣơng tự nhƣ màng
sinh chất của vi khuẩn. Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quá
trình vận chuyển các chất qua màng [4].

5

Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và có
hình phiến, hình bọng hay hình ống. Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diện
tích tiếp xúc của màng tế bào và từ đó làm tăng cƣờng hoạt tính của enzyme, tăng
chuyển điện tử…[4].
Các thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphosphat
(hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) và polysaccarit (bắt màu với dung
dịch Lugol) [4].
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đặc biệt khác với những vi sinh
vật nhân sơ khác là tỉ lệ G – C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45%.
Một trong những đặc điểm đáng lƣu ý của xạ khuẩn là chúng không bền
vững về di truyền và thƣờng xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA. Điều này tạo ra
tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng. Hơn nữa, sự
tự nhân lên của các đoạn DNA còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở
xạ khuẩn [7].
1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn là dựa vào hình
thái và kích thƣớc của cuống sinh bào tử. Sợi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác
nhau tùy theo loài: thẳng-lƣợn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) hoặc có móc,
vòng (Retinaculiaperti)… có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp. Một
số xạ khuẩn có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang. Bề mặt của bào
tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)…
tùy thuộc vào loài xạ khuẩn [4, 5, 13].
Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành theo 3 phƣơng thức sau đây:
- Phƣơng thức sinh trƣởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ti
hình thành ra thành bào tử.
- Phƣơng thức sinh trƣởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa
màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ti. Trƣờng hợp này gặp ở Planomonospora.

6

- Phƣơng thức sinh trƣởng bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ti không tham
gia vào quá trình hình thành bào tử. Trƣờng hợp này gặp ở Thermoactinomycetes
[4].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trƣớc hết phải kích thích hình thành
khuẩn ti khí sinh. Nhiều tài liệu đã đề cập đến mối quan hệ giữa sự hình thành bào
tử và môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng trong nuôi cấy xạ khuẩn. Một số tác giả còn cho
rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trƣờng cũng kích thích sự hình thành
bào tử ở xạ khuẩn. Tuy nhiên, việc bổ sung các nguyên tố vào môi trƣờng phải đƣợc
nghiên cứu kĩ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định. Nếu môi trƣờng giàu dinh dƣỡng
thì quá trình hình thành bào tử thƣờng sẽ bị kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ cũng ảnh
hƣởng đến sự hình thành bào tử [7].
1.2. Phân loại xạ khuẩn
1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Trong phân loại ngƣời ta thƣờng chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính dựa trên
các dấu hiệu hình thái:
- Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt. Đặc trƣng của nhóm này là sinh sản
bằng bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC.
- Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang. Đặc trƣng của nhóm này là khuẩn ti phân
chia theo hƣớng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tƣơng tự nang bào tử.
- Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ti.
- Nhóm xạ khuẩn dạng tƣơng tự Corynebacter và dạng cầu: tế bào có hình
chữ V, T hoặc dạng cầu, thông thƣờng không có khuẩn ti.
Trƣớc kia, nhiều loại xạ khuẩn đƣợc phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc
điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nhƣ màu của KTCC, KTKS, sắc tố tan; sự có
mặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sự
phân đốt của khuẩn ti. Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việc
nghiên cứu phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [7,
36].

7


1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong một vài
thập kỉ trƣớc và ngày nay vẫn còn là cơ sở quan trọng trong phân loại xạ khuẩn.
Đây là phƣơng pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lƣợng
thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc
điểm sau:
- Typ thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptid và đƣờng trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG): dựa trên các thông tin về thành phần và cấu trúc
của mạch tetrapeptid của PG, của cầu nối peptid và cách liên kết giữa các mắt xích
của PG.
- Axit mycolic: là các phần tử có mạch dài hay phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium và Corynebacter. Đây là đặc điểm phân
loại cơ bản của các chi đó.
- Axit béo: thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại là các axit béo bão hòa
mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso- và enteiso- đƣợc
methyl hóa ở phân tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10-methyloctadecanoid là
đặc điểm phân loại đến chi.
- Menaquinon: Xạ khuẩn giống vi khuẩn Gram dƣơng và khác vi khuẩn
Gram âm ở chỗ tổng hợp menaquinon và dimethylmenaquinon, không tổng hợp
ubiquinon. Phần lớn các chi xạ khuẩn có thành phần menaquinon xác định.
- Photpholipid: có 5 typ photpholipid (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc
trƣng và có ý nghĩa trong phân loại xạ khuẩn [7].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Khi phân loại xạ khuẩn ngƣời ta thƣờng sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh
hóa cũng nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất

kích thích sinh trƣởng. Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng đƣợc xác định nhƣ pH,
nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với chất kháng sinh,

