Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Dƣơng Thị Giang

PHÁT HIỆN NGƢỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN
THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. BS Trần Huy Thịnh
2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - Năm 2015


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5
1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21HYDROXYLASE ................................................................................................... 5
1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS ........................................................5
1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS ..........................................6
1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới ................................6
1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam ...............................7
1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh ......................................8
1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS ............................................................9
1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS ............................................................................10

2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS ...... 12
2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS ...............................................................12
2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 .................................................12
2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS .............................13
2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS .......................................................15
2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của ngƣời mang gen dị hợp tử .............16
2.4. Phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh..........................................................17
3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS ........................................................................ 18
3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng .........................................................18
3.1.1. Chẩn đoán xác định ..............................................................................18
3.1.2. Chẩn đoán phân biệt .............................................................................19
3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây
bệnh TSTTBS ....................................................................................................20
3.2.1. Kỹ thuật PCR .......................................................................................20
3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) .....................................21
3.2.3. Kỹ thuật Souther blot ...........................................................................22
3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 22
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 26
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 26

1


2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu .............................................. 26
2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị .........................................................................26
2.2.2. Hoá chất ...................................................................................................26
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................. 28
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu .............................................................................. 28
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 29
2.5.1. Thiết kế nghiên cứu. . ..............................................................................29

2.5.2 Tiến hành xét nghiệm ...............................................................................29
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................... 35
3.1. Kết quả tách chiết DNA ................................................................................. 35
3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện ngƣời lành mang
gen bệnh................................................................................................................. 37
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

2


MỞ ĐẦU

Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham gia
vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp hormon
vỏ thƣợng thận; trong đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất và chiếm
tỷ lệ 90 - 95%, tiếp theo là thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm 5 - 9%, còn lại là các
thể bệnh rất hiếm gặp do thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD),
17α-hydroxylase và 20, 22- desmolase [1].
Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh
di truyền đơn gen lặn, trên nhiễm sắc thể thƣờng do đột biến gen CYP21A2 gây nên.
Đối với thể nặng, nếu bệnh không đƣợc chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn
đến cơn suy thƣợng thận cấp và bệnh nhân có thể tử vong. Các thể bệnh khác có thể
dẫn đến nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; do đó bệnh ảnh hƣởng nặng nề
đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh sản, tâm lý của ngƣời bệnh và gia đình [6].
Sự phát triển và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, giải
trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe
Amplification)… đã phát hiện đƣợc hầu hết các đột biến gen CYP21A2 gây bệnh
tăng sản thƣợng thận bẩm sinh, trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, các

dạng đột biến mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% các
trƣờng hợp [25]. Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy mối tƣơng quan giữa kiểu gen và
kiểu hình của bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh bằng cách xác định các đột biến
đặc trƣng của từng thể bệnh. Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng nhƣ: mất đoạn,
đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm mất
hoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây ra những thể bệnh nặng và hay gặp
ở thể mất muối. Đột biến sai nghĩa nhƣ I172N làm giảm hoạt tính enzym 21hydroxylase chỉ còn 1 - 2% so với bình thƣờng gặp ở thể nam hoá đơn thuần hay
P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase chỉ còn 20 - 50%
so với bình thƣờng gặp ở thể bệnh không điển hình. Xác định chính xác các dạng

3


đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm và có những
biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm những tác động của việc thiếu hụt
enzym 21 - hydroxylase đối với bệnh nhân. Bên cạnh đó việc xác định ngƣời lành
mang gen sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền và chẩn đoán
trƣớc sinh giúp giảm tỷ lệ sinh ra những đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ
sinh để quản lý và chăm sóc tốt những trẻ có nguy cơ cao bị bệnh tăng sản thƣợng
thận bẩm sinh trong cộng đồng.
Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, là
dạng đột biến gây ra thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán chính xác
và kịp thời. Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định bằng các kỹ thuật
PCR thông thƣờng. Gần đây, kỹ thuật MLPA là một phƣơng pháp mới với thời gian
tiến hành ngắn, đơn giản và độ nhạy cao đã phát hiện chính xác các dạng đột biến
này trên gen CYP21A2. Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA vẫn chƣa đƣợc khai thác
nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác định ngƣời lành mang gen gây các
bệnh di truyền. Chính vì vậy nhằm mục đích giúp quản lý tốt ngƣời mang gen và
cung cấp những thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền và chẩn đoán trƣớc sinh,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản

thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu:
Phát hiện ngƣời mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình
bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH.

