Hoạt tính của protease kim loại (MMP 2, MMP 9) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật (tóm tắt trích đoạn)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Ngọc Anh

HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9)
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Ngọc Anh

HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9)
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái
TS Đỗ Minh Hà

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trịnh Hồng Thái, người
thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập,
thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn với những ý kiến đóng góp quý báu của TS.
Đỗ Minh Hà trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự
giúp đỡ rất nhiều của ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan
Phương và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. BS. Phạm Mạnh Cường cùng Khoa Tế
bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103 và đồng cảm ơn tới Khoa Xét nghiệm
và Sàng lọc máu Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương vì đã cung cấp mẫu
những mẫu bệnh phẩm và đối chứng quý giá trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công
nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp
đỡ tôi về trong suốt quá trình làm luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và
luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 02 năm 2017
Học viên

Hoàng Ngọc Anh

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... ii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chương 1 -

TỔNG QUAN .....................................................................................3

1.1.

Khái quát về ung thư đại trực tràng .................................................3

1.1.1. Ung thư đại trực tràng .................................................................3
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ.4
1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng ..................................................6
1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật...............................................................9
1.2.

Tổng quan về các MMP ...................................................................9

1.2.1. Matrix Metalloproteinases ..........................................................9
1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) ...........................12
1.2.3. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase ..................................13
1.3.
Chương 2 -

Tình hình nghiên cứu MMP trong ung thư đại trực tràng .............16
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................21

2.1.

Nguyên liệu ....................................................................................21

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................21
2.1.2. Thiết bị ......................................................................................21
2.1.3. Hóa chất ....................................................................................21
2.2.

Phương pháp ..................................................................................22

2.2.1. Tách chiết protein tổng số từ mẫu mô ......................................23
2.2.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford ........24
2.2.3. Điện di xác định hoạt tính enzyme MMP trên gel
polyacrylamide .................................................................................................25


2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di bằng phần mềm Image J ....27
2.2.5. Phân tích, đánh giá kết quả .......................................................28
Chương 3 -

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................29

3.1. Xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có SDS có bổ
sung cơ chất gelatin ..............................................................................................29
3.2.

Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu mô và huyết tương

của bệnh nhân ung thư đại trực tràng....................................................................33

3.2.1. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 theo vị trí mô ........................33
3.2.2. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 trong huyết tương .................36
3.3. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 theo một số đặc điểm bệnh học
của bệnh nhân ung thư đại trực tràng....................................................................40
KẾT LUẬN ...............................................................................................................46
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................48
PHỤ LỤC .................................................................................................................... i


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS

Ammonium persunfate

CA

Kháng nguyên ung thư (Cancer antigen)

CBB

Coomassie Brilliant Blue

CEA

Kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcinoembryonic antigen)

Cs

Cộng sự

ECM

Chất nền ngoại bào (Extracellular Matrix)

ELISA

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme
(Enzyme-linked immunosorbent assay)

MMP

Proteinase kim loại trong chất nền ngoại bào
(Matrix Metalloproteinase)

OD

Mật độ quang (Optical density)

RT-PCR

Phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược
(Reverse transcription polymerase chain reaction)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Điện di trên gel polyacrylamide có SDS
(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

TIMP

Chất ức chế của MMP
(Tissue Inhibitors of Metalloproteinase)

TNM

Kích thước khối u - Hạch vùng - Di căn
(Tumor - Node - Metastasis)

UTĐTT

Ung thư đại trực tràng

UTVMH

Ung thư vòm mũi họng

i


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm .............................9
Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính ...........10
Bảng 1.3. Chức năng của một số MMP ....................................................................14
Bảng 2.1. Thành phần bản gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung cơ chất ......26
Bảng 3.1. Tần suất biểu hiện hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu mô và

huyết tương của 37 bệnh nhân UTĐTT ....................................................................30
Bảng 3.2. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 trong mô T, LCU và U của
bệnh nhân UTĐTT, n=37 ..........................................................................................33
Bảng 3.3. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 trong huyết tương của 37
bệnh nhân UTĐTT và đối chứng ..............................................................................37
Bảng 3.4. Sự khác biệt hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và -9 tại mô u so với
T theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT .......................................41