8


khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trƣng
của xạ khuẩn.
Tuy nhiên, do xạ khuẩn thƣờng xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa thƣờng có giá trị thấp về mặt phân loại. Nhƣng để phát hiện loài
mới ngƣời ta thƣờng sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số [7, 34].
1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy)
Phân loại số đƣợc Williams và cs, (1983) sử dụng để phân loại chi
Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi. Phƣơng pháp này dựa trên sự đánh giá
về số lƣợng, mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm,
chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau
từng đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (Similarity) theo
phƣơng trình sau:
%S 

N S x100
NS  Nd

Ns: Tổng số các đặc điểm dƣơng tính (giống nhau) của 2 chủng so sánh.
Nd: Tổng số các đặc điểm (khác nhau) dƣơng tính của chủng này và âm tính
của chủng kia.
Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy
theo mức độ giống nhau đƣợc nhóm thành từng cụm (Cluster). Bằng phân loại số
ngƣời ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13
cụm với những đại diện nhất định [7, 27, 31].

1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA
Từ cuối thế kỷ XX, đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự sinh trƣởng
mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân
loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thời gian
ngắn và có độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gene, hoặc
các sản phẩm của gene. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thƣờng sử
dụng 3 phƣơng pháp chính đó là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gene mã
hóa 16S-rRNA.
9


Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phƣơng pháp hữu hiệu nhất để
xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả các
sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao. Chúng chỉ khác nhau rất ít
giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này ngƣời ta có thể đánh
giá đƣợc mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật.
Trong tế bào vi sinh vật nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất.
Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rRNA và protein
riêng rẽ. Ribosome vi sinh vật nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S
(gồm rRNA 5S, rRNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rRNA 16S và 21
phân tử protein) [6].
Các gene mã hóa 5S-rRNA, 16S-rRNA và 23S-rRNA nằm cạnh nhau, có
cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rRNA, thì 16S-rRNA
là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn, vì gene mã hóa 16S-rRNA có
kích thƣớc khoảng 1540 bp phù hợp cho các nghiên cứu phân loại; còn gene mã hóa
5S-rRNA có kích thƣớc khoảng 120 bp, dễ xác định trình tự nhƣng lại không đặc
hiệu cho phân loại; còn gene mã hóa 23S-rRNA cũng là một gene tiềm năng cho
phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhƣng trình tự của gene này
tƣơng đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít đƣợc
sử dụng hơn [16].

Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự
16S-rRNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn
70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng đồng 98,6% của trình tự 16S-rRNA đƣợc coi là
ngƣỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy
giá trị này là 98% [21].
1.3. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển
1.3.1. Nhóm chất kháng sinh polyketide
Polyketide là một họ các chất chuyển hóa bậc hai đƣợc hình thành bởi sự xúc
tác của enzyme polyketide synthase (PKSs). Khung cacbon của polyketide đƣợc
khử và biến đổi bởi những domain khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme
10


ketoreductase, dehydratase và enoylreductase. Có 3 loại PKSs khác nhau đã đƣợc
biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức năng. PKSs loại II là
phức hợp của nhiều enzyme, cùng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSs
loại III [14, 24].

