Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG

Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu
quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus
urophylla)”.

THÁI NGUYÊN 2014

1


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1
Chương 1 ...................................................................................................................................................... 6
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................................................... 6
1.1. Công nghệ sinh học trong tạo cây trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh .........................................6
1.1.1. Vai trò của nitơ đối với thực vật ...............................................................................................6
1.1.2. Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh ............................................7
1.2. Giới thiệu về gen tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ (GS1)...............................................................9
1.3. Giới thiệu chung về thuốc lá và Bạch đàn Urô .................................................................................11
1.3.1. Cây thuốc lá cây mô hình cho nghiên cứu chuyển gen .........................................................11
1.3.2. Giới thiệu về bạch đàn urô ......................................................................................................12
Chương 2 .................................................................................................................................................... 13
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 13
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................................................................13
2.1.1. Vật liệu ......................................................................................................................................13
2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng ....................................................................................................14
2.2. Địa điểm và thời gian .........................................................................................................................17

2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................................17
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá ...............................................................18
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tạo các dòng Bạch đàn urô ..........................................................21
Chương 3 .................................................................................................................................................... 30
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................................................... 30
3.1. Tạo các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 và đánh giá sinh trưởng ở phạm vi phòng thí nghiệm..30
3.1.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326 .................................................30
3.1.2. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 bằng PCR .......................................................34
3.1.3. Phân tích, đánh giá sinh trưởng các dòng thuốc lá chuyển gen ...........................................35
3.2. Kết quả tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1......................................................................37
3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào Bạch đàn urô............................................................37
Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô ........................................................................... 43
3.2.2. Kiểm tra các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng phương pháp PCR ..............................46
Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số. ................................................................ 48
3.2.3. Kiểm tra các dòng Bạch đàn chuyển gen bằng kỹ thuật lai southern .................................54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................ 56

2


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Văn Thắng- Viện trưởng
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tận
tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà- Viện trưởng Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện
nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh luận văn.

Tôi muốn bày tỏ biết ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc- Phó Trưởng phòng
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Phương Thảo và CN. Nguyễn Văn
Đoài- Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cộng tác giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học trong quá suốt
trình làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ thuộc cơ sở đào
tạo Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Cuối cùng tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên
tôi động viên, quan tâm tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2015
Học viên

Trần Thị Hương Giang

3


MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
AS

Acetosyringone

ADP

Adenosine diphosphat

ATP

Adenosine triphosphat

BAP

Benzyl Amino Purine

Cs

Cộng sự

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleotide

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

IBA

Indol-3-Butyric Acid

Knop

Môi trường Sachs & Knop (1860)

Kb

kilo base

kDa

kilo Dalton

LB

Môi trường nuôi cấy Luria and Betani

MS

Môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962)

NAA

Naphthyl Acetic Acid

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

Bp

Bazo pair

RNA

Ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sulfate

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn............................................................. 15
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy thuốc lá .............................................................. 15
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy Bạch đàn ........................................................... 16

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen .............. 20
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.................................................... 20
Bảng 3.1. Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu biến nạp qua các giai đoạn (%)33
Bảng 3.2. Bảng so sánh chiều cao cây đối chứng và cây chuyển gen GS1 ....... 36
Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô ................................................. 43
Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số..................................... 48

5


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Kết quả trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1. ...................... 9
Hình 2.1. Sơ đồ vector chuyển gen pBI121:GS1. .......................................................... 14
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát. .......................................................................... 17
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen GS1 vào thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens. ...................................................................................................................... 31
Hình 3.2. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens. ................................................................... 32
Hình 3.3. Biến nạp và đồng nuôi cấy. ............................................................................ 32
Hình 3.4. Mảnh lá trên môi trường chọn lọc sau 2 tuần. ............................................. 34
Hình 3.5. Cây thuốc lá chuyển gen GS1 trên môi trường chọn lọc CL-TL50 ............. 34
Hình 3.6. Sản phẩm PCR nhân gen GS1 ....................................................................... 35
Hình 3.7. Cây thuốc lá K326 trồng trên giá thể ............................................................ 36
Hình 3.8. Cây thuốc lá K326, 5 tháng tuổi. ................................................................... 37
Hình 3.9. Tạo nguồn vật liệu chuyển gen ...................................................................... 38
Hình 3.10. Thân mầm và lá mầm trên môi trường tiền nuôi cấy ............................... 39
Hình 3.11. Thân mầm và lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy ............................. 41
Hình 3.12. Mẫu bạch đàn trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn42
Hình 3.13. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của đoạn thân mầm ............................... 43
Hình 3.14. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của mảnh lá mầm .................................. 44
Hình 3.15. Chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc từ mẫu thân mầm và lá mầm sau

