Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ streptomyces 184 29

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN ANH DŨNG
Mã sinh viên: 1201100

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH TỪ STREPTOMYCES 184.29
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017



LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo, PGS.TS Cao
Văn Thu – ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn em từ những ngày đầu nghiên cứu khoa học tới
khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng dạy
công tác tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Viện Công nghệ
Dƣợc phẩm quốc gia trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm
khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực
hiện khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô giáo,
cán bộ, viên chức trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi
cho em trong quá trình học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm,
động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận này.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng nhƣ kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận
này còn nhiều thiết sót. Em rất mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến từ thầy cô và bạn
bè để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2017
Sinh viên

PHAN ANH DŨNG



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................... 2
1.1. Đại cƣơng về xạ khuẩn ....................................................................................... 2
1.1.1.

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces ................................. 2

1.1.2.

Đặc điểm sinh lý ....................................................................................... 3

1.1.3.

Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces ............................ 3

1.2. Đại cƣơng về kháng sinh .................................................................................... 3
1.2.1.

Định nghĩa về kháng sinh ......................................................................... 3

1.2.2.

Phân loại kháng sinh................................................................................. 4

1.2.3.

Ứng dụng của kháng sinh ......................................................................... 4

1.3. Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh ..................................................... 5
1.3.1.

Sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................................. 5

1.3.2.

Đột biến nhân tạo ..................................................................................... 5

1.3.3.

Nghiên cứu các điều kiện lên men ........................................................... 6

1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ..................................................................... 6
1.4.1.

Khái niệm ................................................................................................. 6

1.4.2.

Các phƣơng pháp lên men ........................................................................ 6

1.4.3.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ........................................... 8

1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh ....................................................................... 8
1.5.1.

Chiết tách .................................................................................................. 8

1.5.2.

Tinh chế kháng sinh ................................................................................. 8

1.6. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh bằng đo phổ .................................................... 9
1.6.1.

Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................................. 9

1.6.2.

Phổ tử ngoại (UV-VIS) ............................................................................ 9

1.6.3.

Phổ khối (MS) ........................................................................................ 10

1.6.4.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ...................................................... 10

1.7. Một số nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces ............................................... 10
1.7.1.
Phân lập và xác định cấu trúc của kháng sinh Strepturidin từ
Streptomyces albus DSM 40763 ............................................................................ 10
1.7.2.
Tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy Streptomyces sp.17944 cho việc sản
xuất tirandamycin B, phân lập và xác định cấu trúc của các tirandamycin H, I, J.
11
1.7.3.

Phân lập và mô tả quá trình nuôi cấy Actinomycetes từ đất. .................. 11

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 13
2.1. Nguyên liệu ......................................................................................................... 13
2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................... 13
2.1.2. Môi trƣờng ................................................................................................... 13
2.1.3. Hóa chất ....................................................................................................... 15
2.1.4. Một số dụng cụ, máy móc ............................................................................ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 17
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm .................................................................................. 17
2.3.1. Phƣơng pháp giữ giống trong ống nghiệm .................................................. 17
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khuếch tán .................... 17
2.3.3. Xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp ..................................................... 19
2.3.4. Phƣơng pháp cải tạo giống ........................................................................... 19
2.3.5. Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh ..................................................... 21
2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ ................................... 22
2.3.7. Thu bột kháng sinh thô bằng phƣơng pháp cất quay ................................... 22
2.3.8. Phƣơng pháp tách các thành phần trong kháng sinh bằng phƣơng pháp sắc
kí ............................................................................................................................. 22
2.3.9. Phƣơng pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết .......................................... 24

2.3.10. Phƣơng pháp xác định cấu trúc kháng sinh ............................................... 24
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .................................................................... 25
3.1. Kết quả lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy và VSV kiểm định .............................. 25


3.2. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên ............................................................................ 25
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống .......................................................................... 26
3.3.1.

Kết quả đột biến UV lần 1 ...................................................................... 26

3.3.2.

Kết quả đột biến UV lần 2 ...................................................................... 27

3.3.3.

Kết quả đột biến hóa học ........................................................................ 28

3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh ...................................................... 29
3.4.1.

Chọn môi trƣờng lên men tốt nhất ......................................................... 29

3.4.2.

Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất............................... 30

3.5. Dung môi và pH chiết xuất ............................................................................... 31
3.6. Kết quả sắc ký lớp mỏng .................................................................................. 31

3.7. Kết quả sắc ký cột ............................................................................................. 32
3.7.1.

Chạy cột lần 1 ......................................................................................... 32

3.7.2.

Chạy cột lần 2. ........................................................................................ 34

3.7.3.

Chạy cột lần 3. ........................................................................................ 35

3.8. Sơ bộ xác định cấu trúc, tính chất của kháng sinh thu đƣợc ............................... 36
3.8.1. Kết quả đo phổ tử ngoại và đo nhiệt độ nóng chảy ..................................... 36
3.8.2. Kết quả đo phổ hồng ngoại .......................................................................... 37
3.8.3. Kết quả đo phổ khối (MS)............................................................................ 38
3.8.4. Kết quả đo cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................................ 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ cái viết tắt/ký
hiệu

Cụm từ đầy đủ

ARN

Acid ribonucleic

DMHC

Dung môi hữu cơ

ĐB

Đột biến

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr(+)

Gram dƣơng

Gr(-)

Gram âm

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Infra Red (phổ hồng ngoại)

KS

Kháng sinh

MS

Mass Spectrometry (phổ khối)

MT

Môi trƣờng

MTdt

Môi trƣờng dịch thể

NMR

Nuclear magnetic resonance (cộng hƣởng từ hạt
nhân)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

s

Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

UV

Ultra Violet (tử ngoại)

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh………………………………………………………..4
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định………………………………………………….13
Bảng 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn……………………………………………..14
Bảng 2.3. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định…………………...15
Bảng 2.4. Các dung môi hữu cơ sử dụng trong nghiên cứu…………………………..15
Bảng 2.5. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu……………………………………16
Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên……………………………………………….25
Bảng 3.2. Kết quả đột biến UV lần 1………………………………………………….27
Bảng 3.3. Kết quả đột biến UV lần 2………………………………………………….28
Bảng 3.4. Kết quả đột biến hóa học…………………………………………………...29
Bảng 3.5. Kết quả chọn môi trƣờng lên men………………………………………….30
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính dịch lên men của các dạng chủng, biến chủng……...30
Bảng 3.7. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi……………………………......31
Bảng 3.8. Kết quả thử HTKS sau chạy cột lần 1……………………………………...32
Bảng 3.9. Kết quả SKLM sau chạy cột lần 1………………………………………….33
Bảng 3.10. Kết quả SKLM sau chạy cột lần 2………………………………………...34
Bảng 3.11. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 3………………………...35
Bảng 3.12. Kết quả đo phổ UV………………………………………………………..36

Bảng 3.13. So sánh phổ NMR của actinomyces X2 với chất KS1……………………40


ĐẶT VẤN ĐỀ
“Vi khuẩn đang kháng thuốc và chúng ta phải nhanh chóng tìm ra các biện pháp
chữa trị phù hợp. Nếu tình trạng này cứ tiếp diễn, chúng ta sẽ không thể chế tạo ra các
loại thuốc chữa bệnh kịp thời” Marie-Paule Kieny, trợ lý Tổng giám đốc trong lĩnh
vực hệ thống y tế và đổi mới của WHO phát biểu ngày 27/2/2017
Thật vậy, mặc dù kháng sinh từng đƣợc coi là thần dƣợc chữa trị đƣợc các bệnh
nhiễm khuẩn nguy hiểm, nhƣng hiện nay việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến những
hậu quả nghiêm trọng mà chúng ta đang phải đối mặt. Kháng kháng sinh hiện nay đang
là vấn đề rất cấp bách của nhân loại. Bởi vậy, việc liên tục nghiên cứu và phát triển các
thuốc kháng sinh mới là vô cùng cấp thiết.
Trên 60% kháng sinh là do xạ khuẩn tạo ra và chi Streptomyces chiếm khoảng
60%. Chi xạ khuẩn này là một chi lớn, đƣợc các nhà khoa học đánh giá cao vì có khả
năng sinh kháng sinh có tác dụng tốt.
Bộ môn Vi sinh – Sinh học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội trong nhiều năm qua đã
đầu tƣ nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp kháng
sinh. Để tiếp tục góp phần vào công cuộc tìm kiếm và cải tạo giống kháng sinh tôi đã
lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.29” làm đề tài
khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ. Khóa luận mong muốn đạt đƣợc những mục tiêu sau đây:
1. Nghiên cứu cải tạo giống theo hƣớng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh.
2. Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế kháng sinh do Streptomyces 184.29
tổng hợp.
3. Sơ bộ xác định một số đặc tính của kháng sinh tinh chế.