Hình 1.1. Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin [14, 24]
Abyssomicin C là kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển Verrucosispora
sp. Abyssomicin C có khả năng kháng lại các vi khuẩn G+, bao gồm cả những vi
khuẩn gây bệnh đã kháng vancomycin nhƣ Staphylococcus aureus [14, 22].
Daryamide là polyketide gây độc cho tế bào đƣợc phân lập từ dịch nuôi cấy
của xạ khuẩn Streptomyces sp. chủng CNQ-085. Chất này có khả năng gây độc cho
tế bào ung thƣ biểu mô ở ngƣời, dòng HCT-116 và có khả năng kháng nấm C.
albicans [14, 17].
Trioxacarcin lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1981 từ S. bottropensis
DO-45. Chúng có khả năng chống lại các tế bào ung thƣ khác nhau, có hoạt tính
kháng vi khuẩn G- và G+ và kháng trùng sốt rét. Trioxacarcin A có khả năng tạo liên
kết cộng hóa trị với đoạn DNA sợi kép d(AACCGGTT) [14].

1.3.2. Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide
Proximicin là kháng sinh đƣợc tạo ra bởi xạ khuẩn Verrucosispora sp. MG37
và V. maris AB-18-032 chúng đƣợc phân lập từ các mẫu trầm tích dƣới độ sâu

11


250m ở Raune Fjord, Na-uy và ở biển Nhật Bản ở độ sâu 289 m. Proximicin (A, B,
C) có khả năng kìm hãm sự sinh trƣởng của tế bào ung thƣ biểu mô dạ dày và ung
thƣ biểu mô gan [14].
Mechercharmycin đƣợc sản xuất bởi xạ khuẩn Thermoactinomyces sp. YM3251; đƣợc phân lập từ bùn ở Macherchar nƣớc cộng hòa Palau (bắc Thái bình
dƣơng). Mechercharmycin A có khả năng gây độc cho tế bào ung thƣ tuyến biểu mô
phổi dòng A549 và tế bào ung thƣ bạch cầu [14].
1.3.3. Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide
Salinosporamide A (NPI-0052) là kháng sinh mới có cấu trúc β-lactone-γlactam (C15H20O4NCl) tách từ dịch lên men của xạ khuẩn biển Salinispora tropica
đƣợc phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở độ sâu 1m tại biển Chab Cay, Bahamas.
NPI-0025 là chất ức chế proteasome 20S gây ra hiện tƣợng appoptosis trong tế bào
u tủy và kháng lại tế bào ung thƣ ruột kết. NPI-0025 đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng
bởi hãng dƣợc phẩm Nereus Pharmaceuticals vào năm 2006 và có tiềm năng là một
chất kháng ung thƣ có giá trị trong tƣơng lai [14, 22, 26].
Lajollamycin là kháng sinh đƣợc tạo thành từ xạ khuẩn S. nodosus chủng
NPS007994 phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở Scripps Canyon, La Jolla,
California. Lajollamycin có khả năng kìm hãm sự sinh trƣởng của tế bào u melanin
dòng B16-F10 ở chuột; ngoài ra chất này còn đƣợc Manam và cộng sự (2005) xác
định là có khả năng tiêu diệt nhiều tế bào vi khuẩn [14].
1.3.4. Nhóm kháng sinh isoprenoid
Altemicidin là kháng sinh có bộ khung vòng đơn terpen-alkaloid, đƣợc hình
thành từ xạ khuẩn biển S. sioyaensis chủng SA1758 đƣợc phân lập từ mẫu bùn ở
Gamo, Miyagi Prefecture, Nhật Bản. Chất này có khả năng kìm hãm sự sinh trƣởng
của tế bào ung thƣ bạch cầu Lympho L1210 và ung thƣ biểu mô dòng IMC [14].

Marinone có cấu trúc một vòng rƣỡi terpen. Marinone và nhiều chất có hoạt
tính khác đƣợc tạo ra từ xạ khuẩn chủng CNH099 phân lập từ độ sâu 1 m ở

12


Batiquitos Lagoon, Bắc San Diego, Califorlia. Những chất này có khả năng gây độc
tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời dòng HCT116 trong điều kiện in vitro [14].
Glaciapyrrole (A, B, C) là kháng sinh đƣợc hình thành từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. chủng NPS008187. Nhóm kháng sinh này đã đƣợc Macherla
(2005) tìm ra có khả năng kháng khuẩn [17].
1.3.5. Các chất kháng sinh khác
Diazepinomicin (ECO-4601) đƣợc phát hiện vào năm 2004 bởi Charan và
cộng sự. ECO-4601 có nguồn gốc từ Micromonospora sp., có hoạt tính kháng
khuẩn, kháng viêm và kháng tế bào ung thƣ. ECO-4601 có phổ kháng rộng chống
lại tế bào u vú, u thần kinh đệm và u tiền liệt tuyến. Đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng
tại Canada vào năm 2006 [18, 22].