ii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo đại trực tràng .................................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP .....................................................................11
Hình 1.3. Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP ..........................................................................13
Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện nghiên cứu MMP-2 và MMP-9 .......................23
Hình 3.1. Hình ảnh điện di xác định hoạt tính enzyme trên bản gel polyacrylamide
có SDS, có gelatin ở mẫu mô (T, LCU và U) và huyết tương (HT-1, HT+1, HT+3
và HT+7) của bệnh nhân #10, và mẫu đối chứng. ....................................................29
Hình 3.2. Hoạt tính gelatinase trong mẫu mô của một số bệnh nhân UTĐTT .........31
Hình 3.3. Biểu diễn băng hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu huyết
tương của một số bệnh nhân, đối chứng và giá trị chuẩn hóa của chúng .................32
Hình 3.4. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 ở các mẫu huyết tương của
bệnh nhân UTĐTT ....................................................................................................38
Hình 3.5. Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của proMMP-9 giữa U-T của bệnh nhân
UTĐTT theo mức độ xâm lấn và độ biệt hóa ...........................................................42
Hình 3.6. Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của proMMP-2 giữa HT+7 so với HT-1 và
proMMP-9 giữa HT+3 so với HT-1 theo mức độ xâm lấn và hạch di căn tương ứng
của bệnh nhân UTĐTT..............................................................................................43

iii


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

MỞ ĐẦU
Theo báo cáo của Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Thế giới (International agency
for research on cancer, IARC), năm 2012, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại
ung thư phổ biến thứ 4 trên toàn thế giới và đứng thứ nhất trong các ung thư đường
tiêu hóa. Tại Việt Nam, dựa trên một số công bố từ năm 2005-2010 cho thấy:
UTĐTT là loại ung thư có tỷ lệ mắc đứng thứ 5 về số ca mắc mới (8768 ca) và thứ
4 về số ca tử vong (5976 ca) [67].
Hiện nay, các phương pháp đang được áp dụng để chẩn đoán UTĐTT như:
chẩn đoán hình ảnh, chẩn đoán nội soi, chẩn đoán tế bào học, chẩn đoán mô bệnh
học thường chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã ở giai đoạn muộn, gây khó khăn
cho việc điều trị. Một số chỉ thị sinh học như kháng nguyên ung thư (cancer antigen,
CA), kháng nguyên ung thư phôi thai (carcinoembryonic antigen, CEA) chỉ dừng
lại ở tiên lượng sau điều trị bằng phẫu thuật [19, 7]. Nhu cầu đặt ra là phải tiếp tục
tìm kiếm các dấu hiệu sinh học giúp chẩn đoán có hiệu quả cũng như theo dõi điều
trị bệnh trong UTĐTT.
Matrix metalloproteinase (MMP) được biết đến là nhóm enzyme tham gia vào
các quá trình phát triển và xâm lấn của khối u, đặc biệt là MMP-2, MMP-9 và dạng
tiền hoạt động của chúng. Các enzyme này đã được nhiều công bố trên thế giới
chứng minh có biểu hiện khác biệt liên quan đến sự tiến triển khối u của bệnh
UTĐTT. Vì vậy, đề tài “Hoạt tính của protease kim loại (MMP-2, MMP-9) ở bệnh
nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật” được thực hiện nhằm mục tiêu:
1. Đánh giá hoạt tính và mức độ biểu hiện hoạt tính của MMP-2, MMP-9 trong
mô và huyết tương của bệnh nhân UTĐTT trước và sau phẫu thuật.

2. Đánh giá mối liên quan giữa hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 với một số đặc
điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT.

1
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
Ung thư là nhóm bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một cách

nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể. Từ đó, các
tế bào bất thường có thể xâm lấn, chèn ép vào các tế bào, mô lân cận. Ngoài ra,
chúng có thể tách rời và di chuyển đến các mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào
mạch máu hoặc hệ bạch huyết. Hơn thế nữa, sự xâm lấn chèn ép của những tế bào
ung thư dẫn tới sự rối loạn các chức năng vốn của cơ quan mà chúng có mặt [68].
Đại trực tràng bao gồm đại tràng lên, đại tràng góc gan, đại tràng ngang, đại
tràng góc lách, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng (hình 1.1). Chúng
chiếm phần lớn ruột già – phần cuối cùng của hệ tiêu hóa, đóng vai trò hấp thu nước
và các chất dinh dưỡng ở phần đầu đại tràng và dần chuyển thành các chất cặn bã để
đào thải khỏi cơ thể tại trực tràng.

Hình 1.1. Cấu tạo đại trực tràng [68]
1.1.1. Ung thư đại trực tràng
UTĐTT hay còn gọi ung thư ruột già là thuật ngữ để chỉ các loại ung thư
khởi phát có nguồn gốc từ bất kỳ vị trí nào thuộc đoạn đại tràng và trực tràng.
UTĐTT thường bắt đầu với sự phát triển của polyp trong lòng đại trực tràng và theo
thời gian một số polyp có thể sẽ trở thành ung thư [68].