1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Đại cƣơng về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi
trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gr (+), có tỷ lệ G+C>55%. Chúng có mặt rộng rãi trong
đất, nƣớc, bùn,… và cả cơ chất mà vi khuẩn cũng nhƣ nấm mốc không phát triển.
Trung bình mỗi gam đất nói chung có hàng triệu xạ khuẩn.
Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn. Xạ khuẩn
có thể sinh tổng hợp đƣợc nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nhƣ kháng sinh,
vitamin, acid hữu cơ, ngoài ra xạ khuẩn còn đƣợc dùng để điều chế nhiều loại enzyme
(amylase, cellulose, glucoisomerase, protease…) [1], [6].
1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces
Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Đƣờng
kính của khuẩn ti từ 0,2-1,0 µm đến 2,0 µm. Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng
lƣới, dày khoảng từ 10-20 nm. Khuẩn ti cơ chất là khuẩn ti cơ bản, còn khuẩn ti khí
sinh phát triển mạnh hay yếu tùy thuộc vào từng chi, loài. Màu sắc của khuẩn ti rất
phong phú và đa dạng: trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu, đen… [1], [6], [7].
Khuẩn ti cơ chất mọc sâu vào môi trƣờng nuôi cấy, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có
thể tiết ra môi trƣờng một số loại sắc tố, có sắc tố chỉ tan trong nƣớc, có sắc tố chỉ tan
trong dung môi hữu cơ [1]. Đặc biệt một số xạ khuẩn không có khuẩn ti khí sinh mà
chỉ có khuẩn ti cơ chất, làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền.
[10].
Khuẩn ti cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành
khuẩn ti khí sinh, có đƣờng kính từ 1,0-1,4 µm. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh
khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể có nhiều hình dạng
khác nhau (thẳng, uốn cong, lƣợn sóng, móc đơn, móc vòng, xoắn lò xo…). Các chuỗi
bào tử này phân cách thành bào tử trần, bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ
khuẩn. Bào tử trần có thể có hình cầu, hình bầu dục, hình trụ. Các bào tử tập hợp với

2


nhau thành chuỗi 30-50 bào tử hoặc nhiều hơn. Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn (sm),
xù xì (wa), có gai (sp), hoặc có tóc (ha). Ngƣời ta còn gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn ti
thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp (khuẩn ti mọc từ khi bào tử nảy mầm). [1],
[12].
1.1.2. Đặc điểm sinh lý
Streptomyces là chi VSV dị dƣỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển chúng phân
giải carbonhydrat làm nguồn cung cấp vật chất và năng lƣợng, đồng thời thủy phân các
hợp chất nhƣ gelatin, casein, tinh bột. Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit. Ngoài
ra Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ tối thích thƣờng là 25-30ºC,
một vài loại có thể phát triển tốt ở nhiệt độ cao, pH tối thích thƣờng từ 6,8-7,5. Ngoài
ra chúng còn khả năng tạo sắc tố: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của
khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [1], [12].
1.1.3. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh
nhất và có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số kháng sinh đã tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp thì có 60% đƣợc tổng hợp từ Strepmocytes.
1.2.

Đại cƣơng về kháng sinh

1.2.1. Định nghĩa về kháng sinh
Kháng sinh là những vật phẩm trao đổi chất tự nhiên đƣợc các VSV tạo ra, có tác
dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc đối với các sinh vật khác.
(Waksman 1942)
Tuy nhiên định nghĩa này khá hạn chế vì nhƣ vậy nhóm các kháng sinh thực vật,
động vật cũng nhƣ các kháng sinh bán tổng hợp và các hợp chất hóa học có tác dụng
tiêu diệt chọn lọc các VSV khác đều không đƣợc đề cập đến. Do vậy ngày nay theo

nghĩa rộng có thể hiểu: “Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

3


hợp và bán tổng hợp có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các
vi sinh vật nhiễm sinh ở nồng độ thấp”. [6]
1.2.2. Phân loại kháng sinh
Phân loại kháng sinh dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, phân loại theo nguồn
gốc, con đƣờng sinh tổng hợp… Tuy nhiên phân loại theo cấu trúc hóa học là khoa học
nhất, đƣợc trình bày theo bảng 1.1. [2], [3], [5].
Bảng1.1. Phân loại kháng sinh
Nhóm kháng sinh