Hình 1.2. Cấu trúc của Diazepinomicin [22]
Chandrananimycin đƣợc hình thành từ xạ khuẩn Actinomadura sp. chủng
M048 đƣợc phân lập từ vịnh Giao Châu, Trung Quốc. Chandrananimycin có khả
năng chống lại tế bào khối u ruột kết, u melanin, u phổi, u vú, u tuyến tiền liệt và u
tuyến thận. Ngoài ra chất kháng sinh này còn có khả năng kháng khuẩn và nấm
[14].
Helquinoline (C12H15O3N) là kháng sinh hình thành từ Janibacter limosus.
Chất kháng sinh này có khả năng kháng Bacillus subtilis, S. virdochromogenes
Tu57 và Staphylococcus aureus [17, 22].
Bảng 1.1. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển [14, 18, 22, 24]
Nhóm

Chất kháng sinh
Abyssomicin
Marinomycin

Xạ khuẩn
Hoạt tính
Verrucosispora sp.
Kháng khuẩn
Marinispora
sp. Kháng khuẩn, kháng ung
CNQ140
thƣ

13


Nonactin

Streptomyces
sp.
KORDI3238
Polyketide
Daryamide
Streptomyces sp. CNQ085
Actinofuranone A (B)
Streptomyces
sp.
CNQ766
Trioxacarcin
Streptomyces

sp.
B8652
IB-00208
Actinomadura
sp.
BL42PO13-046
Mechercharmycin
Thermoactinomyces sp.
Thiocoraline
Micromonospora sp.L13-ACM2-092
Proximicin
Verrucosispora
sp.
NonMG37
ribosomal
V. maris AB-18-032
peptide
Piperazimycin
Streptomyces sp. CNQ593
Lucentamycin
N. lucentensis CNR712
Arenamide
S. arenicola CNT088
A S. tropica
Phức
hợp Salinosporamide
polyketide và (NPI-0052)
NonLajollamycin
S. nodosus NPS007994
ribosomal

peptide
Altemicidin
S. sioyaensis SA1758
Marinone
Xạ
khuẩn
chủng
CNH099
Isoprenoid
T-Muurolol
Streptomyces sp. M491
Glaciapyrrole
Streptomyces
sp.
NPS8187
Chloro-dihydroquinone Xạ
khuẩn
chủng
CNQ525
Chandrananimycin
Actinomadura
sp.
M048
Caboxamycin
Streptomyces
sp.
Các
chất
NTK937
kháng sinh Butenolide

S.
luteoverticillatum
khác
11014
Diazepinomicin (ECO- Micromonospora sp.
4601)
Frigocyclinone
S. griseus
Helquinoline
Janibacter limosus

14

Kháng tế bào ung thƣ
Kháng nấm, kháng tế bào
ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng khuẩn, kháng ung
thƣ, kháng trùng sốt rét.
Kháng ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ,
kháng khuẩn
Kháng tế bào ung thƣ

Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng khuẩn
Kháng khuẩn, kháng ung
thƣ
Kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng tế bào ung thƣ
Kháng khuẩn, kháng
viêm, kháng ung thƣ
Kháng khuẩn
Kháng khuẩn