3
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization, WHO)
về tình hình ung thư năm 2012, trên thế giới ước tính có 14,09 triệu ca mắc mới ung

thư và 8,20 triệu ca tử vong do ung thư, trong đó, số ca mắc mới UTĐTT là 1,36
triệu (chiếm 9,7%) đứng vị trí thứ ba sau ung thư phổi (vị trí thứ nhất) và ung thư
vú (vị trí thứ hai) và gần 0,7 triệu ca tử vong do UTĐTT (chiếm 8,5%). Cũng theo
báo cáo này, ở Việt Nam, có khoảng 125 nghìn ca mắc mới và 94 nghìn ca tử vong
do ung thư nói chung, trong đó, tính riêng ở UTĐTT có 8,7 nghìn ca mắc mới
(chiếm 7%) và 5,9 nghìn ca tử vong (chiếm 8%). Xét trên cả số lượng ca mắc mới
và số ca tử vong, UTĐTT đứng thứ 5 trong các dạng ung thư tại Việt Nam [67].
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ
Có rất nhiều nguy cơ dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh học
xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống kê các tài liệu tổng
quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này là:
Yếu tố không di truyền
Là các yếu tố như: thói quen ăn uống, hút thuốc lá, theo độ tuổi, bệnh tật,
thể dục ,…
Thói quen ăn uống: nhóm có nguy cơ cao phải đối mặt với UTĐTT thường
sử dụng các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu, gan,…), các loại thịt chế biến (như xúc
xích, thịt hun khói) và chế biến thực phẩm ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể
tạo ra các chất làm tăng nguy cơ ung thư. Bên cạnh đó, sử dụng chế độ ăn thực
dưỡng (rau, củ, quả, ngũ cốc,…) lại làm giảm nguy cơ UTĐTT [49, 24].
Thói quen vận động: những nhóm người năng vận động thể dục mỗi ngày có
tỷ lệ mắc ung thư thấp hơn nhóm lười vận động [61, 29].
Thừa cân: tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ mắc UTĐTT [61,
12].
Hút thuốc: hầu hết mọi người biết rằng hút thuốc gây ra ung thư phổi, nhưng
nhóm người hút thuốc trong thời gian dài có nguy cơ mắc UTĐTT nhiều hơn nhóm

4
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

không hút thuốc. Ngoài ra, hút thuốc cũng làm tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư
khác [61, 9].
Sử dụng đồ uống chứa cồn: Có nghiên cứu dịch tễ cho thấy 15% số người
mắc UTĐTT có cường độ sử dụng rượu, bia nhiều và nhóm ít sử dụng đồ uống có
cồn thì nguy cơ thấp hơn nhóm sử dụng nhiều [61, 40].
Tiền sử bệnh lý: Những người có tiền sử mắc bệnh viêm loét đại tràng, bệnh
Crohn và đái tháo đường tuýp 2 trong thời gian dài thường có nguy cơ cao mắc
UTĐTT [54, 63].
Sai hỏng trong điều hòa và biểu hiện gen: các tế bào có thể tăng sinh không
kiểm soát nếu có sai hỏng quá trình điều hòa và biểu hiện gen. Trong đó, những
nhóm gen liên quan trực tiếp đến ung thư gồm: các gen tiền ung thư (protooncogenes), các gen ức chế khối u và các gen sửa chữa ADN [68].
Ngoài các yếu tố kể trên còn có các yếu tố nguy cơ khác như tuổi, giới tính,
hay rối loạn trao đổi chất cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến UTĐTT.
Yếu tố di truyền
Khoảng 5-10% những ca mắc UTĐTT là có những biến đổi về gen được di
truyền lại. Thông thường, những biến đổi này dẫn đến ung thư khi bệnh nhân còn
trẻ.
Hội chứng đa polyp trong gia đình (Familial adenomatous polyposis, FAP):
Những người mắc FAP thường có hàng trăm hoặc hàng ngàn polyp trong ruột kết
và trực tràng. Ung thư thường khởi phát ở một hoặc một vài polyp ở tuổi 20. Đến 40
tuổi, hầu hết những người bị rối loạn này sẽ bị ung thư nếu không được cắt bỏ đoạn
đại tràng. Hội chứng FAP chiếm khoảng 1% trong UTĐTT [68].
Hội chứng Lynch (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) hay
còn gọi UTĐTT không polyp di truyền: chiếm khoảng 3% đến 5% số ca mắc

UTĐTT và thường mắc ung thư khi còn trẻ. Từ những biến đổi trong gen MLH1,
MSH2, MSH6, PMS2, hoặc EPCAM dẫn đến tăng nguy cơ phát triển hội chứng

