Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012


MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................ Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................... Error! Bookmark not defined.
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................i
Chƣơng 1- TỔNG QUAN ......................................................................................... iii
1.1. TY THỂ .......................................................................................................... iii
1.1.1. Hệ genome ty thể .................................................................................... iii
1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể..........................................................v

1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thƣ ................................................... vii
1.2. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG .....................................................................x
1.2.1. Khái quát về ung thƣ đại trực tràng ..........................................................x
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng ..................................................xi
1.2.3. Phân loại các dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học ...........................xi
1.2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20]........................xv
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ...xv
1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể ......................................................xvi
1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể ............................................... xviii
1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh ..xxi
1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc..................................................... xxiii
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...........................................xxv
2.1. NGUYÊN LIỆU ...........................................................................................xxv
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...........................................................................xxv
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................xxv
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................ xxvi
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................. xxvii
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô .......................................................... xxvii
2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 1 398 v đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR
..................................................................................................................... xxviii


2.2.3. Phân tích RFLP ................................................................................... xxix
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn
....................................................................................................................... xxxi
2.2.5. Tinh sạch ADN ................................................................................. xxxiv
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... xxxvi
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY
THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................ xxxvi
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng ............. xxxvi

3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể ................................. xxxvii
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể .... xxxvii
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A1 398G CỦA GEN ND3 ADN TY
THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................ xxxix
3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể ................................ xxxix
3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A1 398G....................xl
3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G ....................... xli
3.2.4. Phân tích mối iên quan giữa đa hình A1 398G với các đ c điểm bệnh
học âm s ng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng....................................... xliv
KẾT LUẬN .............................................................................................................. lvi
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ lvii
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... lviii
PHỤ LỤC .................................................................. Error! Bookmark not defined.
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân cùng đ c điểm lâm sàng.. Error! Bookmark not
defined.
Phụ lục 2. Kết quả giải trình tự đoạn 10398 ......... Error! Bookmark not defined.


MỞ ĐẦU

Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn. Ty thể đƣợc coi là trung
tâm năng ƣợng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ
th nh năng ƣợng mà tế bào có thể sử dụng đƣợc là ATP. Ngoài ra, ty thể còn đóng vai
trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác nhƣ apoptosis (quá trình tự chết
của tế bào), điều khiển tín hiệu Ca ci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào,
tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. Cho đến nay, ngƣời ta đã thống kê đƣợc
trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể quyết định. Các bệnh
do rối loạn ADN ty thể thƣờng đƣợc biểu hiện rất đa dạng, chúng có thể iên quan đến
rối loạn quá trình mã hóa protein ho c đơn thuần chỉ là những đột biến do thay đổi các
nucleotide [57].

Trong v i năm trở lại đây, những rối loạn ty thể iên quan đến các bệnh ty thể
đƣợc xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học.
Đ c biệt, hƣớng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể nhƣ một chỉ thị sinh học đang phát
triển nhanh chóng trong nhiều ĩnh vực khác nhau iên quan đến các bệnh chuyển hóa
hiếm g p, lão hóa, xác định các đ c tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di
truyền của mẹ… Trong số các ĩnh vực này phải kể đến ung thƣ – đề t i thu hút đƣợc
sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Ung thƣ đại trực tràng là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới,
đứng hàng thứ hai sau ung thƣ phế quản ở nam giới v ung thƣ vú ở nữ giới. Trên thế
giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh n y v h ng năm có thêm khoảng
6

trƣờng hợp mới đƣợc phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thƣ đại trực tr ng cũng

chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thƣ đƣờng tiêu hóa, chỉ
đứng sau ung thƣ dạ dày. Để đạt đƣợc hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần đƣợc
chẩn đoán c ng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày nay nghiên cứu ở
mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể, đang ng y c ng góp
phần vào công tác chẩn đoán v điều trị bệnh có hiệu quả.


Trong khuôn khổ luận văn n y, chúng tôi tiến h nh đề tài nghiên cứu:
“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại
trực tràng”
với mục đích:
 Phát hiện đột biến gen tARN v ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung
thƣ đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
 Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN v ND3 của ADN ty thể
với các đ c điểm lâm sàng của bệnh ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời Việt
Nam.

Đề t i đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng
thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.


Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1. TY THỂ
Ty thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng ƣợng trong chất dinh dƣỡng
th nh năng ƣợng trong ATP. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn. Ty thể đƣợc
Atman phát hiện v o năm 1894 v đến năm 1897 đƣợc Benda đ t tên là mitochondria
(theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thƣờng có dạng sợi, ho c
dạng hạt khi quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng [3].
Ty thể đƣợc coi là trung tâm năng ƣợng của tế bào vì

nơi chuyển hóa các

chất hữu cơ th nh năng ƣợng tế bào có thể sử dụng đƣợc là ATP. Ngoài ra, ty thể
đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa nhƣ: Apoptosis (quá trình tự
chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Ca ci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế
bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32].
1.1.1. Hệ genome ty thể
Ty thể có chứa ADN, do đó nó

một hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền

của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thƣớc 16569bp,
gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi n ng có chứa nhiều guanine,
chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi n ng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9
gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có 13 gen ghi mã cho 13

chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa. Số gen còn lại ghi
mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã của ty thể [10] (hình 1). Các
chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể đều đƣợc ghi
mã bởi genome nhân v đƣợc tổng hợp trong ribosome của tế bào chất.
Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đ c trƣng
riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đ c tính di truyền theo dòng mẹ, có
từ v i trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số ƣợng
bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng ƣợng trong mô [60]. Hệ gen ty thể
không có vùng intron và các gen không có, ho c có rất ít các bazo không mã hóa ở


giữa chúng. Trong nhiều trƣờng hợp không xuất hiện các codon kết thúc mà chỉ có sự
polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen ty thể không
tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thƣớc 1,1 kb chứa các yếu tố quan trọng cho
quá trình phiên mã và dịch mã nhƣ chứa promoter phiên mã của chuỗi n ng và chuỗi
nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi vùng D-Loop xảy ra đột
biến sẽ ảnh hƣởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi po ypeptide đƣợc mã hóa trong ty
thể [41].

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75].

Các đ c điểm của hệ gen ty thể nhƣ không có intron, không có histon bảo vệ, lại
phân bố gần chuỗi phosphory hóa oxy hóa, nơi m các gốc tự do đƣợc tạo ra trong
quá trình phosphory hóa oxy hóa, đã

m cho khả năng bị đột biến của ADN ty thể

cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị
đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện
tƣợng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng đồng nhất

(homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể

nhƣ nhau. Trong nhiều

trƣờng hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện lâm sàng hay
cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngƣỡng đột biến [51]. Vì vậy, xác
định đƣợc mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao trong chẩn
đoán bệnh ty thể.


1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể
Những đ c điểm của hệ gen ty thể đƣợc phát hiện từ đầu những năm 198 , v
tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã đƣợc tìm thấy [68].
Bệnh ty thể là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các hƣ hại
trong quá trình tạo ATP. Khi ƣợng ATP đƣợc sinh ra thấp hơn nhu cầu tối thiểu của
mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hƣ hỏng của các protein tham gia vào chuỗi
phosphoryl hóa oxy hóa. Số ƣợng các phân tử ADN ở các mô, các cơ quan

khác

nhau do có nhu cầu năng ƣợng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh hƣởng nhiều nhất
của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ƣơng, cơ xƣơng, tim, thận, gan,
tụy. Các bệnh đƣợc mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái và hóa
sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi và khởi
đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đ c biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ [57]. Tuy nhiên,
hiện nay, do tiến bộ của các phƣơng pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh ty thể
đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học trong những năm gần đây cho thấy
bệnh ty thể là một trong những bệnh iên quan đến đột biến gen phổ biến ở ngƣời, ảnh
hƣởng tới ít nhất 1 trên 5

ngƣời trong quần cƣ dân [22] (hình 2).

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]


Cho đến nay đã có hơn 15 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở ngƣời đƣợc
phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc đời, từ đứa
bé mới sinh đến ngƣời trƣởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột biến đƣợc di
truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một ngƣời có thể đƣợc dùng
cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột biến ADN ty thể có
iên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột biến ty thể gây bệnh bao
gồm đột biến điểm v đột biến mất đoạn có liên quan tới các bệnh ở ngƣời, hầu hết
trong số đó ảnh hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng v ngoại biên. Sau đây

một số

bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm
gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. Cả ba đột biến n y đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô
hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác
chung giảm kèm chứng loạn màu sắc.
Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột
biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V. Ngƣời bệnh có biểu hiện chậm phát
triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh.
Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,
giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 9 % đột biến thể hiện hội
chứng Leigh. Ngƣời bệnh có biểu hiện rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu hiện
sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thƣơng ở một ho c nhiều khu vực của hệ thần
kinh trung ƣơng.

Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ
(MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu). Bệnh có các triệu
chứng rối loạn thần kinh trung ƣơng, iệt nửa ngƣời, mù và nôn mửa.
Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra bởi
đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA ( ys). Ngƣời bệnh có biểu hiện tai biến, co
giật cơ, ƣỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhƣợc thần kinh do teo não, nhƣợc cơ.


1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thƣ
Mối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thƣ đã đƣợc Otto
Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 193 , khi ông giả thiết rằng sự tăng
tốc độ của quá trình đƣờng phân hiếu khí trong nhiều loại mô u là do sự hƣ hại chuỗi
hô hấp trong những tế bào này [70]. Theo Warburg, một số biến đổi của ty thể có liên
quan đến ung thƣ

những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi trong sự biểu hiện

và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp.
Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại
oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS). Trong điều kiện các electron bị thừa
quá mức (ví dụ nhƣ khi nhu cầu ca o tăng ên), ho c do sự ức chế phức hệ enzym
chuỗi hô hấp, các ROS đƣợc tạo ra rất nhiều. Sự tăng của ROS, ho c stress oxy hóa có
thể gây đột biến ADN ty thể v nhân,