1.4. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
1.4.1. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên đƣợc Pasteur và Joubert (1877) sử
dụng để mô tả hiện tƣợng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus
anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi
khuẩn hiếu khí lành tính khác. Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng
khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp đƣợc các hợp chất hoá học có hoạt tính
kìm hãm các chủng đối kháng.
Trong quá trình tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinh
tồn của loài. Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt. Xạ khuẩn
thƣờng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất của mình để ức chế hoặc tạo điều kiện
không thuận lợi cho sự sinh trƣởng của vi sinh vật khác. Thông thƣờng các chất
kháng sinh có thể hình thành theo các cơ chế sau:
- Đối với các CKS tƣơng tự nhƣ các sản phẩm chuyển hóa bậc một (axit
amin, nucleotid…) thì sự sinh tổng hợp các CKS này tƣơng tự nhƣ sinh tổng hợp

các chất chuyển hóa bậc một.
- Đối với kháng sinh đƣợc tạo ra bằng con đƣờng polime hóa bao gồm:
+ Các chất là dẫn xuất của polipeptid, đƣợc tạo thành bằng cách trùng hợp
các axit amin. Mạch polipeptid đƣợc tạo thành có thể đƣợc biến đổi trong các phản
ứng tiếp theo.
+ Các chất đƣợc tạo thành từ đơn vị acetat và propionat thì theo con đƣờng
tổng hợp axit béo.
+ Các chất terpen đƣợc tạo thành từ các đơn vị isopren.
+ Đối với các chất aminoglucozid thì tạo thành bằng con đƣờng trùng hợp
các phân tử đƣờng, axit amin và các rƣợu amin mạch vòng.
Chức năng của các sản phẩm trao đổi bậc hai đối với cơ thể sản sinh ra vẫn
chƣa đƣợc xác định chính xác và còn nhiều điều chƣa thể lí giải. Có thể nói, chúng
không có một chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào vì tế bào vẫn có khả

15


năng sinh trƣởng và sinh trƣởng bình thƣờng khi không có các hợp chất này. Do đó,
vai trò đối với tế bào của các sản phẩm này cần đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng hơn [11].
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố
nhƣ pH, nhiệt độ, thành phần môi trƣờng lên men… Để xạ khuẩn sinh trƣởng tốt và
hình thành các sản phẩm tối ƣu, cần đảm bảo trong môi trƣờng lên men có đầy đủ
các nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố vi lƣợng và các thông số về điều kiện nuôi
cấy thích hợp.
1.4.2.1. Điều kiện nuôi cấy
- Nhiệt độ: Phần lớn xạ khuẩn sinh trƣởng tốt ở 28 – 30oC. Nhiệt độ tối ƣu
cho tổng hợp CKS thƣờng nằm trong khoảng 18 – 28oC [7].
- pH môi trƣờng: Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trƣờng.
pH thích hợp cho tổng hợp CKS thƣờng là trung tính, pH kiềm hay axit thƣờng ức

chế quá trình sinh tổng hợp CKS. Tuy nhiên dải pH cho chủng vi sinh vật sinh
trƣởng thƣờng dài hơn pH tối ƣu cho sinh tổng hợp kháng sinh. Ví dụ ở S.
aureofaciens, pH thích hợp cho sinh trƣởng là 4,2 – 8,0 và cho sinh kháng sinh là
5,5 – 6,5 [7].
- Độ thông khí: Xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vật
khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ 6 – 12 giờ nuôi). Do vậy, để đảm
bảo thông khí tốt, ngƣời ta thƣờng thêm vào môi trƣờng lên men benzylthioxyanat
làm tăng khả năng hòa tan của oxi. Nồng độ thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 28% O2 trong dịch lên men [2].
- Lƣợng giống và tuổi giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp CKS
không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lƣợng của
bào tử và giống sinh dƣỡng. Thông thƣờng, lƣợng giống cấy truyền vào môi trƣờng
lên men để hiệu quả nhất là từ 2 – 10%, tuổi giống thƣờng là 24 giờ [15].
1.4.2.2. Thành phần môi trường lên men
- Nguồn cacbon: Các hợp chất cacbon có ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình sinh
trƣởng và sinh tổng hợp CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn có hoạt tính amylase,

16


nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà chọn
nguồn cacbon thích hợp nhƣ các loại đƣờng đơn glucose, fructose, galactose hay
các loại đƣờng đôi nhƣ maltose, saccarose, lactose…; các loại đƣờng đa nhƣ tinh
bột, destrose…; các loại thành phần không xác định nhƣ rỉ đƣờng, đại mạch…;
cũng có thể là các axit hữu cơ và chất béo làm nguồn cacbon [7].
- Nguồn nitơ: Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả 2 nguồn
nitơ hữu cơ và vô cơ. Trong đó, nguồn nitơ vô cơ thƣờng cho khả năng sinh CKS
không cao. Nguồn nitơ hữu hiệu nhất thƣờng là các sản phẩm từ thực vật nhƣ bột
đậu tƣơng, bột đậu xanh, cao ngô… Trong đó, cao ngô là nguồn cung cấp cả nitơ vô
cơ và hữu cơ; tuy nhiên cao ngô có hạn chế về chất lƣợng do có lƣợng photphat vô
cơ cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS [33].