Ví dụ

β-Lactam

Penicillin, cefoperazon, …

Phenicol

Chloramphenicol, thiamphenicol…

Aminoglycosid

Gentamicin, neomycin…

Macrolid

Azithromycin, spiramicin…

Lincosamid

Lincomycin, lindamycin…

Tetracycline

Minocyclin, methacyclin…

Peptid

Vancomycin, polymycin…

Quinolon

Ciprofloxaxin, levofloxacin…

Cotrimoxazol

Trimethoprim, sulfamethoxazol…

1.2.3. Ứng dụng của kháng sinh
1.2.3.1. Trong lĩnh vực y học
Kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn, nấm gây ra. Ngày nay, một số
kháng sinh còn đƣợc dùng trong điều trị ung thƣ (daunorubicin, dactinomycin D…)
[1], [15].

4

1.2.3.2. Ngoài lĩnh vực y học
Trong chăn nuôi: kháng sinh đƣợc dùng để điều trị các bệnh cho động vật. Kháng
sinh còn đƣợc sử dụng nhƣ chất kích thích tăng sản lƣợng trứng ở gà, vịt hay sử dụng
nhƣ các chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm.
Trong trồng trọt: kháng sinh đƣợc dùng để đấu tranh với bệnh thực vật, phƣơng
pháp thông dụng nhất là xử lý hạt bằng kháng sinh trƣớc khi gieo trồng hoặc xử lý đất
bằng kháng sinh hay các VSV đối kháng trong đất.
Trong công nghiệp thực phẩm: kháng sinh đƣợc dùng để bảo quản thực phẩm tƣơi
và các thực phẩm đóng hộp tránh khỏi sự phân hủy do VSV gây ra. [1], [6].
1.3.

Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh

VSV không đƣợc sử dụng trong công nghiệp kháng sinh dƣới dạng hoang dại vì có
hoạt tính thấp. Vì vậy, muốn thu đƣợc chúng có hoạt tính cao để đƣa vào sản xuất công
nghiệp cần sử dụng các phƣơng pháp cải tạo, tuyển chọn giống, đồng thời nghiên cứu
cải tạo môi trƣờng nuôi cấy.
1.3.1. Sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV bị biến dị tự nhiên (đột biến tự phát) theo tần suất khác nhau (ngay cả
trong một số phƣơng pháp giữ giống thuần khiết), trong đó có cá thể hoạt tính sinh
tổng hợp kháng sinh tăng lên 20-30% so với các cá thể khác. Nhiệm vụ của việc cải tạo
giống là cần phải tuyển chọn lấy các cá thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Tuy nhiên phƣơng pháp sàng lọc các cá thể đột biến tự phát có hoạt tính cao chỉ sử
dụng để nghiên cứu ban đầu, không có giá trị để áp dụng vào sản xuất. Để thu đƣợc các
chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh có giá trị trong công nghiệp cần phải áp
dụng các phƣơng pháp đột biến nhân tạo. [1], [6].
1.3.2. Đột biến nhân tạo
Cho các chủng VSV chịu tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh nhƣ tia X,
UV hay các tác nhân hóa học nhƣ ethylenimin, dimethylsulfat, nitrosoguanidin… phần