5
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Lynch. Những người mắc hội chứng này cũng có thể có khối u, nhưng họ chỉ có
một lượng nhỏ và không đến hàng trăm như trong hội chứng FAP. Nguy cơ UTĐTT
ở những người bị tình trạng này có thể lên đến 80% [68].
Chủng tộc hay sắc tộc: một số nhóm chủng tộc như người Mỹ gốc Phi, người
Do Thái gốc Đông Âu (Ashkenazi Do Thái) có nguy cơ UTĐTT cao hơn. Trong số
những người Do Thái Ashkenazi, một số đột biến gen đã được tìm thấy dẫn đến
tăng nguy cơ UTĐTT [35, 11].
1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng
Việc xác định giai đoạn của ung thư có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa
chọn phác đồ điều trị thích hợp và tối ưu nhất cho bệnh nhân. Đồng thời, phân giai
đoạn cụ thể cũng thuận lợi cho việc nghiên cứu, trao đổi thông tin giữa các trung
tâm điều trị, so sánh và đánh giá các phương pháp điều trị với nhau. Hiện nay, hệ
thống phân giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trên thế giới
cho UTĐTT là hệ thống phân loại theo khối u, hạch lympho, di căn (Tumor-NodeMetastasis hay còn gọi là TNM); hệ thống Dukes và hệ thống phân loại theo mô
bệnh học.
Hệ thống phân giai đoạn TNM đã được Ủy ban ung thư Hoa kỳ (American
Joint Committee on Cancer, AJCC) và Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế

(Union for International Cancer Control, UICC) thông qua từ năm 1974 và được
sửa đổi theo các ấn bản mới hơn. Hệ thống phân loại này được áp dụng theo hệ
thống phân loại AJCC phiên bản thứ 7 cho UTĐTT cụ thể như sau [4]:
T cho biết về kích cỡ, mức độ xâm lấn vào thành ruột của khối u nguyên
phát:
-

Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin;

-

Tis: Khối u tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc;

-

T1: Khối u đã phát triển và xâm lấn đến lớp hạ niêm mạc;

6
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

-

Hoàng Ngọc Anh

T2: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp hạ niêm mạc và xâm lấn đến

lớp đệm cơ;
-

T3: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp đệm cơ và xâm lấn đến các lớp

ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối u chưa xâm
lấn đến các cơ quan và mô lân cận;
-

T4a: Khối u đã phát triển xuyên qua thanh mạc;

-

T4b: Khối u đã phát triển xuyên qua thành đại tràng, dính chặt hoặc

xâm lấn các mô và cơ quan lân cận.
N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch
bạch huyết:
-

Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết;

-

N0: Không có tế bào ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận;

-

N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận;

-

N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2-3 hạch bạch huyết kề cận;

-

N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các

hạch bạch huyết nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết;
-

N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 đến 6 hạch bạch huyết kề

-

N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong 7 hạch bạch huyết kề cận trở lên.

cận;

M cho biết mức độ di căn của khối u:
-

M0: Không có tế bào di căn xa;

-

M1a: tế bào ung thư đã di căn đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch

bạch huyết ở xa;

7
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

-

Hoàng Ngọc Anh

M1b: tế bào ung thư đã di căn đến ít nhất 1 cơ quan xa trở lên hoặc

một nhóm các hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã di căn đến các phần phúc mạc ở xa.
Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Cuthbert Dukes người Anh phát
minh ra vào năm 1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT.
Duke A: ung thư xâm lấn tới lớp cơ bị giới hạn ở thành trực tràng, chưa di
căn hạch.
Duke B: ung thư xâm lấn thanh mạc đến tổ chức xung quanh, chưa di căn
hạch.
Duke C: Có di căn hạch.
Duke D: Có di căn xa.
Ngoài cách phân giai đoạn theo TNM, UTĐTT còn được phân thành 5 giai
đoạn, gồm: giai đoạn 0, I, II, III và IV.
-

Giai đoạn 0: khối u chỉ được tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của

đại tràng hoặc trực tràng.
-

Giai đoạn I: khối u đã phát triển vào thành trong của đại tràng hoặc

trực tràng. Khối u chưa phát triển vượt qua thành.
-

Giai đoạn II: khối u phát triển sâu hơn vào trong hoặc xuyên qua

thành đại tràng hoặc trực tràng. Các tế bào ung thư có thể đã xâm lấn các mô lân
cận nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.
-

Giai đoạn III: tế bào ung thư đã di căn đến các hạch bạch huyết vùng

lận cận nhưng chưa đến các bộ phận khác của cơ thể.
-

Giai đoạn IV: Tế bào ung thư đã lây lan sang các bộ phận khác của cơ

thể, như gan hoặc phổi,…
Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sau 5 năm được thể hiện ở bảng 1.1