- Nguồn photphat vô cơ: Vai trò của photphat vô cơ nhƣ yếu tố điều chỉnh
sinh tổng hợp CKS đƣợc nhiều tác giả đề cập. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh
tổng hợp phần lớn CKS không quá 10 mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm
tăng lƣợng axit nucleic trong khuẩn ti, làm kéo dài pha sinh trƣởng, rút ngắn pha
tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng quá trình sinh
tổng hợp CKS. Sự thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào
quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp làm giảm khả năng tổng hợp CKS [7].
1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh
1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả năng sinh các chất có
hoạt tính đối kháng còn hạn chế, hầu nhƣ chƣa có công trình khoa học có quy mô
lớn nghiên cứu các vi sinh vật và tách chiết các chất kháng sinh từ vi sinh vật biển.
Tác giả Lê Gia Hy và cs, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập và nghiên
cứu đƣợc đặc điểm của chủng vi khuẩn biển HT0523 có nhiều đặc điểm quý có thể
khai thác trong nuôi trồng thủy sản. Chủng vi khuẩn biển HT0523 chính là vi khuẩn
Gram dƣơng, sinh bào tử có khả năng ức chế mạnh cả 2 chủng vi sinh vật Vibrio
gây bệnh cho tôm là V. parahaemolyticus và V. furnisii. Chủng HT0523 có sức sống
cao, có khả năng thích ứng rất tốt với điều kiện môi trƣờng dao động nhiều, sinh
17


trƣởng tốt ở nồng độ NaCl 1-3%, pH thích hợp từ 7 - 9, nhiệt độ từ 25 - 37oC.
Chủng này sinh trƣởng tốt trên nguồn cacbon lactose và nguồn nitơ vô cơ là KNO3
đặc biệt là khi kết hợp với nguồn nitơ hữu cơ (pepton) thì mật độ tế bào cao xấp xỉ
hai lần [8].
Các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
đã tách đƣợc chất Fucoidan từ một số loài rong ở vùng biển Nha Trang-Khánh Hòa
nhƣ Sargassum polysystum, S. Oligosystum, S. mcclurei, S. swartzii, S.
denticarpum. Bằng các phƣơng pháp phân tích hóa học và phổ cho thấy những phân
đoạn Fucoidan tách đƣợc là Fucogalactam có chứa nhóm este sulfat, uronic axit và

các gốc đƣờng fructose, galactose… Các phân đoạn đều đem thử hoạt tính và kết
quả là tất cả các phân đoạn đều có hoạt tính chống ung thƣ. Kết quả thực nghiệm
chỉ ra rằng sự có mặt của nhóm sulfat và uronic làm tăng hoạt tính của Fucoidan [9,
12].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới
Trong những năm gần đây, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiều
nghiên cứu mới về vi sinh vật ở nhiều nƣớc trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm
kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển nhƣ các chất kháng khuẩn,
kháng virus, kháng tế bào ung thƣ, kháng nấm, chống đông máu hoặc là kháng
trùng sốt rét… Những hợp chất này sẽ trở thành nguồn dƣợc phẩm quan trọng để
chữa bệnh trong tƣơng lai.
G. Vijaya Baskara Sethubathi và V. Ashok Prabu (Đại học Annamalai) đã
phân lập đƣợc 12 chủng tảo biển ở bờ biển Adirampattinam, tây nam vịnh Palk.
Dựa trên đặc điểm sinh trƣởng có 3 chủng đƣợc phân loại đó là Oscillatoria sp.,
Phirmidium sp. và Lyngbya majuscule. Ba loài này đều có khả năng kháng một số
loài vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời nhƣ S. mutants, S. aureus, Pseudomonas
aeruginosa, B. subtilis và Klebsiella pneumoniae. Trong đó Oscillatoria sp. có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh nhất và Lyngbya majuscule có hoạt tính yếu nhất [35].
M. Krishnaraj và N. Mathivanan (Ấn Độ - 2009) đã phân lập đƣợc 137
chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ 40 địa điểm khác nhau ở vịnh