5


lớn các VSV bị giết chết. Trong số các cá thể còn sống sót xuất hiện nhiều dạng đột
biến (do thay đổi ở nhiễm sắc thể làm thay đổi tính trạng), hoặc là giảm (mất) khả năng
tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hoặc là tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (đột
biến dƣơng tính).
1.3.3. Nghiên cứu các điều kiện lên men
Cùng với các công việc cải tạo giống cần tiến hành nghiên cứu các điều kiện nuôi
cấy thích hợp nhƣ thành phần môi trƣờng, nhu cầu oxy hòa tan, pH, nhiệt độ, tiền chất,
thời gian nuôi cấy… Và khi các thông số đạt đƣợc tối ƣu sẽ giúp tăng hiệu suất của quá
trình sinh tổng hợp kháng sinh lên 2 đến 3 lần [9], [12]
1.4.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1. Khái niệm
Kỹ thuật lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong các điều kiện tối ƣu để sản xuất
các sản phẩm trao đổi chất nhờ chính các VSV ấy hoặc các thành phần tế bào của
chúng [6].
1.4.2. Các phƣơng pháp lên men
Có 2 phƣơng pháp lên men chính:
 Lên men bề mặt
Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trƣờng rắn, đặc hay
lỏng. Môi trƣờng rắn thƣờng dùng là cám, bột ngô, tấm, gạo…, lỏng thƣờng là nƣớc
đƣờng, nƣớc bã rƣợu, rỉ đƣờng (kết hợp với một số chất khoáng). VSV hấp thụ các
chất dinh dƣỡng của môi trƣờng và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt của
môi trƣờng dinh dƣỡng. Các ứng dụng chủ yếu của kỹ thuật lên men là: nuôi cấy nấm
mốc sản xuất enzyme, VSV sản xuất acid hữu cơ, xạ khuẩn nuôi trên gạo hoặc bột ngô
để sản xuất kháng sinh phục vụ cho chăn nuôi, sản xuất kháng sinh cho ngƣời ở giai

đoạn đầu của công nghiệp kháng sinh.

6


Ƣu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, đầu tƣ ban đầu thấp, không đòi hỏi thiết
bị phức tạp.
Nhƣợc điểm: hiệu suất sử dụng trƣờng không gian thấp, khó vô trùng, đòi hỏi diện
tích rộng, khó cơ giới hóa và tự động hóa. Vì những nhƣợc điểm này mà ngày nay
công nghiệp kháng sinh không áp dụng kỹ thuật bề mặt để lên men sản xuất, chỉ sử
dụng trong phòng thí nghiệm để chọn giống. [5], [6].
 Lên men chìm
Trong lên men chìm VSV đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng, phát triển trong không
gian ba chiều của môi trƣờng. Phƣơng pháp này dùng cho cả VSV hiếu khí và kị khí.
Ƣu điểm: dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
Nhƣợc điểm: đầu tƣ trang thiết bị kỹ thuật lên men ban đầu lớn [5], [6].
Có 4 kiểu lên men chìm:
- Lên men mẻ: VSV đƣợc nuôi giới hạn trong bình lên men với một thể tích môi
trƣờng xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc quá trình
lên men ngƣời ta thu lấy dịch lên men chứa sản phẩm.
- Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trƣờng dinh
dƣỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó nâng cao đƣợc hiệu quả sử
dụng bình lên men.
- Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc rút bớt dịch lên men và bổ
sung thêm môi trƣờng dinh dƣỡng không đƣợc thực hiện liên tục mà định kì sau những
khoảng thời gian nhất định.
- Lên men liên tục: là quá trình lên men đƣợc bổ sung liên tục môi trƣờng dinh
dƣỡng vào bình lên men, đồng thời cùng một lúc lấy bớt ra khỏi hệ thống đồng lƣợng
dịch lên men đã biến đổi cùng với VSV có trong đó. [5], [6].

7


1.4.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
- Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hƣởng tới tốc độ sinh trƣởng, kiểu sinh sản, hình thái,
trao đổi chất và nhu cầu dinh dƣỡng của VSV. Ở nhiệt độ thấp, VSV không phát triển
đƣợc, tuy nhiên ở nhiệt độ cao VSV cũng bị chết do biến tính protein và kể cả ARN.
Do vậy thiết bị lên men cần có bộ phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ tối
thích cho vi sinh vật phát triển.
- pH: pH môi trƣờng ảnh hƣởng tới quá trình lên men do tác dụng trực tiếp của
các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc là tác dụng
gián tiếp. pH thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh thƣờng là pH trung tính, pH acid
hay kiềm đều ức chế tổng hợp.
- Oxy hòa tan: thiếu oxy sẽ phá vỡ trao đổi chất bên trong tế bào, vì thế phải cung
cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tƣơng thích với tốc độ sử dụng oxy của VSV [13].
1.5.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh

1.5.1. Chiết tách
Tùy các đặc tính của loài VSV mà kháng sinh đƣợc tiết vào dịch lên men
(penicillin, streptomycin …) hay giữ lại trong tế bào (nystatin, griseofulvin …). Để sản
xuất đƣợc các chất kháng sinh có độ tinh khiết cao cần ứng dụng các phƣơng pháp
chiết xuất, tinh chế thích hợp. Trong công nghiệp có thể chiết tách bằng 3 phƣơng pháp
chính: chiết bằng dung môi hữu cơ (không đồng tan với nƣớc), tạo phức tủa thích hợp
hay sử dụng nhựa trao đổi ion, hoặc kết hợp linh hoạt các phƣơng pháp trên. [6]
1.5.2. Tinh chế kháng sinh
Phƣơng pháp sắc kí là một nhóm các phƣơng pháp hóa lý dùng để tách các chất
riêng rẽ từ một hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích đƣợc

hòa tan trong một pha động, đƣợc cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn
với nó. Pha tĩnh đƣợc cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành
phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tƣơng tác giữa
pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của
8


mẫu sẽ đƣợc tách riêng biệt thành dải trên sắc kí đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính
hay định lƣợng.
 Sắc kí lớp mỏng (TLC): pha tĩnh là chất hấp thụ, đƣợc cố định trên bản mỏng,
pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc pha theo tỷ lệ. Pha động di
chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.
 Sắc kí rửa giải trên cột: pha tĩnh đƣợc giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ
áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải đƣợc thực hiện bằng cách thêm liên tục lƣợng
mới của pha động.
Mẫu phân tích đƣợc đƣa vào đầu cột, khi đƣa thêm các phần mới của pha động vào
cột buộc pha động hòa tan theo mẫu di chuyển xuống theo cột. Trong quá trình di
chuyển có sự phân bố mẫu giữa hai pha, sự khác nhau về tốc độ sẽ phân các thành phần
trong hỗn hợp thành các vùng khác nhau dọc theo chiều dài cột. [4], [11].
1.6.

Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh bằng đo phổ

1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Nguyên tắc: Ở nhiệt độ bình thƣờng các liên kết của hợp chất đã có sự dao động
nhƣ là sự chuyển dạng của phân tử, đó là dao động hóa trị và dao động biến dạng. Hấp
thụ bức xạ hồng ngoại làm tăng các dao động này. Các phân tử hấp thụ bức xạ hồng
ngoại và chuyển thành năng lƣợng quay cực phân tử. Sự hấp thụ năng lƣợng cũng đƣợc
lƣợng tử hóa do đó phổ quay của phân tử bao gồm những vạch rõ rệt. Các vạch này đặc
trƣng cho các nhóm chức khác nhau, do vậy phổ hồng ngoại đƣợc dùng nhƣ một công

cụ phân tích để nhận ra các nhóm chức đặc biệt trong phân tử.
1.6.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS)
Nguyên tắc: dựa trên sự hấp thụ năng lƣợng các bức xạ ánh sáng vùng UV-VIS bởi
các phân tử của chất nghiên cứu làm thay đổi mức năng lƣợng điện tử (E0, E1, E2…).
Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những
phân tử nào có điện tử dễ bị kích thích mới hấp thu năng lƣợng ánh sáng để chuyển từ

9


trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích (phân tử có nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố
N, S, O…) [4]
1.6.3. Phổ khối (MS)
Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp khối lƣợng và điện tích của ion (m/z)
đƣợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu phân tích. Dùng chùm
điện tử có năng lƣợng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không
cao (10-6 mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh.
Các tín hiệu thu đƣợc tƣơng ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cƣờng độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ.
Khối phổ cung cấp thông tin định tính (khối lƣợng phân tử, nhận dạng các chất)
xác định cấu trúc và định lƣợng các chất [11].
1.6.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Hiện tƣợng một hạt nhân nguyên tử nằm trong từ trƣờng hấp thu năng lƣợng điện
từ của sóng điện từ biến thiên, rồi cộng hƣởng, bức xạ năng lƣợng đƣợc ghi lại đƣợc
gọi là phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR). Cộng hƣởng từ hạt nhân cũng đƣợc xem là
một nhóm các phƣơng pháp khoa học áp dụng vào việc nghiên cứu các phân tử. Có rất
nhiều hạt nhân đƣợc nghiên cứu nhƣng Hydro và Carbon là phổ biến nhất [24],[25].
1.7.

Một số nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces

1.7.1. Phân lập và xác định cấu trúc của kháng sinh Strepturidin từ Streptomyces
albus DSM 40763
Kháng sinh strepturidin (1) đƣợc phân lập từ chủng Streptomyces albus DSM
40763. Cấu trúc của nó đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp quang phổ và nghiên cứu
hóa học. Các nhà khoa học đã xác định một cách tƣơng đối và tuyệt đối một phần dựa
vào cách sử dụng phƣơng pháp phân tích GC-EI-MS và phân tích sự hình thành vòng
acetal, và tiếp theo đó là phân tích phổ 2DNMR, phân tích 1HNMR, 13C NMR.