m hƣ hại các thành phần lipid và protein nội

bào. Hệ gen ty thể đ c biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố gần chuỗi hô
hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể có thể gây ra
sự biểu hiện khác thƣờng của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử đƣợc mã
hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử,

giảm khả năng phosphory hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm về
chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS, làm biến ðổi sự biểu
hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa protein và quá trình tổng
hợp nucleotide của tế b o. Nhƣ vậy biến đổi của hệ gen ty thể có iên quan đến bệnh
ung thƣ [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã đƣợc xác định trong nhiều loại ung thƣ
khác nhau, nhƣ ung thƣ vú, đại trực tràng, buồng trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt,
phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở vùng ghi mã và vùng không ghi mã
[19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi ADN ty thể đã đƣợc xác định trong
ung thƣ. Các biến đổi này bao gồm: đột biến điểm, thêm ho c mất base, l p đoạn, mất
đoạn v thay đổi số ƣợng bản sao ADN ty thể.


Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thƣ [19]

Đột biến điểm
Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thƣ vú, Tan v cs (2

2) đã giải trình

tự genome ty thể trên 19 c p mô ung thƣ v mô bình thƣờng của cùng bệnh nhân v đã
cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột biến thuộc
vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) đƣợc xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và
ATPase 6 [58]. Trong số các đột biến trên, đột biến thêm ho c mất base chiếm 42%
thuộc vùng D-Loop, còn lại 52%

đột biến điểm thuộc vùng ghi mã và không ghi mã

[55].
Đột biến ADN ty thể đƣợc tìm thấy ở bệnh ung thƣ đại trực tràng. Polyak và cs
đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5, cytochrome

b, COXI, COXII v COXIII, cũng nhƣ các gen rRNA 12S v 16S [53].
Với bệnh ung thƣ buồng trứng, Liu v cs đã xác định đƣợc 6 % đột biến ADN
ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết

đột biến điểm

T→C ho c G→A. Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA, 16S rRNA và


cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả năng bị đột biến cao
trong bệnh ung thƣ buồng trứng [45].
Phân tích ở bệnh ung thƣ dạ d y, Wu v cs đã xác định đƣợc 48% mang đột
biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67%

đột biến thêm ho c mất base tại

vị trí nucleotide 303-309 (vị trí D310) [72].
Mất đoạn
ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, nhƣ mất đoạn 4977 bp, đã đƣợc xác định ở
ung thƣ vú [14], ung thƣ đại trực tràng [21]. Trong một nghiên cứu khác, Burgart và cs
đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%) bệnh
nhân ung thƣ dạ dày [17].

Thêm đoạn
Wu v cs đã xác định đƣợc đột biến thêm đoạn nhỏ (≈26 bp v ≈52 bp) trong
vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thƣ của 1 bệnh nhân ung thƣ dạ dày [72].
Hai đột biến n y đ c trƣng bởi có 2 ho c 3 đoạn l p lại kế tiếp nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã đƣợc phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thƣ.
Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thƣ tuyến giáp [47], ung thƣ phổi [15], ung thƣ đại

trực tràng [44]. Biến đổi theo hƣớng giảm số bản sao ADN ty thể đƣợc xác định thấy ở
bệnh ung thƣ vú [63], ung thƣ biểu mô tế bào gan [42], ung thƣ buồng trứng [69]. Nhƣ
vậy biến đổi về h m ƣợng ADN ty thể có liên quan với loại ung thƣ.
Ngƣời ta cho rằng số ƣợng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thƣ có thể phụ
thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thƣ đó. Ví dụ nhƣ các đột biến trong vùng DLoop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. M t khác, đột biến
ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa lại có


thể

m tăng số bản copy, nhƣ

một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty thể

[38].
1.2. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.2.1. Khái quát về ung thƣ đại trực tràng
Ung thƣ đại trực tràng hay còn gọi ung thƣ ruột kết (colon cancer) bao gồm
ung thƣ đại tr ng v ung thƣ trực tr ng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm
các đoạn ruột kết ên (ascending co on), đoạn ngang (transverse co on) v đoạn xuống
(descending colon). Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối giữa đại
tràng và hậu môn (hình 4). Ung thƣ thƣờng xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực
tr ng, thƣờng hai loại ung thƣ n y có iên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thƣ
nào xảy ra trƣớc, ung thƣ n o xảy ra sau vì thế thƣờng đƣợc gọi chung

ung thƣ đại

trực tràng [79].

Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76].

Ung thƣ đại trực tràng là một trong những loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế
giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán

do ung

thƣ. H ng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử
vong. Tỉ lệ mắc bệnh không giống nhau, ƣớc tính tỉ lệ bệnh nhân ở các nƣớc phát triển
(Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nƣớc đang phát triển. Trên thực tế, số ƣợng bệnh
nhân ở cả hai nhóm nƣớc đang gia tăng nhanh chóng do sự già hóa dân số v đời sống
ng y c ng đƣợc nâng cao. Ung thƣ đại trực tr ng thƣờng đƣợc phát hiện ở giai đoạn