8
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm [4, 69]
Giai đoạn

TNM

Duke

0

TisN0M0

-

I

A

IIA

T1N0M0
T
T3N
N0 M
M0

IIB

T4aN0M0

B

IIC

T4bN0M0

IIIA
IIIC

T1,2N1/1cM0
TN
MM0
T3,4a
N1/1c
T
N2aM
M0
T4bN

IVA

T M
N1a M

IVB

M1b

IIIB

Tỷ lệ sống sau 5 năm
87-92%
80-87%
49-63%
84-89%

C

69-71%
53-58%

D

11-12%

1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật
Phẫu thuật là một phương pháp điều trị cơ bản không bị nhờn, cho phép loại
bỏ các tổ chức ung thư. Nếu như bệnh được chẩn đoán ở giai đoạn sớm và xác định
được vị trí khu trú của tổ chức u thì phẫu thuật có thể loại bỏ tổ chức u triệt để. Tuy
nhiên, những biến chứng không mong muốn vẫn tồn tại do phẫu thuật như tụ máu,
chảy máu, nhiễm trùng tại ví trí phẫu thuật, bên cạnh đó, thuốc dùng trong quá trình
gây mê và các thuốc giảm đau sau phẫu thuật cũng có những ảnh hưởng nhất định
với bệnh nhân sau phẫu thuật [69]. Từ đó, dẫn đến các quá trình của cơ thể như hồi
phục tổn thương, stress oxi-hóa [14, 46].
1.2. Tổng quan về các MMP
1.2.1. Matrix Metalloproteinases
Matrix Metalloproteinases (MMP) là một họ các enzyme có 1 nhân kim loại

kẽm tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide nội phân tử giúp
phân giải các chất nền ngoại bào (extracellular matrix, ECM) qua đó làm yếu đi các
liên kết giữa tế bào - tế bào; tế bào - ECM [20]. Cho đến nay, các nhà khoa học đã
tìm được 25 loại MMP khác nhau, trong đó, 24 loại cũng được tìm thấy trong cơ thể

9
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

con người, chúng được nhận dạng dựa vào các vùng chức năng cơ bản của các
MMP và cơ chất của chúng (bảng 1.2) [33]
Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính
[33]
Nhóm

Tên
Collagenases:
MMP-1, -8, -13

Các
Archetypal
MMP

Stromelysins:

MMP-3, -10

Các loại khác:
MMP-12, -19, -20, -27

Matrilysins

MMP-7, -26

Gelatinases

MMP-2, -9

Tiết:
MMP-11, -21, -28
Furin –
Hoạt hóa các
MMP

Xuyên màng loại 1:
MMP-14, -15, -16, -24

Cơ chất
ECM:
collagens,
gelatin,
fibronectin,
aggrecan
Non-ECM: pro-iL-1β, pro-iL-8, pro-TNF,
MMP khác, PAi, IGFBP

ECM: collagens, gelatin, elastin, fbronectin,
laminin, aggrecan
Non-ECM: pro-iL-1β, các MMP, liên kết
MMP/ TIMP, fibrinogen, plasminogen,
antithrombin
III, iGFBP
ECM: collagen
IV, gelatin, elastin,
fibronectin, laminin
Non-ECM: fibrin, plasminogen, myelin basic
protein
ECM: collagen IV, gelatin, elastin,
fibronectin, laminin, integrins, …
Non-ECM: các MMP khác, liên kết
MMP/TIMP, fibrinogen, plasminogen.
ECM: collagens, gelatin, elastin, fibronectin,
…
Non-ECM: pro-iL-1β, plasminogen, các
MMP khác
ECM: collagen IV, gelatin, laminin,
fibronectin
Non-ECM: casein, IGFBP
ECM: collagens, gelatin, elastin, laminin,
vitronectin
Non-ECM: các MMP khác

GPI-anchored:
MMP-17, -25

Chưa biết

Xuyên màng loại 2:
MMP-23A, -23B

Chưa biết

Chú giải: ECM: chất nên ngoài bào, pro-IL: dạng tiền hoạt động của interleukin (proform of
interleukin), pro-TNF: dạng tiền hoạt động của yếu tố hoại tử u (proform of tumor necrosis
factor), PAI: ức chế nhân tố hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator inhibitor), IGFBP:
protein kết hợp với yếu tố sinh trưởng tương tự insulin (insulin-like growth factor-binding
protein), TIMP: Chất ức chế của MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase)

10
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP [18]
Mặc dù có một vài khác biệt giữa các MMP nhưng về cấu trúc protein lại
tương đồng khá nhiều (hình 1.2). Nhìn chung, tại đầu N của chúng đều chứa một
đoạn ngắn peptide tín hiệu giúp xác định điểm đến trong quá trình bài tiết, nhưng
chuỗi peptide tín hiệu sẽ được loại bỏ khi phân tử đi qua lưới nội chất. Các phần
tiếp theo của các phân tử MMP gồm một vùng propeptide với khoảng 80 axit amin
có chứa 1 motif bảo thủ PRCGXPD được biết đến như Switch - cysteine với vai trò
khóa trung tâm hoạt động của phân tử và giữ cho chúng ở dạng tiền hoạt động. Phần