4


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE

1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS
Bệnh tăng sản tuyến thƣợng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh
dục- thƣợng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thƣờng, do sự thiếu hụt
các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận. Trong đó, sự
thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%,
tiếp đến là sự thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroid
dehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) và ít gặp hơn là sự thiếu hụt
20 - 22 desmolase [35].
Sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase dẫn đến sự tổng hợp cortisol và phần
lớn aldosterron của tuyến thƣợng thận bị suy giảm, gây tăng tiết Adreno
Corticotropin Hormon (ACTH) tuyến yên, tăng sản vỏ thƣợng thận và sản xuất thừa
androgen.
Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ở
các mức độ nặng hay nhẹ khác nhau. Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase
gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thƣợng thận cấp và
cƣờng androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 - 3%) sẽ biểu
hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cƣờng androgen và khi enzym 21hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) sẽ xuất hiện thể bệnh không cổ điển [15].

5


1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS
1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới
Theo y văn, trƣờng hợp bệnh TSTTBS đầu tiên trên thế giới đƣợc mô tả bởi
nhà giải phẫu học De Crecchico vào năm 1865.
Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phân
biệt vỏ và tủy thƣợng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thƣợng thận
và tuyến sinh dục [8]. Bệnh nhân TSTTBS thể mất muối đầu tiên đƣợc Butler
(1939) và Wilkins (1940) mô tả. Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter và cộng sự đã
chứng minh rằng việc sử dụng cortisol có thể ức chế sự tổng hợp thừa androgen
trong hội chứng sinh dục - thƣợng thận do TSTTBS [9]. Trong giai đoạn này, các
nhà nghiên cứu đã xác định 6 steroid vỏ thƣợng thận có tác dụng sinh học, chúng
đƣợc tổng hợp từ cholesterol và đƣợc chia thành 3 nhóm: (i) Steroid chuyển hóa
muối gồm DOC, corticosteron và aldosteron; (ii) Steroid chuyển hóa đƣờng gồm
hydrocortisone,

cortisol;

(iii)

Steroid

sinh

dục

nam

(androgen)

gồm

dehydroepiandrosteron và androstendion [10].
Từ những năm 1970, nghiên cứu và định lƣợng 17- OHP, một tiền chất trực
tiếp tạo ra cortisol, đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh TSTTBS. Năm
1979 - 1980, Migeon và Rosenwaks hoàn chỉnh tiêu chuẩn chẩn đoán hóa sinh của
bệnh TSTTBS: do thiếu enzym 21- OH gây tích tụ các tiền chất trƣớc chỗ ứ đọng
chuyển hóa bao gồm 17- OHP và progesteron, dẫn đến tăng tổng hợp testosteron ở
vỏ thƣợng thận, nồng độ testostrron trong máu tăng và sản phẩm đào thải của
testosteron trong nƣớc tiểu là 17- Cetosteroid (17-CS) tăng. Nồng độ 17- OHP tăng
cao trong máu là tiêu chuẩn có giá trị đặc hiệu để chẩn đoán TSTTBS thể thiếu
enzym 21- OH.
Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã đƣợc nhận biết từ những năm 1930
và đƣợc mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen lặn,
nằm trên nhiễm sắc thể thƣờng. Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và sự liên
kết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC). Sau đó,
Komainami phân lập đƣợc Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn. Năm 1982 -

6


1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự liên quan giữa gen CYP21 với MHC
nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37].
Năm 1984, Hite và cộng sự đã xác định đƣợc gen CYP21A2 và giả gen
CYP21A2P có kích thƣớc 3,4 kb; nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bên
trong phức hợp MHC cùng với các gen C4 bổ thể [27].
Năm 1986, Higashi và cộng sự đã phân tích trình tự nucleotid toàn bộ gen
CYP21A2 và giả gen CYP21A2P. Sau đó, các đột biến điển hình của gen

CYP21A2 đã đƣợc tìm thấy, chúng đƣợc coi là nguyên nhân chính gây thiếu hụt
enzym 21- OH [23].
Phƣơng pháp lai Southern blot do Edward Southern đề xuất năm 1975 đã
đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen CYP21A2
thƣờng gặp [24].
Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân tử
khác nhƣ giải trình tự gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS
đã đƣợc phát hiện [26].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam
Ở nƣớc ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS. Các công
trình nghiên cứu có thể kể đến nhƣ:
Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc hội
chứng sinh dục - thƣợng thận trong giai đoạn 1981 - 1990, chiếm tỷ lệ 1,9% tổng số
bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [9].
Năm 1994, nhóm nghiên cứu Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn đã
tổng kết chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS. Chẩn đoán dựa vào lâm sàng và xét
nghiệm hóa sinh progesteron, testosteron, cortisol, Follice Stimulating Hormon
(FSH), Luteinizing Hormon (LH), điện giải đồ, 17 Cetosteroid (17- CS) và 17 –
Hydroxycetosteroid (17- OHCS); điều trị bệnh bằng prednisolone và nƣớc muối
đƣờng với thể mất muối [8].
Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ và cộng sự công bố nghiên cứu chẩn đoán và
điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại

7


Bệnh viện Nhi Trung ƣơng 1989 - 1997. Nghiên cứu đƣa ra các dấu hiệu lâm sàng
và giới hạn giá trị của 17- OHP, progesteron và testosteron giúp chẩn đoán và sử
dụng Hydrocortison và Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả
đã sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [3].

Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnh
nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7].
Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh
nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hƣởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia
đình và bệnh nhân [2].
Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen
CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH và phát hiện ngƣời lành
mang gen bệnh [4].
Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một
số yếu tố ảnh hƣởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ƣơng
nhận thấy bệnh gây ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao [1].
Nhìn chung, ở Việt Nam những nghiên cứu về lâm sàng và ảnh hƣởng tâm lý
của gia đình và bệnh nhân là phổ biến, chƣa có nhiều nghiên cứu về bệnh học phân
tử bệnh TSTTBS.
1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh
Tần suất mắc bệnh trên thế giới là 1/10.000 - 1/15.000. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất
ở hai quần thể ngƣời Eskimo Yupik (Alaska) và La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282
và 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu là 1/14.000 [28].
Một nghiên cứu của Nhật tại thành phố Sapporo năm 1982 - 2005 đƣa ra tỷ
lệ mắc bệnh TSTTBS là 1/19.634 và tỷ lệ các kiểu hình theo thứ tự thể MM : thể
NHĐT : thể không điển hình là 16 : 4 : 2.
Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ đƣợc chẩn đoán mới, chiếm tỷ
lệ 60,7% các bệnh lý tuyến thƣợng thận và chiếm 2% các bệnh lý di truyền vào điều
trị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17].

8


Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH trên thế giới
Tên nƣớc

STT

Tần suất

1

Alaska,Yupik Eskimos

1/ 280

2

Pháp (đảo Reunion)

1/2100

3

Thụy Điển

1/9800

4

Mỹ ( Bang Wisconsin)

1/11.000

5

Pháp ( thành phố Lille)

1/13.000

6

Nhật

1/18.000

7

Ý

1/18.000

1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS
Khi thiếu enzym, một hay nhiều con đƣờng tổng hợp hormon bị tắc nghẽn và
hormon dƣới chỗ tắc không đƣợc sản xuất đủ, đặc biệt là cotisol. Cơ chế điều hòa
ngƣợc (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH, gây tăng sản
tuyến thƣợng thận, kích thích các tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26].

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym [35]
Thiếu hụt enzym 21-OH sẽ gây giảm tổng hợp cortisol, tăng các tiền thân
của cortisol nhƣ 17- hydroxyprogesteron (17-OHP) và progesteron, tăng các
hormon sinh dục vỏ thƣợng thận nhƣ dehydroepiandrosterone (DHEA), D4

9

androstenedion và testosteron (T) gây nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai.
Trong khi đó việc thiếu hoàn toàn enzym 21-OH gây giảm aldosteron làm mất natri
qua nƣớc tiểu, giảm khối lƣợng tuần hoàn (hội chứng mất muối) [35].
1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS
Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt
aldosteron cũng nhƣ thừa androgen thƣợng thận. Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt
của 21- OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS đƣợc chia thành 3 thể khác nhau
bao gồm:
 Thể mất muối
Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể cổ điển sẽ dẫn đến suy giảm
trầm trọng khả năng hydroxyl hóa để chuyển progesterone thành 11deoxycorticosteron, do đó không thể tổng hợp đầy đủ aldosteron và cortisol trong
máu. Ngoài ra, các tiền chất steroid trƣớc chỗ tắc đƣợc tích lũy tăng cao là
progesteron và 17- OHP có thể hoạt động nhƣ là các chất đối kháng trực tiếp các
thụ thể hormon chuyển hóa muối và làm tình trạng thiếu aldosteron trầm trọng hơn
[26].
Dấu hiệu xuất hiện sớm là nôn, tiêu chảy dẫn đến mất muối, mất nƣớc và sụt
cân. Nếu không đƣợc điều trị, cơn suy thƣợng thận nhanh chóng nặng lên với các
dấu hiệu mắt trũng, da nổi vân tím, trụy tim mạch và có thể ngừng tim do kali máu
tăng cao dẫn đến tử vong.
Dấu hiệu nam hóa là do tăng testosteron:
+ Ở trẻ gái, ngay khi đẻ xuất hiện âm vật to, có khi to nhƣ dƣơng vật, các
môi có thể dính với nhau nhiều hay ít, lỗ niệu đạo có thể ở ngay dƣới âm vật, làm
cho dễ chẩn đoán nhầm với tật lỗ đái thấp. Nếu không đƣợc điều trị, biểu hiện nam
hóa ngày càng rõ: trẻ mọc lông mu, lông nách, trứng cá, cơ bắp phát triển, lớn
nhanh nhƣng trẻ sẽ lùn ở tuổi trƣởng thành và đạt chiều cao tối đa khoảng 140 
150 cm, hình dáng đàn ông, vai rộng, hông hẹp, tuyến vú kém phát triển kèm theo
rối loạn kinh nguyệt [26].