sau 45–50 tuổi, ở tuổi 7

đa số (khoảng ½ số ngƣời), tuy nhiên bệnh có xu hƣớng trẻ

hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rƣợu bia, thuốc lá [78].
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng
Ung thƣ đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến khởi sinh. Có 2 dạng polyp phổ
biến ở ung thƣ đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thƣ sau n y
và polyp ác tính, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi thành u
tuyến lớn và dần hình th nh ung thƣ xâm ấn. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu lại cho rằng
nguy cơ mắc ung thƣ trực tr ng tăng ên ở một số gia đình nhiều thành viên là do ảnh
hƣởng của dạng polyp không phải khối u [33]. Các nhà khoa học chỉ ra rằng có rất nhiều
nguyên nhân hình th nh ung thƣ đại trực tràng và tất cả đều dẫn đến việc biến đổi bệnh
học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tr ng bình thƣờng. Thống kê cho thấy có 2 nhóm
nguyên nhân chính gây ra bệnh n y đó :
 Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thƣ, bất hoạt các gen ức chế khối u,
sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình.
 Yếu tố không di truyền: các tác nhân vật lí, hóa học; quá trình lão hóa, chế độ

ăn uống ít xơ, gi u đạm hay thói quen sử dụng bia rƣợu, hút thuốc á thƣờng
xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm
oét đại tràng.
Ngo i 2 nhóm nguyên nhân chính trên còn có các nguyên nhân khác nhƣ tuổi,
giới tính, chủng tộc cũng góp phần

m tăng nguy cơ dẫn đến ung thƣ đại trực tràng

[33].
1.2.3. Phân loại các dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học
Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2

, các u biểu mô đại

trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thƣ biểu mô, carcinoid (u nội tiết biệt hóa cao),
ung thƣ biểu mô tuyến – carcinoid kết hợp. Ngoài ra, một số dạng hiếm g p khác nhƣ
sacom (gồm các sacom cơ trơn, sacom mạch máu, sacom mỡ với tổn thƣơng dạng khối
lớn), u hắc tố ác tính, ung thƣ biểu mô tế bào hình thoi (xuất hiện riêng lẻ hay kết hợp
với ung thƣ biểu mô tuyến ho c ung thƣ biểu mô vảy v đƣợc gọi

ung thƣ biểu mô –

sacom), ung thƣ biểu mô tế bào sáng (xuất hiện riêng lẻ hay kết hợp với một loại khác


của ung thƣ đại trực tr ng), ung thƣ biểu mô vảy đơn thuần…Trong các dạng này thì
ung thƣ biểu mô tuyến là dạng rất hay g p, chiếm đến 95% trong tổng số các dạng ung
thƣ đại trực tr ng. Đây

dạng ung thƣ xuất phát từ niêm mạc ruột với tổn thƣơng ban

đầu có dạng nốt nhỏ, gồ cao, khi có phát sinh từ một u tuyến, biểu hiện của nó đƣợc
xác định theo các giai đoạn phát triển và loại cấu trúc trƣớc đó

dạng polyp hay dạng

nhú [7].
Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng:
Việc xác định giai đoạn của ung thƣ cho biết kích thƣớc của khối u và mức độ
lan rộng của nó khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ quyết
định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thƣ. Hiện nay có một số hệ thống phân giai
đoạn ung thƣ đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới. Sự khác nhau giữa các hệ thống này
phụ thuộc vào mục đích của từng ngƣời sử dụng trong việc chẩn đoán v bệnh án của
từng bệnh nhân [20]. Trong khuôn khổ luận văn n y, chúng tôi đề cập đến hệ thống
TNM (Tumor–Lymph Node–Metastases). Đây

hệ thống phân loại đƣợc áp dụng đối

với các mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu.
Hệ thống TNM phân giai đoạn ung thƣ đại trực tràng dựa v o kích thƣớc, mức
độ lan rộng của khối u đến các hạch bạch huyết (Bảng 1). Trong đó:
T cho biết kích cỡ, mức độ lan sâu vào thành ruột của khối u.
N cho biết cho khối u đã an đến các hạch bạch huyết chƣa v số ƣợng hạch bạch
huyết bị lây nhiễm.
M cho biết mức độ di căn của ung thƣ đến các cơ quan ho c bộ phận khác của cơ thể.
Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thƣ đại trực tràng [29]

T – Khối u nguyên phát
Tx  U nguyên phát không đƣợc đánh giá
T0  Không có bằng chứng của u nguyên phát

Tis – Ung thƣ biểu mô tại chỗ: nội biểu mô hay xâm nhập lớp đệm


T1 – Ung thƣ biểu mô xâm nhập hạ niêm mạc
T2 – Ung thƣ biểu mô xâm nhập lớp đệm cơ niêm
T3 – Ung thƣ biểu mô xâm nhập qua lớp đệm cơ niêm tới dƣới thanh mạc ho c vào mô
quanh đại tràng và trực tràng không có phúc mạc
T4 – U xâm nhập trực tiếp các cơ quan khác ho c cấu trúc và/ ho c gây thủng phúc
mạc tạng
N – Hạch lympho
Nx – Hạch bạch huyết vùng không đƣợc đánh giá
N0 – Không di căn hạch bạch huyết vùng
N1 – Di căn 1 đến 3 hạch bạch huyết vùng
N2 – Di căn 4 đến nhiều hơn hạch bạch huyết vùng
M – Di căn xa
Mx – Di căn xa không đƣợc đánh giá
M0 – Không có di căn xa
M1 – Di căn xa

Nói chung, ung thƣ đại trực tr ng đƣợc chia m các giai đoạn (hình 5) [29]:
 Giai đoạn : Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thƣờng đƣợc tìm thấy trong các lớp
trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thƣờng có thể trở th nh ung thƣ v ây
an v o các mô bình thƣờng gần đó. Giai đoạn

cũng đƣợc gọi

ung thƣ biểu mô tại

chỗ.
 Giai đoạn I: Ung thƣ đã bắt đầu lây an, nhƣng vẫn còn trong lớp lót bên trong.