tiếp theo của các MMP là vùng hoạt động gồm một chuỗi có 160-170 axit amin
cuộn thành hình khối cầu có chứa trình tự bảo thủ khác là HEXXHXXGXXH và 2
phân tử kẽm tạo thành trung tâm hoạt động cho các enzyme. Hầu hết các MMP (trừ
MMP-7, -23 và -26) đều có 1 vùng bản lề (hinge) với bản chất là 1 chuỗi chứa 1030 axit amin với chức năng làm cầu nối cho vùng hoạt động với đầu C của các
MMP – vùng giống hemopexin. Vùng này có khoảng 200 axit amin được xem như
vùng gắn chất ức chế của các MMP (các TIMP) [43]. Bên cạnh đó, đối với các loại

11
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

MMP màng (Membrane-type MMP, MT-MMP) có thể có thêm vùng bám màng
glycosylphosphatidylinositol (GPI) gồm MMP-17 và -25 còn được gọi tương ứng là
MT4- và MT6-MMP hoặc xuyên màng loại I với MMP-14, -15, -16, và -24, còn
được gọi tương ứng là MT-1, -2, -3, và -5-MMP [52].
Ngoài các thành phần phổ biến nói trên, một số MMP có chứa một vài phần
độc đáo khác. Ví dụ như fibronectin II giống như chèn vào trong vùng xúc tác chỉ
được được tìm thấy trong MMP-2 và -9. Hay vùng bản lề của MMP-9 chứa 64 axit
amin bị O-glycosyl hóa. Hơn nữa, trong phân tử MMP-23, các peptide tín hiệu được
thay thế bởi vùng xuyên màng loại II, trong khi đó vùng giống hemopexin được
thay thế bằng một đoạn giàu cysteine và tạo thành một vùng giống với
immunoglobulin. Cuối cùng, tất cả các MMP GPI và MMP tiết (MMP-11, -21 và 28) đều có một motif R(X/R)KR giữa vùng tiền hoạt động và hoạt động. Trình tự
này được nhận diện và cắt bỏ bởi furin, các proteinase serine nội bào, trong đó loại
bỏ các vùng pro từ các phân tử MMP và dẫn đến kích hoạt nó [18]. (hình 1.2)

1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP)
Các loại enzyme MMP đều được tiết ra dưới dạng tiền hoạt động hay còn gọi
là zymogen hay là pro-MMP. Do đó, chúng cần phải được hoạt hóa trước khi thực
hiện chức năng phân cắt chất nền ngoại bào. Trong cơ thể, các MMP được hoạt hóa
từ dạng tiền hoạt động sang hoạt động nhờ các endoproteinase. Sự hoạt hóa các
MMP có thể được thực hiện bởi nhiều enzyme khác nhau trong chất nền ngoại bào
như protease nhóm cysteine, serine và aspartate hoặc MMP khác. Ngoài ra, quá
trình hoạt hóa nhiều loại MMP cũng được xử lý ngay trong tế bào bởi furin, các
subtilisin như serine proteinase, ở lưới nội chất và thể Golgi. Mặt khác, các MMP
có thể được hoạt hóa bởi tác nhân vật lý và hóa học như amino phenylmercuric
acetate (APMA), sodium dedocyl sunfate (SDS), pH thấp hay xử lý bằng nhiệt [33].
Quá trình hoạt hóa MMP như sau: vùng pro-peptide của các MMP có cystein
ở vị trí 73 tạo ổn định cho dạng pro-enzyme không hoạt động. Trong vùng xúc tác,
Zn2+ được liên kết với cystein ở vị trí 73. Khi liên kết này còn nguyên, MMP không

12
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

hoạt động. Các MMP hoạt động khi liên kết Zn2+ với cystein bị phá vỡ. Cơ chế này
được đề cập như là “sự chuyển đổi cystein”. Một phân tử nước đi vào liên kết với
ion Zn2+ thay thế cystein sau khi phân ly khiến enzyme chuyển thành dạng hoạt
động. Sau đó, vùng pro-peptide của các MMP được loại bỏ bằng cách tự cắt hay
nhờ protease khác, quá trình này làm giảm 8-10 kDa của phân tử để trở thành dạng

hoàn chỉnh như hình 1.3 [55].