6 tuần nuôi cấy ................................................................................................................. 45
Hình 3.16. Chồi Bạch đàn urô sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ ................ 45
Hình 3.17. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 2 tuần tuổi... 46
Hình 3.18. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 3 tháng tuổi 46
Hình 3.19a. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di
trên gel agarose 0,8% ...................................................................................................... 47
Hình 3.19b. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện
di trên gel agarose 0,8%. ................................................................................................. 47
Hình 3.20. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng Bạch đàn urô chuyển
gen. .................................................................................................................................... 50

6


Hình 3.21. Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng Bạch đàn urô giả định
chuyển gen ........................................................................................................................ 51
Hình 3.22. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ các dòng Bạch đàn urô giả
định chuyển gen ............................................................................................................... 52
Hình 3.23. Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ các dòng Bạch đàn urô giả định
chuyển gen ........................................................................................................................ 54
Hình 3.24. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 và nptII ....... 55

7


MỞ ĐẦU
Nitơ một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng
nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu trúc
cơ bản nên các phân tử axít nucleic và protein trong tế bào. Trong cây, nitơ có
thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi

trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình trao
đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động
nitơ trong một vài protein.
Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa
axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng amoniac như một cơ
chất (Miflin và Lea, 1980) có tác dụng làm biến đổi tất cả nitrogen ở dạng vô
cơ tích hợp vào các hợp chất hữu cơ như: các protein và axít nucleic, chất diệp
lục, cytochrome, phytochrome.v.v. (Stephanie và cs, 2009).
Có hai dạng chính là glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy
trong tế bào chất của lá và các tổ chức không quang hợp và glutamine
synthetase ở lục lạp (GS2) chỉ có trong lục lạp của các mô tham gia vào quá
trình quang hợp và plastid của rễ. Trong đó, GS1 có vai trò đặc biệt quan
trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Dubois và cs, 1996; Cren và
Hirel, 1999; Stephanie và cs, 2009). GS1 là một octamer protein/enzyme bao
gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ
thuộc vào các loài khác nhau. Trong một số loài, như thuốc lá, cà chua,
thông,v.v. GS1 của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống
nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành phân tử GS1 được
cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước khác nhau (Becker và cs, 1992;
Canton và cs, 1999; Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm phân
tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo
thành từ hai chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự
khác nhau này sẽ liên quan đến sự hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý
của chúng. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng
của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống
nghiệm đã tiến hành và xác nhận được vai trò quan trọng của các axít amin
1


chìa khoá trong tính chất xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999).

Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là
nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nếu
gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo
nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stephanie và cs, 2009).
Một kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây lâm nghiệp tiêu biểu
là: Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 dưới sự điều
khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171),
kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng
là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các dòng Dương lai
chuyển gen GS1 đã được trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tại tỉnh Granada của
Tây Ban Nha, kết quả các dòng cây chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện
enzyme glutamine synthetase cao và có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với
giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng hơn so với cây
không chuyển gen là 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng
2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs, 2004).
Bạch đàn urô (Eucayltus urophylla) là một trong những loài Bạch đàn
chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Đây cũng là loài cây chủ lực trong dự án
trồng mới 5 triệu hecta rừng đã được triển khai trong cả nước giai đoạn 1998 2010. Các nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, v.v.
đã được thực hiện, kết quả thu được cho thấy các tính trạng sinh trưởng và
chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp
giấy. Các đánh giá về sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho
thấy tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam chậm hơn so với các
nước khác như Trung Quốc, Brazil (Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các
chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả
năng sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ và tăng sức chống chịu với điều kiện
môi trường bất lợi.
Thuốc lá là loại cây mô hình được sử dụng hiệu quả cho chuyển gen,
kiểm tra sự biểu hiện của gen ngoại lai phục vụ cho mục đích chuyển gen vào
cây mục tiêu. Trong khuôn khổ đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm chuyển
2

gen GS1 vào cây thuốc lá để đánh giá hoạt động của gen chuyển, tạo cơ sở cho
việc chuyển gen GS1 vào cây Bạch đàn urô có khả năng sử dụng hiệu quả
nguồn nitơ để cây sinh trưởng nhanh phục vụ cho công tác cải thiện giống cây
trồng.
Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả
nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)”.
1.

Mục đích nghiên cứu
Tạo được các dòng cây thuốc lá K326 và các dòng cây Bạch đàn urô

chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ.
2.

Nhiệm vụ nghiên cứu

2.1. Chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326 và phân tích, đánh giá
sinh trưởng ở phạm vi phòng thí nghiệm.
Biến nạp cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326;
Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng thuốc lá chuyển gen
bằng phương pháp PCR.
Đánh giá về hình thái, sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen
GS1 tăng cường khả năng tổng hợp nitơ so với cây thuốc lá đối chứng không
chuyển gen (WT).
2.2. Tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1
Biến nạp cấu trúc gen GS1vào Bạch đàn Urô
Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng Bạch đàn urô chuyển

gen bằng phương pháp PCR và phương pháp southern blot.
3.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển
gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 dưới sự điều
khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS-promoter do
Phòng Công nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

3


Dòng thuốc lá K326 in vitro được cung cấp bởi Viện Kinh tế kỹ thuật
thuốc lá và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hạt giống Bạch đàn urô do Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung cho các tài liệu nghiên cứu khả
năng chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào cây trồng thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
4.2.

Ý nghĩa thực tiễn
Tạo được dòng thuốc lá chuyển gen GS1 là cây mô hình cho các thí

nghiệm chuyển gen vào các đối tượng cây trồng khác
Tạo dòng bạch đàn chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ
trên quy mô phòng thí nghiệm là cơ sở cho việc thử nghiệm và trồng rừng
Bạch đàn sinh trưởng nhanh phủ xanh đất trống đồi trọc.

4


5


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Công nghệ sinh học trong tạo cây trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh
Các hướng nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen đang được
nhiều nhà khoa học lâm nghiệp trên thế giới quan tâm: Tạo cây kháng sâu và
côn trùng; tạo cây kháng nấm bệnh; tạo cây sinh trưởng nhanh; tạo cây có
chất lượng gỗ tốt và tạo cây kháng được các điều kiện bất lợi của môi trường
(lạnh, mặn và hạn). Đối với cây lâm nghiệp trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh
trưởng và chất lượng gỗ là những tính trạng được quan tâm hàng đầu, nhằm
nâng cao giá trị kinh tế trên một đơn vị diện tích rừng trồng. Theo báo cáo của
FAO (2004) các nghiên cứu về cải tạo giống cây lâm nghiệp có liên quan đến
tăng tốc độ sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt chiếm 63%.
Cho đến nay, có nhiều hướng nghiên cứu theo định hướng tạo giống cây

lâm nghiệp chuyển gen có khả năng sinh trưởng nhanh như: chuyển gen làm
giảm hàm lượng lignin; chuyển gen gây ức chế sự ra hoa; chuyển gen tăng
cường sử dụng các nguyên tố khoáng; chuyển gen tăng sự phân chia tế bào;
chuyển gen tăng khả năng tổng hợp và sử dụng hiệu quả nitơ. Trong các
hướng nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu tăng cường khả năng sử dụng hiệu
quả nitơ là hướng đã thu được các kết quả tốt nhất.
1.1.1. Vai trò của nitơ đối với thực vật
Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý
đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và ảnh hưởng trực tiếp đến
năng suất mùa vụ. Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có
vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, đến hoạt động
sinh lý của cây.
Nitơ là thành phần chủ yếu của protein một trong bốn hợp chất quan
trọng nhất của sự sống, protein tham gia vào mọi hoạt động sống của cơ thể,
xúc tác cho mọi phản ứng từ đơn giản như phản ứng hydrat hoá đến phức tạp
như tổng hợp DNA; sinh tổng hợp protein; vận chuyển chất dinh dưỡng; tham
gia vào các cấu trúc đặc thù để kiến tạo và bảo vệ cơ thể, là thành phần quan
trọng của màng sinh chất của tế bào cũng như các bào quan. Nitơ có trong
6


thành phần của axít nucleic (DNA và RNA). Ngoài chức năng duy trì và truyền
thông tin di truyền, axít nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình
sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào,v.v. Nitơ là
thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định
hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh
vật trên trái đất. Nitơ là thành phần của một số phytohormone như auxin và
cytokinin. Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh
trưởng của tế bào và của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có
vai trò quan trọng trong trao đổi năng lượng của cây. Nitơ tham gia vào thành

phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát
triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy
mầm, tính hướng quang.
Vì vậy cây rất nhạy cảm với nitơ, trong điều kiện thiếu nitơ cây sinh
trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và
phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảm năng suất.
Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít. Trong trường hợp
có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh trưởng và
phát triển bình thường.
1.1.2. Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh
Nitơ một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng
nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu trúc
cơ bản nên các phân tử axít nucleic và protein trong tế bào. Trong cây, nitơ có
thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi
trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình trao
đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động
nitơ trong một vài protein. Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho
phản ứng chuyển hoá axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng
amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980). Có hai dạng chính là
glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy trong tế bào chất của lá và
các tổ chức không quang hợp và glutamine synthetase ở lục lạp (GS2) chỉ có
trong lục lạp của các mô tham gia vào quá trình quang hợp và plastid của rễ,
7


trong đó GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng
nitơ (Stéphanie và cs, 2009).
GS1 là một octamer protein/enzyme bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có
khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong
một số loài, như thuốc lá, cà chua, thông, v.v. GS1 của lá được cấu tạo từ các

dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ
như cây đậu nành phân tử GS1 được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước
khác nhau (Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng
điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo thành từ hai
chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ
liên quan đến sự hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng. Những
khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các polypeptid
của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống nghiệm đã tiến hành
và xác nhận được vai trò quan trọng của các axít amin chìa khoá trong tính chất
xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999).
Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ
vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho
thấy, nếu gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc
nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stéphanie và cs,
2009). Một kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1vào cây lâm nghiệp tiêu biểu là:
Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 dưới sự điều
khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171), kết
quả cho thấy cây chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng
là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các dòng Dương lai
chuyển gen GS1đã được trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tại tỉnh Granada của
Tây Ban Nha, kết quả các dòng cây chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện
enzyme glutamine synthetase cao và có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với
giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng 21% đối với cây
trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3
năm tuổi) (Zhong và cs, 2004). Cùng với hướng nghiên cứu này, Fuentes và cs
(2001) cũng đã nghiên cứu chuyển gen GS1 với sự điều khiển promoter 35S vào
8


cây thuốc lá, kết quả cho thấy mức độ phiên mã và tổng hợp enzyme glutamine

synthetase tăng cao, hoạt tính enzyme GS1 ở lá cây chuyển gen tăng cao hơn 6
lần so với cây đối chứng. Dưới điều kiện có nguồn nitơ bình thường thì không
ảnh hưởng lớn tới quang hợp và phát triển của cây chuyển gen. Nhưng trong
điều kiện nguồn nitơ bị hạn chế, cây chuyển gen phát triển phần thân tăng 70%,
ở phần rễ tăng 100%, ở phần lá tăng 50% so với cây đối chứng không chuyển
gen.

Hình 1.1. Kết quả trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1. Cây
chuyển gen có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với giống gốc không chuyển gen
(chiều cao của cây chuyển gen tăng 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối
với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs,
2004).
1.2. Giới thiệu về gen tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ (GS1)
GS1 là một octamer protein bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối
lượng khoảng từ khoảng 38 – 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong
một số loài, như thuốc lá (Dubois và cs, 1996), cà chua (Becker và cs, 1992) củ
cải đường (Brechlin và cs, 1999), hoặc ở cây thông (Cantón và cs, 1999), GS1
của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở
các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành (Hirel và cs, 1987), GS1 có hai tiểu
đơn vị kích thước khác nhau được tìm thấy trong phân tử enzyme hoàn chỉnh.
Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây
đậu Pháp, tiểu phần cấu tạo nên GS1 được tạo thành từ hai chuỗi polypeptid
khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ liên quan đến sự
9


hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng, điều mà phần nhiều
chúng ta chưa biết. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và
chức năng của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến
gen trong ống nghiệm đã được tiến hành (Clemente và Márquez,1999), đã xác

nhận vai trò quan trọng của các axít amin chìa khoá trong tích chất xúc tác
của enzyme.
Các gen mã hoá cho GS trong thực vật được gọi là type II và hoàn toàn
giống như các sinh vật eukaryote khác, còn các gen mã hoá trong các sinh vật
prokaryote được gọi là type I, nhưng gần đây các công trình nghiên cứu của
Mathis và cs (2000) đã chứng minh rằng các gen type I cũng có mặt trong thực
vật và một họ gen nhỏ có thể được biểu hiện trong một số tổ chức cơ quan nhất
định.
Mặc dù thông thường chỉ có một gen mã hoá cho GS2 nhưng các nghiên
cứu trên một phổ rộng các loài đã cho thấy rằng GS1 được mã hoá bởi một họ
gen, có thể từ 3 đến 6 gen. Trong đậu Hà lan có 3 gen GS1 biểu hiện trong lá và
trong các tế bào Libe (phloem). Hai trong các gen đó là GS3A và GS3B có trình
tự tương đồng cao ở cả vùng mã hoá (99%) và vùng không mã hoá (96%),
polypeptid của chúng chỉ khác nhau ở 3 axít amin (Walker và cs, 1995). Năm
gen của GS1 được tách từ lá ngô bởi Li và cs (1993). Ba trong các gen này là
GS1-2, GS1-3, GS1-4 biểu hiện mạnh trong lá trưởng thành, trong mầm hạt và
trong thân ngô, hai gen còn lại GS1-5, GS1-1 biểu hiện trong mầm hạt, trong
thân nhưng không thấy biểu hiện trong lá. Những phân tích về hệ thống phát
sinh gen GS được nghiên cứu bởi Biesiadka và Legocki (1997).
Các nghiên cứu về rễ và các nốt rễ (Ireland và Lea, 1999) đã chỉ ra rằng
GS1 biểu hiện trong lá và tiếp sau đó là sự tổng hợp các polypeptid tương ứng.
Trong nhiều thực vật C3, GS1 được mã hoá bởi một gen, sự biểu hiện chủ yếu
ở rễ và biểu hiện càng mạnh mẽ trong lá già (Brugière và cs, 2000). Trong thực
vật C4, sự biểu hiện của gen GS1 xuất hiện chủ yếu ở rễ và chồi rồi giữ ở mức
độ cao trong cả hai cơ quan này trong suốt quá trình phát triển của thực vật
(Li và cs, 1993). Tìm thấy một hoặc hai gen trong họ đa gen của GS1 trong mô

10

vân lá của trong thực vật C3, C4, cây họ lúa và cây ngoài họ lúa (Dubois và cs,
1997).
Trong phloem protein GS đóng vai trò vận chuyển và tập hợp nitơ trong
cây (Sakurai và cs, 1996). Cũng có giả thuyết cho rằng có thể tồn tại một
enzyme khác có hoạt tính của enzyme GS1 trong phloem khác với enzyme GS1
trong lá và nốt sần. Để làm sáng tỏ giả thuyết này người ta phân tích cây thuốc
lá chuyển gen gây bất hoạt enzyme GS1 trong phloem và xác định vai trò của
enzyme GS1 trong quá trình tổng hợp prolin, là axít amin chỉ thị trong điều
kiện khô hạn.
1.3. Giới thiệu chung về thuốc lá và Bạch đàn Urô
1.3.1. Cây thuốc lá cây mô hình cho nghiên cứu chuyển gen
Trong chuyển gen thực vật, cây thuốc lá được xem xét như là loại cây mô
hình phục vụ cho các nghiên cứu đánh giá chức năng gen bởi vì hệ thống tái
sinh và tiếp nhận gen ngoại lai của cây thuốc rất hiệu quả, thời gian phân hóa
từ mô đến tạo cây hoàn chỉnh khá ngắn, mặt khác cây thuốc lá là cây ngắn
ngày, rễ trồng và chăm sóc nên dễ dàng thu được hạt để nghiên cứu các thế hệ
tiếp theo. Bởi vậy, hầu hết các công trình nghiên cứu về chức năng gen biểu
hiện trong thực vật đều sử dụng cây thuốc lá như là một cây mô hình để nghiên
cứu. Ngoài ra, các nhà khoa học xem cây thuốc lá là một hệ thống biểu hiện
gen ngoại lai cao nên các gen biểu hiện các protein/enzyme có giá trị được biểu
hiện trong cây thuốc lá sau đó tách chiết và tinh sạch, rất hiệu quả.
Đến nay, đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu thành công từ việc sử dụng
cây thuốc lá làm cây mô hình cho chuyển gen và các ứng dụng như: Mario
Pezzotti ở Đại học Verona đã tạo ra cây thuốc lá chuyển gen có khả năng sản
xuất interleukin có hoạt tính sinh học (một loại cytokinine có khả năng kháng
viêm). Theo tạp chí FASEB, các nhà khoa học Anh đã nghiên cứu chuyển gen
mã hóa cho kháng thể của microcystin - LR vào cây thuốc lá. Zhang và cs
(2007) đã nghiên cứu chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium chuyển vector
chứa 2 gen SbtCcry1 Ac và GNA kháng côn trùng vào đối tượng cây thuốc lá.
Theo NewScientist, các nhà khoa học Anh và Mỹ đã chuyển thành công gen mã

hóa kháng thể chống bệnh dại ở người vào cây thuốc lá. Thí nghiệm cho thấy
11


kháng thể từ thực vật biến đổi gen này rất có hiệu quả cao trong việc chống
virus gây bệnh dại. Nhóm khoa hóc của Neil Bruce, Đại học Cambridge đã
thành công trong việc cấy chuyển một gen của vi khuẩn Enterobacter cloacea
vào cây thuốc lá, giúp cây thuốc lá tiết ra một loại enzyme có thể hấp thụ và
chuyển đổi các phân tử thuốc nổ TNT trong đất thành chất không độc hại.
Công ty CropTech - Mỹ đã chuyển thành công một số gen của người vào cây
thuốc lá, loại cây thuốc lá này sẽ tạo ra các protein có khả năng trị nhiều bệnh.
Lina Gallego và cs (2008) cũng đã chuyển thành công các gen trong hệ thống
tổng hợp Gibberellin vào cây thuốc lá và cho thấy cây thuốc lá biến đổi gen
tăng trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng.
1.3.2. Giới thiệu về bạch đàn urô
Bạch đàn urô là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ
yếu ở Việt Nam. Bạch đàn urô là loài cây mọc nhanh, tăng trưởng đường kính
bình quân từ 1,25 cm đến 2 cm/năm, tăng trưởng chiều cao đạt từ 1,2 - 1,5
m/năm tùy theo điều kiện tự nhiên. Cây mọc thẳng, có thân tròn đều, ít bạnh
vè. Mặc dù tầm quan trọng của Bạch đàn urô trong trồng rừng sản xuất nhưng
năng suất của Bạch đàn urô ở Việt Nam còn thấp (8 -10 m³/hecta/năm) so với ở
các nước khác. Các nghiên cứu đánh giá về sinh trưởng của bạch đàn urô tại
Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn tại Việt Nam chậm hơn
so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin. Tăng trưởng chiều cao trung
bình hàng năm trong cả hai thử nghiệm ở độ tuổi 5 đạt được trong khoảng từ
1,9 - 2,7m3 (Kien và cs, 2009), so với 35 m3 đạt được ở Trung Quốc hay Brazil
(Santos và cs, 1990; Wei & Borralho, 1998). Rõ ràng cải tiến di truyền cho
Bạch đàn urô ở Việt Nam rất cần chú trọng thực hiện theo hướng tăng sức sinh
trưởng.
Những nghiên cứu chọn tạo giống Bạch đàn urô thông qua chọn dòng vô

tính đã đưa năng suất của rừng trồng Bạch đàn urô ở Việt Nam lên cao hơn.
Một khảo nghiệm được tiến hành tại vùng Trung tâm miền Bắc trong giai
đoạn 1998 - 2003 được tiến hành cho 36 dòng Bạch đàn urô và giống đối chứng
là cây hạt của Bạch đàn urô lấy từ sản xuất. Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính
tại một số xã thuộc huyện Tam Nông và Đoan Hùng cho thấy sau 3, 4, 5 năm
12


ba dòng Bạch đàn urô PN10, PN46 và PN47 là những dòng có thể tích thân cây
tương ứng là 101, 127 và 103,6 dm/cây với năng suất tương ứng là 23,38 và 30
m3 /hecta/năm. Trong khi giống đối chứng là cây hạt của Bạch đàn urô chỉ có
thể tích thân cây 41,4 - 43,8 dm /cây và năng suất chỉ đạt 8 -10 m3 /hecta/năm
(Nguyễn Sỹ Huống và cs, 2003).
Năm 2013, các nhà khoa học thuộc Viện Giống và Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu, chọn
tạo thành công giống Bạch đàn urô 262. Giống Bạch đàn urô 262 có các đặc
điểm chính như sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất bình quân đạt 23,9
m3/hecta/năm, không bị sâu bệnh, hiệu quả kinh tế cao gấp 1,5 - 2 lần so với
giống thông thường. Mặc dù, năng suất giống Bạch đàn urô ở nước ta đã được
cải thiện nhưng vẫn còn tương đối thấp so với các nước khác trên thế giới. Rất
cần tiếp tục những nghiên cứu về cải tiến giống, chăm sóc, gieo trồng. Trong đó
quan trọng hơn cả là công tác chọn tạo giống, hướng tạo ra những dòng Bạch
đàn urô sinh trưởng nhanh thông qua chuyển gen là một hướng giải quyết rất
có tiềm năng.

Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
2.1.1. Vật liệu
2.1.1.1. Vật liệu thực vật

- Dòng thuốc lá K326 in vitro được cung cấp bởi Viện Kinh tế kỹ thuật
thuốc lá và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Hạt giống Bạch đàn urô do Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.
2.1.1.2. Vật liệu chuyển gen
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển
gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 dưới sự điều
13


khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS-promoter
(sản phẩm của Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus
urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen”) do Phòng Công
nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam cung cấp.

Hình 2.1. Sơ đồ vector chuyển gen pBI121-35S/GS1. GS1: gen mã hóa cho
glutamine synthetase; CaMV35S: promoter 35S của virut khảm cây hoa lơ, nptIII:
gen chọn lọc kháng kháng sinh kanamycine; Nos: trình tự kết thúc của gen
nopaline synthase.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
2.1.2.1. Hóa chất
- Các hóa chất sử dụng cho tách ADN tổng số từ tế bào thực vật: CTAB
(Invitrogen), NaCl (Sigma), tris base (Sigma), EDTA (Sigma), đệm TESC (100
mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 0,4 M NaCl, 2% CTAB), SDS, CH3COOK,
NaCl isopropanol, cồn 70%, nước deion v.v.
- Các hóa chất dùng cho điện di axít nucleic: dung dịch đệm TAE 50X
(Tris base: 121 g, axít acetic glacia: 28,6 ml, 0,5 M EDTA pH 8,0: 50 ml, nước
khử ion vừa đủ: 500 ml), dung dịch đệm TAE 1X, agarose 1%; ethidium

bromide (EtBr) 0,5 µg/ml. Đệm kiểm tra mẫu DNA (Loading buffer).
- Các hóa chất dùng cho PCR : Taq ADN polymerase (Thermo
Scientific), đệm Taq ADN polymerase 10X, Pfu ADN polymerase (Thermo
Scientific), đệm Pfu ADN polymerase 10X, MgSO4 25 mM,dNTPs 2 mM mỗi
loa ̣i (Thermo Scientific), v.v.
14


- Các hóa chất: Javel 50%, nitơ lỏng, nước cất, acetosyringone; các
kháng sinh: kanamycin, cefotaxim, rifamicin.
2.1.2.2. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Tên môi trường

Thành phần môi trường

LB đặc

yeast extrac 5g/l; trypton 10g/l; NaCl 10g/l; agar 16g/l, pH =
7,0.

LB lỏng

yeast extrac 5g/l; trypton 10g/l; NaCl 10g/l; pH = 7,0.

Dịch lỏng tạo dịch Môi trường cơ bản 1/2 MS không bổ sung agar
huyền
khuẩn

phù

vi

- Môi trường nuôi cấy thực vật:
Bảng 2.2. môi trường nuôi cấy thuốc lá
Tên môi

Kí

trường

hiệu

Thành phần môi trường

Tái sinh

TS

MS + 30g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8

Đồng nuôi cấy

CoTL

MS + 30g/l sucrose + 7,5 g/l agar+ AS 50µM, pH=5,8

Chọn lọc cây
chuyển gen

CLTL50

MS + 1 mg/l BAP + 30g/l sucrose + 500 mg/l
cefotaxime + 50 mg/l kanamycin + 7,5 g/l agar,
pH=5,8

Ra rễ

RR50

MS + 30g/l sucrose + 500 mg/l cefotaxime + 50 mg/l
kanamycin + 7,5 g/l agar, pH=5,8

15


Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy Bạch đàn
Tên môi

Thành phần môi trường

Kí hiệu

trường
Gieo hạt

MS0

Tiền nuôi cấy

Pre-T

cho thân mầm
Tiền nuôi cấy

MS + 30g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8
MSBĐ* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 20g/l
sucrose + 2,6 g/l gellan + 50 µM AS, pH = 5,8

Pre-L

cho lá mầm

MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 20g/l
sucrose + 2,6 g/l gellan + 50 µM AS, pH = 5,8

Đồng nuôi cấy

Co-T

cho thân mầm
Đồng nuôi cấy

MSBĐ* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 20g/l
sucrose + 2,6 g/l gellan + 100 µM AS, pH = 5,8

Co-L

cho lá mầm

MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 20g/l
sucrose + 2,6 g/l gellan + 100 µM AS, pH = 5,8

Tái sinh thân

Aft-T

mầm

MSBĐ* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA+ 20g/l
sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime, pH =
5,8

Tái

sinh

lá

Aft-L

mầm

MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 20g/l
sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime, pH =
5,8

Chọn lọc cây CL-T150

MSBĐ*+ 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA+ 20g/l

chuyển gen từ

sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime + 150

thân mầm

mg/l kanamycin, pH = 5,8

Chọc lọc cây CL-L150 MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 20g/l
chuyển gen từ

sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime + 150

lá mầm

mg/l Kanamycin, pH = 5,8

Ra rễ

RR100

½ MS giảm ½ Nitơ tổng số + 0,5 mg/l NAA + 0,2
mg/l IBA + 20g/l sucrose + 250 mg/l cefotaxime + 75
mg/l kanamycin

MSBĐ*:MS giảm ½ nitơ tổng số + 100 mg/l nước dừa (dừa bánh tẻ).

16

2.1.2.3. Máy móc và thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ tế
bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam: Bao gồm các loại box cấy vô trùng; nồi khử trùng; bể ổn nhiệt; máy
nước cất; máy đo pH; máy đo OD; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh gel;
tủ ấm; tủ lắc; dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của
các hãng: Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech, Sartorius, Olympus,
v.v.
2.2. Địa điểm và thời gian
-

Địa điểm: tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công

nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
-

Thời gian: từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 6 năm 2015.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
Toàn bộ quy trình nghiên cứu được tóm tắt qua sơ đồ 2.1
TẠO VẬT LIỆU

TẠO DỊCH HUYỀN

CHUYỂN GEN

PHÙ VI KHUẨN

BIẾN NẠP VÀ ĐỒNG
NUÔI CẤY

CHỌN LỌC MẪU MÔ BIẾN NẠP TRÊN
MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC

CHỒI CHUYỂN GEN TÁI SINH TRÊN MÔI
TRƯỜNG RA RỄ
Phân tích PCR

KIỂM TRA CÂY

Phân tích
Southern blot

CHUYỂN GEN

Đánh giá sinh
trưởng

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát.
17


2.3.1. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá
2.3.1.1. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens
Chuyển gen vào thuốc lá được thực hiện theo phương pháp của
Topping cải tiến (1998), sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens có chứa vector
chuyển gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1dưới sự
điều khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOSpromoter. Các bước được tiến hành như sau:

Bước 1: chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm được
bảo quản trong glycerol -800C được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có chứa
kháng sinh chọn lọc, nuôi tối ở 280C trong 2 ngày.
Bước 2: cây con in vitro phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành
biến nạp. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1 cm2.
Bước 3: một ngày trước khi biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập
nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16h).
Sau đó nuôi phục hồi thêm 4h trong 100 ml LB lỏng không bổ sung kháng sinh
chọn lọc.
Bước 4:biến nạp:
- Khuẩn sau khi nuôi được đem đo OD650=0,5-0,7 thì sử dụng để biến
nạp.
- Đem ly tâm thu cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch ½
MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn.
Các mảnh lá được chuyển sang bình tam giác có chứa dịch huyền phù vi
khuẩn.
Bước 5: sau 10 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm khử trùng, thấm khô và
cấy lên môi trường CL-TL150
Bước 6: sau 2-3 tuần các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo, chuyển
sang môi trường CL-TL150
Bước 7: sau 4-6 tuần các mảnh lá đã tạo chồi, các chồi phát triển tốt được
chuyển sang môi trường tạo rễ RR50
Bước 8: cây con ra nhiều rễ, cao 5-7 cm thì được đưa ra bầu chứa giá thể đất:
trấu: cát (1:1:1). Sau đó cho cây vào túi nilông, ghim phần trên và đưa vào
18