 Giai đoạn II: Ung thƣ đã an đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng ho c trực
tr ng nhƣng chƣa ây an đến các hạch bạch huyết.
 Giai đoạn III: Ung thƣ đã an đến hạch bạch huyết nhƣng chƣa an đến những phần
xa của cơ thể.


 Giai đoạn IV: Ung thƣ đã an đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ thống bạch
huyết, đƣợc gọi

di căn. Các cơ quan m ung thƣ đại trực tr ng thƣờng di căn đến là

phổi và gan.

Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng [77].

Tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ở các giai đoạn bệnh đƣợc thể hiện trong bảng 2.
Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau
[29]

Giai đoạn

TNM

Khả năng sống sót sau 5 năm

Giai đoạn 0

Tis N0 M0

100%

Giai đoạn I

T12N0M0

8095%

Giai đoạn IIA

T3N0M0

7275%

Giai đoạn IIB

T4N0M0

6566%

Giai đoạn IIIA

T12N1M0

5560%

Giai đoạn IIIB

T34N1M0

3542%

Giai đoạn IIIC

T bất kỳ, N2M0

2527%

Giai đoạn IV

T bất kỳ, N bất kỳ, M1

07%


1.2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20]
Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đ c biệt là các kỹ
thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi
hiệu quả điều trị ung thƣ đại trực tr ng. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh này bao
gồm:
 Chẩn đoán lâm sàng có thể dựa trên các triệu chứng: tiêu chảy ho c táo bón,
có máu lẫn trong phân, phân ch t, khó chịu chung ở bụng (căng phồng ho c co thắt),
đầy hơi thƣờng xuyên, sụt cân không rõ lý do.
 Chẩn đoán hình ảnh: phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay đó

nội soi đại

tràng sigma bằng ống soi mềm giúp nhìn rõ các khối u và làm sinh thiết.
 Chẩn đoán mô học và tế bào học: phƣơng pháp n y cho phép phân biệt giữa
các tế b o bình thƣờng, loạn sản v ung thƣ biểu mô tại chỗ. Phổ biến hơn cả là kỹ
thuật chọc hút kim nhỏ.

 Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Một số các xét nghiệm phổ
biến có thể kể tới là xét nghiệm sinh hóa phát hiện kháng nguyên ung thƣ (CEA), xét
nghiệm máu trong phân (FOBT).
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã hóa
và vùng không mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tr ng. Năm 1998,
Po yak v cs đã xác định đƣợc đột biến ADN ty thể ở các vùng mã hóa: ND1, ND4L,
ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng nhƣ các gen rRNA 12S và 16S
[53].
Trong một nghiên cứu khác, Mansoureh và cs khi phân tích c p mô thƣờng và
mô bệnh của 30 bệnh nhân ung thƣ đại trực tr ng, đã phát hiện 15 mẫu mang đột biến
trên vùng ND1, trong đó có 7 đột biến khác nhau. Đột biến T4216C chiếm 27%, khác
nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thƣờng và mô bệnh [49].
A onso v cs (1997) xác định sự có m t của đột biến ADN ty thể (23%) trên
vùng D-Loop. Những đột biến n y

đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp, và

đột biến thêm 2 bp [9]. Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên cứu về


đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng thấy rằng 88,6% đột
biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) ho c giữa các pyrimidine (C, T),
11,4% còn lại

đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một purin với một

pyrimidine). Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA. 6 % đột biến nằm
trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này làm thay đổi acid amin
[56]. Trong luận văn n y chúng tôi muốn đi sâu v o đột biến ADN ty thể trên gen

tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) và gen ND3 (tại vị trí A10398G).
1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể
Đột biến điểm tARN ty thể

đột biến chiếm phần lớn trong các đột biến ty thể

gây ra bệnh ty thể. Hai đột biến tARN đƣợc phát hiện đầu tiên là A8344G trên
tRNALys và A3243G trên tARNLeu(UUR) là phổ biến v đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Đột
biến A3243G có iên quan đến rất nhiều biểu hiện âm s ng v thƣờng gây ra hội
chứng MELAS [31]. MELAS cũng có thể bị gây ra bởi những đột biến khác trên
tARNLeu(UUR). Đột biến A8344G iên quan đến chứng MERRF, cũng

bệnh về cơ thần

kinh. Bệnh này còn có thể bị gây ra bởi một v i đột biến khác trên tRNALys [56]. Ngoài
ra, có thể kể đến đột biến A7445G trên tARNSer(UCN) có iên quan đến bệnh mất thính
giác [54], đột biến A4269G trên tRNAIle gây bệnh liệt cơ tim ho c liệt mắt cơ ngo i
tiến triển mãn (CPEO) [59] (hình 6).

Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể ngƣời [59].


1.3.1.1. Đột biến A3243G và các bệnh liên quan
Đột biến A3243G trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR) đã đƣợc phát
hiện ra đầu tiên nhƣ

một nguyên nhân di truyền của bệnh MELAS [31]. Đột biến

A3243G liên quan tới MELAS

một trong số những đột biến gây bệnh phổ biến nhất

của ty thể với tần số đƣợc xác định trong khoảng từ ,95- 18,4 1

dân số Bắc Âu

[22]. Đột biến điểm mtDNA A3243G đƣợc gây ra bởi sự thay thế Adenine ở vị trí
3243 thành Guanine trên gen mã hóa cho tRNALeu (UUR) của ADN ty thể. Đột biến n y
m thay đổi nuc eotide của bộ ba đối mã dẫn đến ảnh hƣởng tới quá trình tổng hợp
protein ty thể v giảm hoạt động của các phức hệ của chuỗi hô hấp [28].
Cũng giống nhƣ nhiều đột biến ảnh hƣởng tới chuỗi hô hấp, đột biến A3243G
không chỉ có ảnh hƣởng tới bệnh MELAS, nó còn ảnh hƣởng tới một số bệnh khác,
gồm CPEO v DMDF (đái tháo đƣờng v điếc)…[36]. Đột biến n y thƣờng ở dạng
không đồng nhất (heterop asmic), có nghĩa

ADN dạng dại và dạng đột biến cùng tồn

tại trong một tế b o. Các biểu hiện lâm sàng của bệnh xuất hiện khi các phân tử ADN
mang đột biến đạt đến một tỷ lệ nhất định. Tỷ lệ này ở các mô và các bệnh khác nhau
khác nhau. Wa ace v cs (2 2) đã xác định đƣợc tỷ lệ không đồng nhất ở trong
máu bệnh nhân mắc bệnh tiểu đƣờng do bị đột biến A3243G ADN ty thể là 10%, trong
khi đó tỷ lệ n y trong mô cơ ho c não ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS có thể tới 70%
[67].
1.3.1.2. Đột biến A3243 và bệnh ung thƣ đại trực tràng
Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh
cơ thần kinh, tiểu đƣờng. Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G
trên bệnh nhân ung thƣ trực tràng. Lorenc v cs (năm 2

3) khi nghiên cứu các đột

biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung
thƣ, đã phát hiện một mẫu ung thƣ trực tr ng có đột biến A3243G dạng đồng nhất
(homoplasmic) [46].


1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể
Cũng giống nhƣ genome nhân, hệ gen ty thể mang những trình tự đa hình. Đa
hình là sự khác biệt về chuỗi ADN giữa những cá thể, các nhóm, ho c các quần thể.
Nó bao gồm đa hình đơn nuc eotide (Sing e nuc eotide po ymorphism - SNP), các
chuỗi l p, thêm đoạn, mất đoạn và tái tổ hợp. Đa hình gen có thể là kết quả của sự thay
đổi quá trình, ho c đƣợc tạo nên bởi yếu tố bên ngoài (nhƣ virus ho c chiếu xạ) [35].
Ngƣời ta cho rằng đa hình giúp ty thể ít nhạy cảm hơn với sự thay đổi năng ƣợng, do
đó tạo nhiều nhiệt và các gốc tự do, giúp con ngƣời thích ứng khi di cƣ tới nơi có khí
hậu lạnh hơn, nhƣ từ châu Phi sang châu Âu [52]. Ngày nay, số ƣợng đa hình đƣợc
biết đến đã vƣợt quá 1000 [22]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy đa hình ở ty thể
có liên quan đến một số bệnh nhƣ: đái đƣờng [34] , bệnh Parkinson [22], Alzheimer
[24], và một số bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ vú [18], ung thƣ tuyến tiền liệt [16], ung thƣ
đại trực tràng [40], ung thƣ phổi [23]…
1.3.2.1. Đa hình A1 398G v các bệnh
Vị trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong hệ genom ty thể ngƣời có tính đa
hình cao. Đa hình này làm biến đổi Threonine (alen A) thành Alanine (alen G) ở đầu C
của dƣới đơn vị ND3 của phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đa hình 1 398A tăng trong các
bệnh thoái hóa thần kinh tuổi gi nhƣ bệnh Parkinson [66], Alzheimer [65], và bệnh
teo cơ xơ cứng [48]. Ngoài ra trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc
đã cho thấy a en G trong thay thế 1 398AG m tăng nguy cơ gây hội chứng chuyển
hóa [34].
A10398G là một trong những SNP thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà
khoa học bởi nó có liên quan với việc tạo thành những khối u. Canter và cs (2005) lần
đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình 1 398A với bệnh ung thƣ vú trên những
ngƣời phụ nữ Mỹ gốc Phi, nhƣng không thấy mối liên hệ nào ở ngƣời Mỹ da trắng.