10


Kết quả nuôi cấy: Streptomyces albus (S.albus)đã đƣợc mô tả nhiều từ trƣớc, chủ
yếu bởi Gordon, Bottiger, và Herrmann. Chủng Streptomyces này có thể đƣợc phân lập
một cách dễ dàng từ môi trƣờng tự nhiên của chúng, cỏ khô hoặc phân hữu cơ ủ ấm, và
đƣợc xác định một cách rất nhanh chóng bởi những đặc tính kinh điển. Chủng DSM
40763 đã đƣợc sàng lọc từ rất nhiều đại dạng chủng của chủng này, chủng mà vẫn còn
giữ đƣợc tính đa dạng phong phú. Chủng Actinomyces DSM 281 đƣợc sử dụng để
nghiên cứu. [20]
1.7.2. Tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy Streptomyces sp.17944 cho việc sản xuất
tirandamycin B, phân lập và xác định cấu trúc của các tirandamycin H, I, J.
Các nhà khoa học gần đây đã phân lập đƣợc tirandamycin (TAM) B từ
Streptomyces sp. 17944 là nhân tố ức chế Brugia malayi AsnRS (BmAsnRS) có thể diệt
một cách hiệu quả ký sinh trùng B.malayi trƣởng thành. Hiện tại các nhà khoa học đã
công bố những so sánh của các chất chuyển hóa của S. sp. 17944 trên 6 môi trƣờng,
xác định đƣợc môi trƣờng cho khả năng sản xuất tối ƣu của TAM B bởi đó là chất
chuyển hóa cơ bản cũng nhƣ phân lập và sơ bộ xác định cấu trúc của 3 loại TAM mới.
Những tìm kiếm này cho ta một cái nhìn cụ thể hơn mối quan hệ về cấu trúc hoạt động
của TAM B cũng nhƣ là chất ức chế BmAsnRS.
Phân lập và xác định cấu trúc: Lên men mẻ lớn cùng với một số điều kiện kèm

theo đã cho ra 3 TAM mới hiệu quả, chất 6 (8,7mg), chất 7 (6,9mg), chất 8 (2,8mg).
Công thức của chất 6 đƣợc xác định là C22H29NO8 dựa vào phổ giải phóng ion điện hóa
cao (HRESIMS: high resolution electrosporay ionization mass sprectromery). [21]
1.7.3. Phân lập và mô tả quá trình nuôi cấy Actinomycetes từ đất.
Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập một số dòng Actinomycetes sinh ra từ đất
nông nghiệp bằng cách sử dụng môi trƣờng thạch Agar để phân lập Actinomycetes. Các
chất chuyển hóa của Actinomycetes đƣợc thử nghiệm về khả năng kháng khuẩn thông
qua sàng lọc ban đầu sử dụng phƣơng pháp thạch agar. Hoạt tính kháng khuẩn đƣợc
kiểm tra trên các chủng vi khuẩn là Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus
11


aureus, Klebsiella viêm phổi và Pseudomonas sp. 15 chuỗi Actinomycetes đã đƣợc
phân lập đƣợc tiến hành sàng lọc sơ cấp. Hoạt tính kháng khuẩn trong sàng lọc sơ cấp
chống lại các vi khuẩn khác nhau đã đƣợc quan sát thấy trong 12 mẫu phân lập. Sau
khi sàng lọc sơ bộ, việc sản xuất kháng sinh đã đƣợc thực hiện bằng quá trình lên men
chìm. Các chất phân lập đƣợc ACM 4, ACM 5 và ACM 8 cho thấy hoạt tính của chúng
trong sàng lọc thứ cấp đối với các vi sinh vật đƣợc kiểm tra. Các chất chuyển hóa thứ
cấp từ Actinomycetes phân lập đƣợc có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn dựa
trên sự hình thành các vòng vô khuẩn với kích thƣớc khác nhau. Chất phân lập ACM 4
có vòng vô khuẩn cực đại 21mm trên E. coli và K. pneumoniae. Các chất phân lập
ACM5 và ACM8 cho vòng vô khuẩn tối đa lần lƣợt là 25mm và 18mm trên S. aureus.
[22].

12


CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật

Giống xạ khuẩn: chủng Streptomyces 184.29 do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trƣờng
Đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp, đƣợc phân lập từ mẫu đất tại Tây Ninh.
Vi sinh vật kiểm định: do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội cung cấp, đƣợc trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định
Vi khuẩn

Gram (+)

Gram (-)

Viết tắt

Bacillus cereus ATCC 9946

B. cereus

Bacillus pumilus ATCC 6633

B. pumilus

Bacillus subtilis ATCC 10241

B. subtulis

Sarcina lutea ATCC 9341

S. lutea

Staphylococcus aureus ATCC 1128

S. aureus

Escherichia coli ATCC 25992

E. coli

Proteus mirabilis BV 108

P. mirabilis

Pseudomonas aeruginosa VM 201

P. aeruginosa

Salmonella typhi DT 220

S. typhi

Shigella flexneri DT 112

S. flexneri

2.1.2. Môi trƣờng
Môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn: MT1, MT2, MT5, MT6, MT7 đƣợc trình bày trong
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

13

Thành phần

Đơn vị

MT1

MT2

2

2

MT5
2,4

MT6

MT7

Tinh bột

g

2

Lactose

g

Glucose

g

Saccharose

g

Bột đậu tƣơng

g

Cao thịt

g

0,3

0,3

Pepton

g

0,3

0,5

KNO3

g

KCl

g

0,05

NaNO3

g

0,2

NH4NO3

g

CaCO3

g

(NH4)2SO4

g

FeSO4.7H2O

g

0,01

K2HPO4

g

0,05

0,1

MgSO4.7H2O

g

0,05

0,05

NaCl

g

0,05

Cao nấm men

g

Thạch

g

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

Nƣớc máy

ml

100

100

100

100

1
3
1,5

0,1

0,4

0,2
0,2

0,1

0,5

0,5
1,6-1,8
100

6,8-7,2

pH

Môi trƣờng lên men: có thành phần tƣơng ứng môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn tuy
nhiên loại bỏ thạch.
14


Môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định: môi trƣờng canh thang, môi trƣờng thạch
thƣờng. Trình bày trong bảng 2.3
Bảng 2.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định
NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nƣớc
máy

MT canh
thang

0,5

0,3

0,5

-

100

MT thạch
thƣờng

0,5

pH

7,0-7,4
0,3

0,5

1,8

100

Các môi trƣờng đều đƣợc tiệt trùng bằng hơi nƣớc ở 120ºC, 1atm trong 20 phút.
2.1.3. Hóa chất
Dung môi: các dung môi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 2.4
Bảng 2.4. Các dung môi hữu cơ sử dụng trong nghiên cứu
Khối lƣợng riêng
(g/ml)

Nhiệt độ sôi (ºC)

Aceton, Xilong-Trung Quốc

0,79

56

n-Butanol, Xilong-Trung Quốc

0,81

116-118

n-Hexan, Merck-Đức

0,655

68

Ethanol, Xilong-Trung Quốc

0,789-0,791

78,3

Ethylacetat, Merck-Đức

0,889-0,901

70,4

Butylacetat, Xilong-Trung Quốc

0,880-0,885

117-118

Triethylamin, Xilong-Trung Quốc

0,726-0,728

90

Dung môi

15


Bảng 2.5. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Các hoá chất sử dụng

Hãng sản xuất

Đóng lọ

Tinh bột

Thủ công-Việt Nam

1kg

KNO3

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

KCl

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

NaNO3

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

NaNO2

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

CaCO3

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

(NH4)2SO4

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

K2HPO4

Xilong-Trung Quốc

0,5 lít

MgSO4.7H2O

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

NaCl

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

Cao nấm men

Merck-Đức

0,5 kg

Cao thịt

Merck-Đức

0,5 kg

Thạch

Hải Long-Việt Nam

10 g

pepton

Xilong-Trung Quốc

0,5 kg

NaOH 0,1 N

Xilong-Trung Quốc

1 lít

HCl 0,1 N

Xilong-Trung Quốc

1 lít

2.1.4. Một số dụng cụ, máy móc
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf
- Tủ ấm Memmert, Binder
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48
- Tủ sấy SL shellab
- Tủ lạnh Sanyo
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030
16