18


Bengal. Trong tất cả 137 chủng xạ khuẩn đều có khả năng kháng các vi khuẩn gây
bệnh ở ngƣời nhƣ S. aureus, P. aeruginosa, Bacillus spp. và 10 chủng có khả năng
kháng nấm Rhizoctonia solani và Fuzarium oxysporum gây bệnh ở thực vật [23].
Năm 2010, Rofiq Sunaryanto và Bambang Marwoto đã phân lập ở Anyer,
Banten (Indonesia) đƣợc 29 chủng vi khuẩn trong đó có một chủng A11 có đặc tính
kháng đƣợc các chủng vi khuẩn G- và G+ (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, B.

subtilis). Bằng phƣơng pháp giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh trình tự với dữ
liệu của Genbank đã xác định đƣợc chủng A11 chính là xạ khuẩn Streptomyces sp.
Bằng phƣơng pháp sắc ký đã tách đƣợc một hợp chất kháng sinh có khả năng kháng
khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn nhiều so với chất kháng sinh
tetracyline (đối chứng) [28].
Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P và Reena
A (trƣờng ĐH Khoa học công nghệ Mohamed Sathak-Ấn Độ) phân lập đƣợc 20
chủng xạ khuẩn từ bờ biển Royapuram, Muttukadu, Mahabalipuram và ở cửa biển
Adyar vào năm 2011. Trong đó có 2 chủng xạ khuẩn (ký hiệu C11 và C12) có khả
năng kháng khuẩn. Chủng C11 có chuỗi bào tử dài, bề mặt khuẩn lạc trắng và là vi
khuẩn G+, chúng kháng đƣợc Staphylococcus, Pseudomonas, V. harveyi. Chủng
C12 cũng là vi khuẩn G+, có chuỗi bào tử hình cầu, bề khuẩn lạc mầu kem và C12
ngoài kháng đƣợc 3 loài vi khuẩn gây bệnh trên còn kháng cả B. subtilis. Bằng
phƣơng pháp phân loại phân tử giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh với cơ sở dữ
liệu ở Genbank đã phân loại đƣợc 2 chủng C11 và C12 đều là xạ khuẩn
Streptomyces [34].
Năm 2011, Sumei Li và cộng sự đã phân lập đƣợc một chủng xạ khuẩn
(SCSIO-01299) từ biển Đông (Việt Nam) ở độ sâu 3258 m. Bằng phƣơng pháp
quan sát hình thái học và giải trình tự gene 16S-rRNA, chủng SCSIO-01299 đƣợc
phân loại là Pseudonocardia sp. SCSIO-01299. Các nhà khoa học này đã tách đƣợc
4 hợp chất có hoạt tính sinh học cao đó là deoxynyboquinone và Pseudonocardian
A-C. Deoxynyboquinone và Pseudonocardian A và B có khả năng kháng khuẩn (S.
aureus, E. faecalis, B. thuringensis) và kháng tế bào ung thƣ phổi, ung thƣ vú và

19


ung thƣ não. Bằng phƣơng pháp khối phổ đã phân tích đƣợc deoxynyboquinone có
công thức phân tử C15H12O4N2; pseudonocardian A có thành phần C18H18O5N2;
pseudonocardian B công thức là C19H20O5N2; pseudonocardian C công thức là

C21H24O8N2 [32].

Hình 1.3. Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) [32]

20


CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Các mẫu nƣớc và bùn lấy ở ven bờ tại các vị trí khác nhau ở các vùng biển
Việt Nam, các mẫu đƣợc ký hiệu theo tên từng địa phƣơng lấy mẫu.
Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Bacillus subtilis ATCC 6633; Bacilus
cereus ATCC 11778; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Enterobacter
aerogenes ATCC 23048; Salmonella typhi IFO 14193; Candida albicans ATCC10,
E. coli ATCC 11105, Alcaligenes faecallis, Pseudomonas auroginosa nhận từ bộ
sƣu tập giống của phòng Công nghệ lên men, viện Công nghệ sinh học.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Các loại đƣờng gồm: glucose; arabinose; raffinose; fructose; saccarose;
xylose; myo-inositol; mannitol; lactose; mannose; galactose; dextrose... (Merck).
Các nguồn nitơ: L-histidinemonohy-drodorid monohydrate; L-phenylalanine;
Leucine; L-triptophan; L-asparagine monohydrate;

L-arginine monodo; L-

isoleucine; L-valine; L-methionine; L-lysine; L-threonine; L-cystein; 2-amino-2
hydroxy-methyl 1,3 prom (Merck).
Các hóa chất khác dùng trong nuôi cấy và lên men: CaCO3; K2HPO4.3H2O;
KH2PO4; FeSO4.7H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; NaCl; bột đậu tƣơng; trypton; pepton;

cao ngô; casein thủy phân; agar và một số hóa chất cần thiết khác… là sản phẩm
của Việt Nam hoặc nƣớc ngoài có độ tinh khiết cao, đáp ứng yêu cầu nghiên cứu.
Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử gồm: Tris-base, EDTA, axit acetic,
CTAB, NaCl, propanol, chloroform, phenol, isoamin alcohol, etanol, bromophenol
blue, Ethidium bromide, glycerol, dNTP các loại, MgCl2, cặp mồi FC27/RC1492,
kít PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen), DNA Marker (Fermentas),
agarose…
2.1.2.2. Thiết bị

21


Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị
Cân phân tích
ADNHR- 20000
Nồi hấp thanh trùng

Nơi sản xuất
Tên thiết bị
Thụy Sỹ
Máy ly tâm

Nơi sản xuất
Đức

Nhật Bản

Nhật Bản

Tủ cấy vô trùng
Tủ ấm
Máy lắc

Pháp
Trung Quốc
Hàn Quốc

Cân điện tử
Startorius
Máy điện di DNA
Mupid

Đức

Máy PCR GeneAmp PCR
system 9700

Nhật Bản

Máy xác định trình tự tự
động ABI PRISM®3100Avant Genetic

Kính hiển vi quang học
Olympus CHD -2
Máy đo pH 320 Toledo
Tủ khử trùng khô dụng cụ
Kính hiển vi quét

Anh

Trung Quốc
Viện 69, Bộ tƣ lệnh
lăng Chủ tịch HCM
Mĩ
Mĩ

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Phƣơng pháp lấy mẫu phụ thuộc vào tính chất của mẫu (đất mùn, bùn,
nƣớc....) mà có phƣơng pháp thu thập mẫu thích hợp. Dụng cụ dùng lấy mẫu phải
vô trùng để tránh nhiễm chéo. Mẫu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi
xử lí và phân tích.
Mẫu nước
Dụng cụ lấy mẫu nhƣ gáo có tay cầm hoặc các ống nghiệm, chai nhựa đã
đƣợc khử trùng bằng cồn. Lấy nƣớc cách bề mặt 0,2 – 5,0 m mẫu nƣớc đƣợc đựng
trong các ống nghiệm nút cao su, chai nhựa có ghi rõ đặc điểm và địa điểm lấy mẫu.
Mẫu đất, bùn
Dùng dao hay xẻng sạch đã lau cồn để lấy mẫu đất. Đầu tiên loại bỏ lớp đất
dày 2-5 cm trên bề mặt, sau đó lấy phần đất tiếp theo cho vào túi đã đƣợc khử trùng,
gài cẩn thận. Túi đƣợc dán nhãn ghi rõ đặc điểm, địa điểm lấy mẫu.
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu
Để xác định thành phần và số lƣợng nhóm vi sinh vật có trong các mẫu, sử
dụng phƣơng pháp pha loãng tới hạn và nuôi trên các môi trƣờng đặc trƣng cho
từng nhóm vi sinh vật.

22