Các tác giả cho rằng sự tƣơng tác giữa các yếu tố gen v môi trƣờng có thể gây ra sự
khác nhau giữa các tộc ngƣời [18]. Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối
tƣợng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trò của đa hình 1 398A đối với sự phát
triển của ung thƣ vú [55]. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã giải thích sự khác nhau
về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện trong các khu


vực địa lý khác nhau. Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 ngƣời phụ nữ Mỹ gốc
Âu mắc bệnh ung thƣ vú v 26 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G có liên quan với
m tăng nguy cơ ung thƣ vú [12]. Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện
10398G có liên quan với sự phát triển ung thƣ vú trên đối tƣợng
Khi nghiên cứu trên đối tƣợng

ngƣời Ba Lan [25].

ngƣời Mỹ gốc Phi mắc ung thƣ tiền liệt tuyến, ngƣời

ta thấy rằng 1 398G m tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh. Trong một nghiên cứu
khác, 1 398G đƣợc tìm thấy ở bệnh ung thƣ tuyến giáp [74]. Nghiên cứu của Choi và
cs (2 11) đã xác định vị trí 1 398 trên gen ND3

điểm nóng gây đột biến ở bệnh ung

thƣ phổi [23]. Theo trình tự ADN ty thể sửa lại của Cambridge, base kiểu dại là A, tuy
vậy ở nhiều quần thể G lại là kiểu dại [11]. Kết quả của các nghiên cứu về đa hình
A10398G còn nhiều trái ngƣợc v chƣa kết luận đƣợc a en n o có iên quan đến bệnh
lý.
Để giải thích cho những kết quả dƣờng nhƣ trái ngƣợc này, Fang và cs (2010)
cho rằng sự kết hợp giữa đa hình nuc eotide đơn của ADN ty thể với các yếu tố khác
đƣợc mã hóa bởi nhân có thể đóng vai trò trong việc hình thành khối u. Kết quả tiếp

theo có thể là sự thay đổi của tín hiệu calci ho c tín hiệu khử [30]. Ngoài ra, theo một
số nhà nghiên cứu, sự tăng của ROS là một cơ chế mà nhờ đó các SNPs ty thể tham
gia vào quá trình phát triển khối u. Nó có thể hoạt hóa con đƣờng hình th nh ung thƣ,
ho c có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis (chết theo chƣơng trình) vốn đóng vai trò bảo
vệ trong giai đoạn cuối của ung thƣ. Kết quả của sự biến đổi A→G ở vị trí 10398 dẫn
tới sự thay thế threonine bằng alanine ở vị trí 114 thuộc dƣới đơn vị ND3 của phức hệ
I. Phức hệ này có tham gia vào quá trình tạo gốc tự do trong ty thể, cung cấp electron
cho oxy, tạo thành superoxide anion O2-. Sự biến đổi của gen ND3 thuộc phức hệ I có
thể đã

m tăng sự thoát ra của electron và sự tạo th nh ROS. Để hiểu hơn về vai trò

của a en A v G trong đa hình A1 398G, nhóm nghiên cứu của Kazuno (2

6) đã xác

định sự ảnh hƣởng của đa hình ADN ty thể tới giá trị pH của chất nền và sự biến đổi
của calci nội bào. Kết quả nghiên cứu cho thấy cybrid mang đa hình 1 398A có pH
chất nền ty thể thấp hơn cybrid mang 1 398G. Ngo i ra, 1 398A cybrid có nồng độ
ca ci tăng v có thể đạt mức ca ci cao hơn khi bị kích thích bởi histamine so với
10398G [37]. Ngoài ra, threonine có thể tạo liên kết hidro liên kết chéo giữa các chuỗi


protein và dễ dàng chịu sự biến đổi sau dịch mã. Trong khi đó, nguyên tử carbon ở vị
trí α của alanine liên kết với nhóm methyl. Nhóm methyl này không hoạt hóa và gần
nhƣ không tham gia trực tiếp vào chức năng của protein. Tuy vậy, sự thay thế của các
acid amin này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu ở mức độ hóa sinh in vivo.
1.3.2.2. Đa hình ADN ty thể với ung thƣ đại trực tràng
Nghiên cứu về SNPs trên bệnh ung thƣ đại trực tr ng đã đƣợc Lascorz và cs
(2012) thực hiện trên 613 bệnh nhân ở khu vực miền bắc nƣớc Đức [40]. Kết quả cho