Pro-MMP không hoạt tính Pro-MMP có hoạt tính

Dạng hoạt động MMPs

Hình 1.3. Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP [55]
Trong kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide
gel electrophoresis, SDS-PAGE), dạng pro-MMP vẫn có hoạt tính như dạng hoạt
động vì SDS đã phá vỡ liên kết Cystein-Zn làm cho phân tử MMP lộ ra trung tâm
hoạt động mặc dù đoạn pro-peptide không bị loại bỏ do không có các
endoproteinase để cắt bỏ đoạn pro [44].
1.2.3. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase
Các MMP đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm suy thoái chất nền
ngoại bào được biết đến như hàng rào bảo vệ tế bào khỏi vi sinh vật, các MMP có
khả năng tái cấu trúc collagen, gelatin, elastin và casein. Ngoài ra, chúng còn tham
gia phân tách thụ thể bề mặt tế bào, giải phóng các phối tử của chết theo chu trình
và bất hoạt chemokine/cytokine. Trong ung thư, Các MMP đóng vai trò quan trọng
trong các quá trình tăng sinh, xâm lấn, biệt hóa, chết theo chu trình, hình thành
mạch và bảo vệ vật chủ (bảng 1.3) [51].

13
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

Bảng 1.3. Chức năng của một số MMP [20]
MMP

Hoạt động

Ảnh hưởng

Sự xâm lấn của tế bào ung thư
MT1-MMP,
MMP2, Phân giải protein
MMP9 và nhiều loại
khác

Làm suy giảm hàng
rào bảo vệ vật lý

Tăng sinh tế bào ung thư
MMP-1, -2, -3, -7, -9, - Phân cắt IGF-BP
11, -19.
MMP-3, -7

Phát tán các phối tử bám màng của
EGFR (HB-EGF, TGF-a và
amphiregulin)

MMP-2, -9, -14

Hoạt hóa TGF-β

MMP-7 (CD44)

Phát tán của HB-EGF

Tăng sinh tế bào

Chết theo chương trình
MMP-7

Phân cắt phối tử Fas

Ngăn
Nhiều loại MMP (bao Gián tiếp hoạt hóa của Akt thông apoptosis
gồm cả MMP-2 và -9)
qua hoạt hóa EGFR và IGFR

chặn

Sinh mạch của khối u
Nhiều loại MMP (bao Thủy phân COL-IV, perlecan; giải Tăng sự hình thành
gồm MMP-2, -9 MMP- phóng VEGF và bFGF
mạch
3, -10, -11 MMP-1, -8, Thủy phân COL-IV, COL-XVIII, Giảm sự sinh mạch
13)
perlecan; tạo ra
tumstatin,
endostatin,
angiostatin
và
endorepellin

Kết dính, di cư và chuyển hóa biểu mô thành trung mô của tế bào
MMP-2

Phân hủy COL IV, hình thành các Thúc đẩy xâm lấn
peptide lạ

MT1-MMP

Phân hủy laminin-5

Cảm ứng của EMT
di chuyển tế bào

14
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

MMP-2, -3, -9, -13, -14

Biểu hiện quá mức, liên quan đến Cảm ứng mạnh mẽ
EMT
của EMT

MMP-1, -7

Giải phóng E-cadherin

MMP-28

Kích hoạt phân giải protein của
TGF-β

Xâm lấn tế bào

Giám sát miễn dịch
MMP-9

Phát tán của thụ thể α-interleukin- Ngăn chặn gia tăng
2 của tế bào lympho T
tế bào lympho T

MMP-9, -2, -14

Giải phóng TGF-b đã hoạt hóa

MMP-7, -11, -1, -8, -3

Giải phóng các chất ức chế a1- Giảm độ nhạy cảm
proteinase
của tế bào ung thư
với tế bào giết NK

MMP-7, -8

Phân cắt chemokine α và β

Ngăn chặn phản
ứng của tế bào
lympho T chống lại
tế bào ung thư

Ảnh hưởng đến
bạch cầu và liên
quan đến xâm lấn

Chú giải: EGFR: Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor), EMT:
quá trình chuyển dạng trung - biểu mô (epithelial-mesenchymal transitions), TGF: nhân tố sinh
trưởng chuyển hóa (Transforming growth factor), HB-EGF: yếu tố tăng trưởng thượng bì có gắn
heparin (Heparin-binding EGF-like growth factor)

Theo Gialeli và cộng sự (cs): MMP-2 và MMP-9 có mặt trong tất cả các vai
trò của MMP trong ung thư như: xâm lấn, tăng sinh, chết theo chu trình, sinh mạch,
giám sát miễn dịch và chuyển dạng tế bào. Qua đó, thấy được sự đa dạng về vai trò
của MMP-2 và MMP-9 trong các quá trình thúc đẩy tiến triển của khối u [20].

15
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

1.3. Tình hình nghiên cứu MMP trong ung thư đại trực tràng
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Với sự đa dạng và phong phú về số con đường mà các MMP tham gia vào,
các nhà nghiên cứu đã và đang tìm kiếm sự biểu hiện khác biệt của các MMP trong
các bệnh ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng. Cho đến nay, trên thế giới đã có
nhiều công bố về kết quả nghiên cứu các MMP ở bệnh nhân ung thư nói chung và
UTĐTT nói riêng.
Với mục tiêu nghiên cứu so sánh ý nghĩa lâm sàng của MMP-9 trong huyết
thanh với TIMP-1 trong chẩn đoán UTĐTT và sự khác biệt giữa polyp thường với
mô UTĐTT, Mroczko và cs đã sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết
enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) để định lượng MMP-9 và
TIMP-1 trong huyết thanh của 75 bệnh nhân UTĐTT, 35 polyp thường và 70 người
khỏe mạnh. Bên cạnh đó, nồng độ kháng nguyên ung thư CEA và CA 19-9 được
định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme vi hạt (microparticle enzyme
immunoassay). Qua đó, cho thấy mức độ biểu hiện của MMP-9 trong huyết thanh
của bệnh nhân UTĐTT cao hơn rõ rệt với nhóm khỏe mạnh. Bên cạnh đó, mức độ
biểu hiện TIMP-1 cũng cao hơn ở mô ung thư so với polyp tuyến. Ngoài ra, TIMP-1
cũng có liên quan với một số đặc điểm bệnh học lâm sàng như hạch di căn, di căn
xa, giai đoạn khối u (T), tình trạng của bệnh nhân (còn sống và đã chết), tình trạng
của khối u (đã cắt bỏ, chưa cắt bỏ). Kết quả nghiên cứu này cũng cho rằng: TIMP-1
và MMP-9 khi kết hợp với nhau trong chẩn đoán sẽ cho độ nhạy cao hơn các chỉ thị
sinh học CEA và CA19-9 [41].
Daniele và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 50 bệnh nhân ung thư vú và 34
người khỏe mạnh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trên mẫu mô và điện di hoạt tính
enzyme với mẫu huyết thanh. Kết quả thu được cho thấy: các gelatinase biểu hiện
cao rõ rệt trong bệnh nhân ung thư vú di căn so với không di căn và nhóm chứng
trên cả mẫu mô và huyết thanh. Thêm vào đó, kết quả nghiên cứu cho rằng: MMP-9

16

Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Ngọc Anh

có tương quan với CA 15.3 và độ mô học. Kết quả này gợi ý rằng: MMP-2 và
MMP9 như dấu hiệu của sự phát triển, xâm lấn và di căn ở ung thư vú [13].
Công bố năm 1999 của Adachi và cs dựa trên 83 mẫu mô của bệnh nhân
UTĐTT, trong đó 5 mẫu mô được lấy từ bệnh nhân đã di căn sang gan. Bằng
phương pháp hóa mô miễn dịch và điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel
polyacrylamide có bổ sung casein, kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy: có
46% mẫu mô trong 83 mẫu và hơn 10% tế bào ung thư được nhuộm dương tính với
MMP-7 và sự biểu hiện tăng của MMP-7 có liên quan với sự có mặt của hạch di căn
và di căn xa (p<0,05). Thêm vào đó, kết quả điện di xác định hoạt tính enzyme trên
gel polyacrylamide có bổ sung casein cho thấy sự biểu hiện của MMP-7 có liên
quan đến sự xâm lấn và di căn của khối u (p<0,001) [3].
Shiozawa và cs đã cho thấy sự biểu hiện của enzyme MMP-1 ở bệnh nhân
UTĐTT. Mẫu nghiên cứu gồm: 20 bệnh nhân có khối u tuyến và 142 bệnh nhân ung
thư biểu mô tuyến. Kết quả nghiên cứu cho thấy MMP-1 không biểu hiện trong 20
mẫu khối u tuyến nhưng lại biểu hiện trong 108/142 mẫu ung thư biểu mô tuyến
(76,1%). Cùng với phân tích đặc điểm bệnh học, nhóm nghiên cứu đã nhận định
mức độ xâm lấn, bộc lộ hạch lympho và di căn tăng lên theo mức độ biểu hiện của
MMP-1 [53].
Leeman và cs đã tiến hành nghiên cứu về MMP-13 trên 249 mẫu UTĐTT
được cố định bằng formalin và đúc với parafin bằng phương pháp nhuộm hóa mô
miễn dịch. Mặt khác, nhóm tác giả còn dùng phương pháp điện di trên gel

polyacrylamide có bổ sung cơ chất gelatin đối với 10 bệnh nhân thuộc giai đoạn
Duke C và mẫu mô bình thường. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng 91% số mẫu có
MMP-13 được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào ung thư. Đồng thời, nghiên cứu
cho thấy có mối liên hệ giữa kết quả nhuộm hóa mô MMP-13 cao với khả năng
sống sót thấp của bệnh nhân [36].
Waas và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 73 cặp mẫu (mô u và mô thường) và
33 mẫu mô lân cận u lấy từ bệnh nhân UTĐTT bằng phương pháp điện di và phân

17
Khóa 2014 – 2016

Sinh học thực nghiệm