10

+ Ở trẻ trai, biểu hiện giả dậy thì sớm: mọc lông mu, lông nách, mọc trứng cá,
giọng trầm, dƣơng vật to nhanh và cƣơng cứng, nhƣng tinh hoàn vẫn nhỏ tƣơng ứng
với tuổi thực của trẻ. Chiều cao và tuổi xƣơng phát triển nhanh và mạnh, kết thúc
sớm khi trẻ khoảng 8  10 tuổi [26].
 Thể nam hóa đơn thuần
Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- OH mức độ vừa phải (1 - 3%), quá trình tổng
hợp cortisol và aldosteron vẫn xảy ra.
Ở trẻ gái, biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài (giả lƣỡng tính). Do rối
loạn tổng hợp các steroid xảy ra sớm từ giai đoạn bào thai vào tuần thứ 7- 8 của thai
kỳ nên biểu hiện nam hóa thƣờng ngay sau sinh: âm vật to, môi lớn dính vào nhau,
lỗ niệu đạo ở ngay dƣới âm vật..., sau đó các biểu hiện nam hóa ngày càng rõ nếu
trẻ không đƣợc điều trị sớm.
Ở trẻ trai, thƣờng ít có biểu hiện nam hóa lúc đƣợc sinh ra (cƣờng androgen).
Cũng nhƣ trẻ gái, biểu hiện cƣờng androgen ở trẻ nam diễn ra nhanh bắt đầu từ 2- 3
tuổi gồm các dấu hiệu dậy thì sớm nhƣ mọc lông mu, lông nách, sau đó mọc trứng
cá và giọng trầm. Dƣơng vật to nhanh, thƣờng cƣơng cứng, tinh hoàn nhỏ so với
tuổi [8], [26].
 Thể không cổ điển
Đây là thể nhẹ nhất, hoạt độ enzym 21-OH chỉ giảm nhẹ, còn khoảng 2050% so với bình thƣờng và nồng độ androgen máu tăng nhẹ nên không đủ gây nam
hóa ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai sau sinh.
Bệnh xuất hiện muộn, triệu chứng xuất hiện ở tuổi dậy thì và thƣờng đƣợc
phát hiện ở nữ do nồng độ androgen cao hơn bình thƣờng, còn ở nam giới, ảnh
hƣởng này không đáng kể vì ở lứa tuổi này, nồng độ testosterol đã tăng bài tiết. Trẻ
em nữ sẽ có biểu hiện: tuyến vú kém phát triển, mọc trứng cá, rậm lông, rối loạn
kinh nguyệt, thiểu kinh và có thể vô kinh [8], [26].

11

2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS
2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS
2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21
Vị trí gen CYP21
Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng
nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST số
6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ với
hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ thể
[18], [40].

Hình 1.2. Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19]

Cấu trúc gen CYP21
Gen mã hóa cho enzym 21- OH của vỏ thƣợng thận là gen CYP21A2, có kích
thƣớc 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene),
CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong vùng phức hợp
hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-MAC) (cạnh gen HLA).
Gen CYP21A2 và gen tƣơng đồng của nó, CYP21A2P, nằm xen kẽ với hai gen mã
hóa cho bổ thể C4A và C4B. Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A2P bao gồm 10 exon
trình tự nucleotide của hai gen này tƣơng đồng 98% trong các exon và khoảng 96%
trong các intron do vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biến
mất đoạn giữa hai allen hoặc nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu
trúc của gen CYP21A2 bị thay thế một đoạn của giả gen CYP21A2P hoặc gây mất

12


đoạn của gen CYP21A2P. Các thay đổi này gây nên sự bất hoạt của gen CYP21A2
bình thƣờng và gây nên tình trạng bệnh lý [26],[41].

Hình 1.3. Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [18]
Chức năng gen CYP21
Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò phiên
mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các intron nối
chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử này sẽ
đƣợc sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [20].
2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS
Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự tƣơng đồng nhau. Trình tự
của gen giả CYP21A2P có các loại đột biến thƣờng thấy trên bệnh nhân
TSTTBS. Điều này có thể giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt
chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới việc các trình tự ở vùng
gen giả CYP21A2P chuyển sang CYP21A2 gây nên đột biến gen CYP21A2.
Theo thống kê, 95% các đột biến trên gen CYP21A2 là do chuyển đoạn từ gen
giả CYP21A2P, 5% còn lại là do gen CYP21A2 bị đột biến. Các đột biến thƣờng
gặp trên gen CYP21A2 là xóa đoạn hoặc chuyển đoạn lớn (Large
deletion/convertion), IVS- 13A/C → G, I172N. Ngoài ra còn có các đột biến
Q138X, R365W, R473W, P30L, del- 8 bp cũng có tỷ lệ tƣơng đối cao [28].

13


Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [4],[35],[39]
Đột biến

Vị trí nucleotide

Exon/Intron

Mất đoạn gen

Tỷ lệ %

Kiểu hình

25-30

MM

Pro30Leu

89C→T

exon 1

5-10

KCĐ

I2g

656A/C→G

I2

20-25

MM- NHĐT

Mất 8bp

∆708-715

E3

5-10

MM

Ile 172Asn

1001T→A

E4

5-10

NHĐT

Ile236Asn,

1382T→A,

E6

5-10

MM

Val237Glu,

1385T→A,

Met239Lys

1391T→A

Val281Leu

1685G→T

E7

5-10

KCĐ

Phe306+1nt

1759+T

E7

<5

MM

Gln318Stop

1996C→T

E8

5-10

MM

Arg356Trp

2110C→T

E8

10

MM

Các nucleotid được đánh số bắt đầu từ nucleotid A trong mã ATG đầu tiên của
trình tự mã hóa. Các intron cũng được tính.
 Mất đoạn và chuyển đoạn gen lớn 30kb
Thông thƣờng các mất đoạn có chiều dài khoảng 30kb từ vị trí giữa exon 3 và 8 của
gen CYP21A2P xuyên qua gen C4B đến vị trí tƣơng ứng ở trên gen CYP21A2. Kết
quả là gen đơn CYP21A2 còn lại với đầu tận cùng 5’ tƣơng ứng CYP21A2P và đầu
3’ tƣơng ứng CYP21A2. Mất đoạn ngăn cản sự tổng hợp protein và phá hủy tất cả
hoạt tính enzym 21- hydroxylase [25]. Trao đổi chéo không tƣơng xứng có thể xảy
ra bất cứ vị trí nào bên trong đơn vị RCCX (kích thƣớc 30 kb) bao gồm gen RP, C4,
CYP21A2, TNX và tạo nên các nhiễm sắc thể có 1 hoặc 3 bản sao đơn vị 30 kb này.
Các vị trí trao đổi chéo nằm trong hay ở đầu 3’ của CYP21A2 gây thiếu hụt enzym
21- hydroxylase.

14


 Đột biến mất đoạn 8 bp trên exon 3
Đột biến mất đoạn 8 bp trên exon 3 (có trình tự GAGACTAC) xuất hiện do
quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp NST dẫn
tới việc các trình tự vùng giả gen sẽ chuyển sang gen CYP21A2 gây nên hiện tƣợng
lệch khung dịch mã và làm ngừng quá trình dịch mã sớm. Kết quả là không tổng
hợp đƣợc enzym 21-OH và theo cơ chế đã trình bày ở trên, gây nên thể mất muối
trên lâm sàng [24]. Hoạt tính enzym 21-OH trong đột biến mất 8 bp trên exon 3 đã
đƣợc chứng minh trên thực nghiệm là 0% [35].
2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS
TSTTBS do thiếu enzym 21- OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm
trên NST thƣờng nên tuân theo quy luật di truyền Mendel. Bệnh chỉ xảy ra ở ngƣời
mang đồng hợp tử gen lặn.
Aa

Aa

AA

Aa

aa

(25%)

(50%)

(25%)

Hình 1.4. Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường
Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ. Thƣờng gặp bệnh
xuất hiện trong cùng một thế hệ. Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh là nhƣ nhau.
+ Nếu cha mẹ là hai dị hợp tử (Aa x Aa) khả năng con bị bệnh (aa) là 25%,
con dị hợp tử (Aa) mang gen lặn là 50%, con bình thƣờng hoàn toàn (AA) là 25%.
Trong quần thể trƣờng hợp này hay gặp nhất.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là ngƣời bình thƣờng (AA) kết hôn với ngƣời mang gen
dị hợp tử (Aa) thì khả năng sinh ra con bình thƣờng (AA) là 50%, con bị dị hợp tử
(Aa) là 50%.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là ngƣời bình thƣờng kết hôn với ngƣời bị bệnh (aa) thì
khả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Aa) là 100%

15


I AA

II

AA

Aa

AA

III

aa

aa

AA AA Aa

Aa

Aa

AA

AA

AA

Aa

Aa

Aa

Aa

AA

AA

Aa

aa

Aa

Aa

Hình 1.5. Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường
(Autosome Recessive)
Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh.
Đặc điểm của bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thƣờng là có ngƣời lành
mang gen bệnh, với kiểu hình là ngƣời hoàn toàn bình thƣờng, khỏe mạnh nhƣng
khi xây dựng gia đình với ngƣời mang gen bệnh và sinh con thì truyền bệnh cho con
theo tỷ lệ phân ly gen bệnh của qui luật Mendel. Bệnh truyền từ thế hệ này sang thế
hệ khác.
Tần xuất ngƣời mang gen bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là 1/60 tùy
thuộc vào chủng tộc. Tần số đột biến tự nhiên mới phát sinh cần có cả hai đột biến
về cùng một gen ở cả hai bên bố mẹ nên xác xuất xảy ra vô cùng nhỏ. Sự kết hôn
trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bị bệnh và
tăng tần số ngƣời mang gen bệnh lặn trong quần thể [3],[19],[32].
2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của ngƣời mang gen dị hợp tử
Về mặt xét nghiệm, ngƣời mang gen dị hợp tử chứa các đột biến gen
CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thƣợng thận cao
hơn những ngƣời bình thƣờng không mang gen [19], [26].

Chẩn đoán bệnh dựa vào lâm sàng và xét định lƣợng nồng độ 17- OHP,
testosteron, xét nghiệm tìm đột biến gen CYP21A2. Trong đó, nồng độ 17OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất để tổng hợp enzym

16


21- OH nên giá trị 17- OHP tăng sớm và tăng cao ở trên bệnh nhân và ngƣời mang
gen, ngƣời ta còn ứng dụng giá trị này để làm sàng lọc chẩn đoán sớm bệnh ở các

nƣớc phát triển [1].
2.4. Phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh
Ngƣời mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính
trạng ra ngoài. Ngƣời mang gen bệnh thƣờng có dấu hiệu về lâm sàng hoặc sinh học
nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng
phƣơng pháp sinh hóa. Định lƣợng 17- OHP cho những ngƣời là thành viên của gia
đình ngƣời bệnh, với 17- OHP < 300 ng/ml thì là bình thƣờng và 17- OHP > 300 1499 ng/ml đƣợc chứng minh là dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng
corticotropin (Lee HH el al 2000). Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typ
HLA, nên có thể xác định đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện ngƣời lành mang
gen bằng cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và
tế bào ối thai nhi hoặc đối tƣợng có nguy cơ cao. Nếu kết quả typ HLA giống nhau
và có thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH hoặc ngƣời lành
mang gen với độ tin cậy cao [4], [19].
Nồng độ
17-OHP sau
nghiệp pháp

kích thích
ACTH

Nồng độ 17OHP ng/dl

Hình 1.6. Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh
và người mang gen dị hợp tử [36].
Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc ngƣời mang gen đƣợc tiến hành ở gia
đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để quản lý
ngƣời mang gen và ngƣời bệnh. Qua sàng lọc này để có thể đƣa ra lời khuyên di

17

truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn trong cùng dòng họ cũng nhƣ tránh kết
hôn giữa những ngƣời mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc giữa ngƣời mang gen bệnh
với ngƣời bị bệnh (Aa x aa). Nếu kết hôn giữa các đối tƣợng có nguy cơ cao thì cần
phải đƣợc tƣ vấn, quản lý thai nghén về phƣơng diện di truyền và làm sàng lọc sơ
sinh [4].
3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS
3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng
3.1.1. Chẩn đoán xác định
- Định lƣợng 3 sản phẩm cuối cùng của hormon vỏ thƣợng thận:
Aldosteron, cortisol, và testosteron; 3 chất chuyển hóa trong nƣớc tiểu là 17- CS,
17- OHCS, pregnanetriol. Các xét nghiệm này không đặc hiệu bởi vì những thay
đổi nồng độ các chất chuyển hóa trên có thể gặp trong u tuyến yên và u vỏ
thƣợng thận [27], [28].
- Định lƣợng 17- OHP: 17- OHP là chỉ số đặc trƣng để chẩn đoán TSTTBS
do thiếu enzym 21- OH và tăng nồng độ trong máu hoặc tăng nồng độ qua nghiệm
pháp ACTH [28].
Chẩn đoán TSTTBS sớm trong giai đoạn sơ sinh:
+ Trẻ sơ sinh có triệu chứng nôn nhiều, nhất là từ 2- 3 tuần tuổi.
+ Trẻ có bộ phận sinh dục ngoài không rõ ràng, không sờ thấy tinh hoàn.
+ Điện giải đồ: natri máu giảm, kali máu tăng.
+ Nồng độ 17- OH tăng.
Chẩn đoán TSTTBS ở trẻ lớn:
+ Trẻ trai 2-3 tuổi có các dấu hiệu dậy thì sớm giả, dƣơng vật phát triển nhanh.
+ Trẻ gái 2-3 tuổi có âm vật phì đại nhanh nhƣ dƣơng vật, không có tinh hoàn.
+ Cả 2 giới: Chiều cao tăng nhanh, có lông mu, trứng cá, phát triển cơ bắp.
+ Xét nghiệm: Định lƣợng 17- OHP tăng cao, testosteron tăng, FSH và LH giảm.
+ Xét nghiệm nhiễm sắc thể để xác định giới tính.

18

3.1.2. Chẩn đoán phân biệt
- Dậy thì sớm thật đồng giới, trẻ trai có tinh hoàn phát triển cùng với dƣơng
vật, thể tích tinh hoàn > 4 ml. Nồng độ FSH và LH tăng cao, không có các rối loạn
hormon khác.
- Dậy thì sớm giả khác giới ở trẻ gái do u thƣợng thận nam hóa (Carcinome).
U thƣờng lớn 3- 6 cm. Phát hiện u nhờ các chẩn đoán hình ảnh. 17- CS nƣớc tiểu
tăng cao. Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tƣơng tăng. 17- OHP máu không
tăng. Khi làm test ức chế bằng dexamethason, nồng độ DHEA huyết tƣơng và nồng
độ 17- CS niệu đều không giảm, giúp chẩn đoán phân biệt với TSTTBS [28].
- U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tƣơng và 17- CS niệu
không tăng.
- Buồng trứng đa nang: Nguyên nhân thƣờng gặp nhất do tăng tiết androgen
do buồng trứng, triệu chứng nam hóa ít gặp. Hay gặp nhất là triệu chứng rậm lông,
bệnh nhân có thể mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp glucose. FSH và LH
tăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tƣơng tăng cao [28].
* Các đối tƣợng cần đƣợc xác định ngƣời mang gen, tƣ vấn di truyền và chẩn
đoán trƣớc sinh với bệnh TSTTBS:
+ Những bà mẹ đã đƣợc phát hiện là dị hợp tử mang gen đột biến CYP21A2
khi mang thai cần đƣợc chẩn đoán trƣớc sinh.
+ Các bà mẹ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH
có thai cần thiết chẩn đoán trƣớc sinh.
+ Các bà mẹ mang thai mà trong gia đình nội, ngoại có cô, chú, bác ruột, cậu
ruột, dì ruột, bị bệnh thì cũng cần thiết chẩn đoán trƣớc sinh.
+ Các anh, chị em họ bị bệnh cùng thế hệ với thai nhi.

19

3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây
bệnh TSTTBS
3.2.1. Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Enzym
Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn mạch đơn làm khuôn để
tổng hợp nên sợi DNA mới bổ sung và cần phải có các mồi oligonucleotid để khởi
đầu quá trình tổng hợp.
Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và điều hòa bởi nhiệt độ:
- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA đƣợc biến tính ở
nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thƣờng là 94oC - 95oC trong
vòng 30 giây - 1 phút.
- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ đƣợc hạ thấp dƣới nhiệt độ
nóng chảy Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn DNA
khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA
polymerase bền với nhiệt sẽ đƣợc hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo mồi, thƣờng
nhiệt độ khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc vào kích thƣớc và Tm của các mồi sử dụng
và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ đƣợc tăng
lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ
thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi đôi mới đƣợc tạo thành sẽ tiếp tục đƣợc dùng làm
DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong các chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm
cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng
cách giữa hai đoạn gen mồi, hai đầu tận cùng của sản phẩm đƣợc xác định bởi đầu
tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [13].
Giống nhƣ nhiều bệnh lý di truyền, PCR đƣợc sử dụng rộng rãi để khuếch
đại gen CYP21A2 xác định các đột biến xoá đoạn và phối hợp với các kỹ thuật sinh

20


học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu. Tuy nhiên do gen giả CYP21A2P
có tính tƣơng đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2
không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với gen
CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22].

Hình 1.7. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR
3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing)
Đoạn DNA cần giải trình tự đƣợc sử dụng nhƣ trình tự mẫu cho phản ứng
khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của cả deoxynucleotid và
dideoxynucleotid đƣợc sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các
dideoxynucleotid sẽ gắn vào vị trí mà các deoxynucleotid thƣờng gắn trên đoạn
DNA đang đƣợc tổng hợp. Sự gắn các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình
kéo dài các DNA đƣợc tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích

21


thƣớc khác nhau. Nucleotid tận cùng trên các sợi DNA có thể đƣợc xác định bằng
cách chạy đồng thời 4 phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại
dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn
hợp nhƣng từng loại dideoxynucleotid đƣợc đánh dấu bằng các chất huỳnh quang
đặc hiệu khác nhau. Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn đƣợc
phân tách bằng điện di trên gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt
đƣợc các sợi đơn DNA kém nhau 1 nucleotid. Trình tự các nucleotid đƣợc xác định
tƣơng ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid [12].
3.2.3. Kỹ thuật Souther blot
Souther blot là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện đột

biến xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn… Đây là phƣơng pháp mất nhiều thời gian
và công sức nhƣng lại rất hiệu quả. Các đoạn dò DNA đặc hiệu đƣợc sử dụng để
phát hiện đoạn gen CYP21A2 sau khi DNA đƣợc cắt bằng enzym giới hạn, điện di
trên gel agarose và đƣợc biến tính trên màng nilon hay nitrocellulose, màng đã đƣợc
lai với đầu dò đƣợc xác định nhờ film có độ nhạy đặc biệt với phóng xạ. So sánh kết
quả lai giữa ngƣời bình thƣờng và ngƣời bệnh để có thể xác định đƣợc vị trí đột
biến [12], [13].
3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification)
Nguyên tắc của MLPA là sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả năng lai
đặc hiệu với các phân tử DNA đích. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotid dài và
ngắn [32].
+ Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:
 Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai với
DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 2130 nucleotid nằm ở
đầu 3’ của probe.
 Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của
đoạn này giống nhau cho các probe. Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đại
probe khi tiến hành phản ứng PCR [32].

22


Biến tính

PCR

Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản
phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích

Hình 1.8. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

+ Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:
 Đoạn 1’ chứa 25  43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’.
 Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho các
probe. Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe.
 Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’ và
2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu với
DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác nhau ở các
probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do đó, sản phẩm
khuếch đại của các probe sẽ đƣợc phân tách bằng điện di.
Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnh
tƣơng ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra trong kỹ
thuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của ngƣời bình thƣờng, chạy song song
cùng mẫu bệnh nhân để so sánh [32].
Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ đƣợc khuếch đại thành nhiều bản sao. Các
probe khác nhau sẽ có kích thƣớc khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác
nhau. Do vậy, chúng sẽ đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp điện di (thƣờng sử dụng

23


phƣơng pháp điện di mao quản). Số lƣợng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe sẽ tỷ
lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó [32].
Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sử
dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này
bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tƣơng đƣơng với
các đột biến mất đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn
bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ
thể (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trƣng cho gen của ngƣời cũng đƣợc sử
dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác
định giới tính. Vị trí và kích thƣớc của các probe đƣợc mô tả nhƣ bảng 1.3.

Bảng 1.3. Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR
trong Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland)

STT

Tên probe

Vị trí của probe
trên gen

Kích thƣớc

X chromosome

100

C4B Exon 19

154

Exon 3

172

C4A Exon 26

178

(bp)

1

X-fragment

2

C4B probe 02357-L02586

3

CYP21A2 probe 01974-L01507

4

C4A probe 04802-L04177

5

CYP21A2 probe 04804-L04179

Exon 1

202

6

CYP21A2 probe 01975-L01508

Exon 4

210

7

CYP21A2 probe 01976-L01509

Exon 6

229

8

UTY probe 01071-L00464

Yq11

240

9

CYP21A1P probe 04805-L04180

5’ exon 1

265

10

CYP21A2 probe 05477-L04895

Exon 8

283

11

CYP21A1P probe 04807-L04182

Exon 10

352

12

CYP21A1P probe 04806-L04181

Intron 2

382

24