thấy có hai SNPs thuộc vùng UQCRB (phức hệ III)là rs7836698 và rs10504961 có
liên quan với khả năng sống sót. Ba SNPs có liên quan với sự tiến triển của bệnh ung
thƣ đại trực tr ng, trong đó hai SNPs thuộc gen COX6B1 (phức hệ IV) là rs6510502
và rs10420252 có liên quan tới sự xuất hiện của hạch lympho, rs6510502 còn liên
quan tới di căn xa. Đa hình rs7971637 trên gen GAPDH có iên quan tới khối u giai
đoạn T3/T4.
Nghiên cứu về đa hình của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng trên
quần thể ngƣời Anh và Scotland cho thấy có 132 SNPs ở quần thể ngƣời Anh và 140
SNPs ở quần thể ngƣời Scotland [61, 71]. Ở quần thể ngƣời Scotland, alen G xuất hiện
cao hơn ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng ở vị trí 750, 1438 (trên gen 12 rRNA),
4769 (trên gen ND2). Ở quần thể ngƣời Anh không quan sát thấy mối quan hệ này.
Cho đến nay, trên thế giới có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình
A10398G với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Fang và cs (2010) khi nghiên cứu các đa
hình đ c trƣng của các nhóm đơn bội (haplogroups) trên 108 bệnh nhân mắc bệnh ung
thƣ vú, đại trực tràng và tuyến giáp ở khu vực miền Nam Trung Quốc đã tìm thấy mối
liên quan giữa các bệnh nhân thuộc nhóm M với tăng nguy cơ mắc ung thƣ vú, thuộc
nhóm D4a với tăng nguy cơ ung thƣ tuyến giáp. Tuy nhiên, các tác giả không phát
hiện đƣợc mối iên quan n o giữa nhóm đơn bội ADN ty thể, trong đó có đa hình
A10398G thuộc nhóm N với sự tiến triển của bệnh ung thƣ đại trực tràng [30]. Mối
liên quan giữa nhóm đơn bội trong quần thể ngƣời Anh và Scotland với bệnh ung thƣ
đại trực tr ng cũng đƣợc phân tích ở các nghiên cứu [61, 71], tuy vậy không phát hiện
đƣợc sự khác biệt n o có ý nghĩa thống kê.


1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh
Các đột biến ADN ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), các
đ c điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất n y đạt đến một
mức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào. Bởi vậy để chẩn đoán đƣợc bệnh
chính xác và kịp thời, ngƣời ta thƣờng sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp ADN ty
thể.

Phương pháp PCR-RFLP
Phƣơng pháp cơ bản v đƣợc sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm
của ADN ty thể là PCR-RFLP. Đây

sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định

đa hình độ d i các đoạn cắt giới hạn (RFLP). Đầu tiên, đoạn ADN ty thể có chứa đột
biến đƣợc nhân lên bằng PCR với c p mồi đ c hiệu. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc cắt
bởi enzym giới hạn thích hợp. Cuối cùng, các đột biến sẽ đƣợc nhận biết qua phổ băng
điện di. Phƣơng pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận lợi, nhanh chóng và
không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền.
Phương pháp giải trình tự
Để khẳng định chính xác đột biến, ngƣời ta phải xác định trình tự nucleotide
đoạn ADN mang đột biến. Nguyên tắc của hầu hết các phƣơng pháp giải trình tự hiện
nay đều dựa trên phƣơng pháp đƣợc Sanger và cộng sự công bố năm 1977, đƣợc gọi là
phƣơng pháp dideoxyribonu eotide (gọi tắt

phƣơng pháp dideoxy). Theo phƣơng

pháp này, một trình tự Sanger giới hạn đƣợc bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi
ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của
mẫu tại vị trí đó. Các mồi o igonuc eotide đƣợc kéo dài nhờ tác dụng của enzyme
ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G,
C trong đó có một loại là di-deoxynuc eotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi. Các
đoạn ngắn ADN mới đƣợc tổng hợp sau đó đƣợc điện di trên gel polyacrylamide, hình
ảnh thu đƣợc sẽ đƣợc dùng để phân tích trình tự ADN. Ng y nay, phƣơng pháp giải
trình tự tự động đƣợc áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhƣng cơ
bản vẫn áp dụng nguyên ý nhƣ trên. Ngƣời ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất
huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ
nhạy rất cao. Ƣu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm

đột biến nhƣ: oại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế

đòi hỏi sản

phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền.
Ngoài ra, tỷ lệ không đồng nhất m phƣơng pháp n y có thể xác định đƣợc khoảng
25% trở lên.
Với mục tiêu phát hiện sớm bệnh ở giai đoạn đầu để điều trị, ngƣời ta sử dụng
một số phƣơng pháp có khả năng phát hiện mức độ không đồng nhất của ADN ty thể ở
một tỷ lệ rất thấp m phƣơng pháp PCR-RFLP không phân tích đƣợc. Đó

phƣơng

pháp PCR định ƣợng (Realtime PCR) và sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính
(DHPLC).
Phương pháp Realtime PCR
Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng
ƣợng ADN đƣợc nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh
quang. PCR định ƣợng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong
mẫu với độ chính xác v độ nhạy cao. Có hai loại phƣơng pháp phân tích hay đƣợc sử
dụng:
-

Phƣơng pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái

lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN,

m cho sợi đôi ADN phát đƣợc ánh

sáng huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
-

Phƣơng pháp sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang. Khi

có m t sản phẩm khuếch đại đ c hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt c p của đầu
dò lên trình tự đ c hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ
ống phản ứng khi nó nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
Phƣơng pháp PCR định ƣợng cho phép định ƣợng đột biến ADN ty thể với mức độ
không đồng nhất thấp dƣới 1% [73].
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)
Phƣơng pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nƣớc trên cơ sở sắc ký lỏng pha
đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại
nhiệt độ tối ƣu. Các mạch ADN đƣợc phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ
xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các c p ghép đôi
không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi