Góp phần nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 182 15 tổng hợp được

BỘ Y TẾ
TRƯ
TRƯỜNG
ĐẠI HỌC DƯỢC
C HÀ N
NỘI
--------

NGUYỄN THỊ THẢO
Mã sinh viên: 1201545

GÓP PHẦN
N NGHIÊN CỨU
C U KHÁNG SINH
DO STREPTOMYCES 182.15
TỔNG HỢP ĐƯỢC
KHÓA LUẬN
LU
TỐT NGHIỆP DƯỢC
CS
SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THẢO
Mã sinh viên: 1201545

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH
DO STREPTOMYCES 182.15
TỔNG HỢP ĐƯỢC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS. TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
PGS. TS. Cao Văn Thu người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi từ những ngày đầu
bước vào nghiên cứu khoa học cho tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng
dạy công tác tại bộ môn Vi sinh - Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường
Đại Học Dược Hà Nội; Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học
Quốc gia Hà Nội; Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia; Viện Hàn Lâm khoa học
và công nghệ Việt Nam; Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện,
hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy
cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ tôi trong suốt
năm năm học tại trường để tôi có được những kiến thức và các kỹ năng cần thiết.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình nơi đã sinh ra, nuôi
dưỡng và dạy dỗ để tôi có được thành quả như ngày hôm nay. Cảm ơn những
người bạn, người em đã hỗ trợ và đồng hành trong suốt thời gian thực hiện khóa
luận tốt nghiệp này.
Do thời gian, phương tiện, kinh phí, kiến thức của bản thân còn hạn chế,

chắc chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được
những ý kiến đóng góp của thầy cô, bạn bè để khóa luận này được hoàn thiện
hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2017
Sinh viên

NGUYỄN THỊ THẢO


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................2
1.1. Đại cương về kháng sinh ................................................................................2
1.1.1.

Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ............................................................2

1.1.2.

Định nghĩa kháng sinh ..........................................................................2

1.1.3.

Phân loại kháng sinh .............................................................................2

1.1.4.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh ...........................................................3

1.1.5.

Ứng dụng của kháng sinh .....................................................................3

1.1.6.

Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh ...........................................4

1.2. Đặc điểm xạ khuẩn..........................................................................................4
1.2.1.

Đặc điểm hình thái và kích thước .........................................................4

1.2.2.

Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng............................................................5

1.2.3.

Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn .................................................5

1.2.4.

Phân loại xạ khuẩn ................................................................................5

1.2.5.

Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces .......................5

1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh ....................6
1.4. Cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................6
1.4.1.

Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn ...................................................6

1.4.2.

Bảo quản giống xạ khuẩn .....................................................................7

1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ...............................................................7
1.5.1.

Khái niệm lên men .................................................................................7


1.5.2.

Các phương pháp lên men ....................................................................8

1.5.3.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .................................8

1.6. Chiết tách, tinh chế kháng sinh .....................................................................9
1.6.1.

Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ......................................9

1.6.2.

Chiết xuất kháng sinh............................................................................9

1.6.3.

Tách và tinh chế kháng sinh .................................................................9

1.7. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh ............................................................10
1.7.1.

Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................10

1.7.2.

Phổ tử ngoại - khả kiếm (UV - VIS) ...................................................11

1.7.3.

Phổ khối (MS) ......................................................................................11

1.7.4.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .................................................11

1.8. Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces ..........................................11
1.8.1.

Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn

Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học..........11
1.8.2.

Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một streptomycete có sắc tố

khuếch tán màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam ........................12
1.8.3.

Có bao nhiêu loại kháng sinh được sản xuất bởi streptomyces ........13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ............................................................................14
2.1.1.

Nguyên vật liệu ....................................................................................14

2.1.2.

Máy móc, thiết bị, dụng cụ ..................................................................16

2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................17
2.2.1.

Chọn lọc, cải tạo giống ........................................................................17

2.2.2.

Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh ...........................................17

2.2.3.

Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được ...17

2.3. Phương pháp thực nghiệm ...........................................................................17
2.3.1.

Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn .........................................................17

2.3.2.

Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán .......17

2.3.3.

Phương pháp cải tạo và chọn giống ...................................................18

2.3.4.

Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh ...........................................20

2.3.5.

Các phương pháp chiết tách, tinh chế kháng sinh ............................21

2.3.6.

Sơ bộ xác định cấu trúc và tính chất kháng sinh thu được ...............23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN ...24

3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh............................................24
3.1.1.

Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 182.15.................24

3.1.2.

Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 .............................................24

3.1.3.

Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 .............................................25

3.1.4.

Kết quả đột biến hoá học cải tạo giống lần 3 .....................................26

3.2. Kết quả lên men chọn môi trường nuôi cấy tối thích ................................27
3.3. Kết quả chọn chủng lên men tốt nhất .........................................................28
3.4. Kết quả sắc ký ...............................................................................................29
3.4.1.

Kết quả chạy sắc ký lần 1 ....................................................................29

3.4.2.

Kết quả chạy sắc ký lần 2 ....................................................................30

3.4.3.

Kết quả chạy sắc ký lần 3 ....................................................................31

3.5. Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh ..............................................32
3.5.1.

Kháng sinh 1 ........................................................................................32

3.5.2.

Kháng sinh 2 ........................................................................................36

3.5.3.

Kháng sinh 3 ........................................................................................37


3.6. Bàn luận .........................................................................................................38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

AND
B.pumilus
CDC
CW
CM
D
Dd

ĐBUV1
ĐBUV2
ĐBHH
L-DAP
Dmhc
Gr(+)
Gr(-)
HTKS
IR
ISP
KS
MC
MS
MT
MTdt
NMR
S.flexneri
S
SKLM
SLNN
UV
UV – VIS
V
v/v
VK
VSV

Acid 2’-deoxyribonucleic
Bacillus pumilus ATCC 6633
Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm

phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ)
Cell wall (thành tế bào)
Cytoplasmic membrane (màng tế bào chất)
Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn
Dung dịch
Đột biến UV lần 1
Đột biến UV lần 2
Đột biến hoá học
L-diaminopimelic acid
Dung môi hữu cơ
Gram dương
Gram âm
Hoạt tính kháng sinh
Ifrared (hồng ngoại)
International Streptomyces Project (Chương trình
Streptomyces quốc tế)
Kháng sinh
Mẫu chứng
Mass Spectrometry (phổ khối)
Môi trường
Môi trường dịch thể
Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)
Shighella flexneri DT 112
Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
Sắc ký lớp mỏng
Sàng lọc ngẫu nhiên
Utra Violet (tử ngoại)
Ultra Violet - Visible (tử ngoại - khả kiếm)
Thể tích
Thể tich/thể tích

Vi khuẩn
Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định ...............................................14
Bảng 2. 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ..........................................................14
Bảng 2. 3: Các dung môi sử dụng .............................................................................15
Bảng 2. 4: Các hoá chất sử dụng ...............................................................................16
Bảng 3. 1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên............................................24
Bảng 3. 2: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 ...............................................25
Bảng 3. 3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2 ...............................................26
Bảng 3. 4: Kết quả thử HTKS sau đột biến hoá học .................................................27
Bảng 3. 5: Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men tối thích ...........................28
Bảng 3. 6: Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men tốt nhất ....................................28
Bảng 3. 7: Kết quả thử HTKS và SKLM sau chạy sắc ký cột lần 1 .........................29
Bảng 3. 8: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2 .................30
Bảng 3. 9: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3 .................31
Bảng 3. 10: Kết quả phổ IR của KS1 ........................................................................33
Bảng 3. 11: So sánh nhiệt độ nóng chảy, phổ UV của KS1 và Actinomycin X2......33
Bảng 3. 12: So sánh phổ NMR của KS1 và Actinomycin X2 ...................................35
Bảng 3. 13: Kết quả phổ IR của KS2 ........................................................................36
Bảng 3. 14: Kết quả phổ IR của KS3 ........................................................................37
Bảng PB. 1: Một số kháng sinh do các chủng Streptomyces tạo ra…………..phụ lục
Bảng PB. 2: Kết quả thử HTKS sau SLNN ...................................................... phụ lục
Bảng PB. 3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV1 ........................................... phụ lục
Bảng PB. 4: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV2 ........................................... phụ lục
Bảng PB. 5: Kết quả thử HTKS sau đột biến hoá học ...................................... phụ lục

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình PH.1

Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Hình PH.2

Xạ khuẩn cấy zigzac trên đĩa Petri và khuẩn lạc sau đột biến UV

Hình PH.3

Thử HTKS bằng 3 phương pháp khối thạch, giếng thạch, khoanh
giấy lọc.

Hình PH.4

Bình chứa dịch lên men

Hình PH.5

Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

Hình PH.6

Hiện hình bằng VSV

Hình PH.7

Kháng sinh tinh khiết

Hình PH.8

Đo nhiệt độ nóng chảy của KS2 và KS1

Hình PH.9

Phổ tử ngoại của hháng sinh 1

Hình PH.10

Phổ tử ngoại của kháng sinh 2

Hình PH.11

Phổ tử ngoại của kháng sinh 3

Hình PH.12

Phổ khối của kháng sinh 1

Hình PH.13

Phổ khối của kháng sinh 2

Hình PH.14

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 1

Hình PH.15

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 2

Hình PH.16

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 3

Hình PH.17

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của KS1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc phát minh ra kháng sinh được coi là một trong những thành tựu khoa
học lớn nhất của con người trong thế kỷ XX, giúp cứu sống hàng triệu người khỏi
các căn bệnh do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên, một thực trạng đang nhận được sự
quan tâm cấp thiết trên toàn cầu đó là tình trạng “đề kháng kháng sinh”. Theo CDC,
mỗi năm tại Hoa Kỳ có ít nhất 2 triệu người bị nhiễm vi khuẩn có khả năng kháng
thuốc kháng sinh và ít nhất 23.000 người chết mỗi năm do hậu quả trực tiếp của tình
trạng này [21]. Một nghiên cứu lâm sàng tại Oxford năm 2013 cho biết, tỷ lệ vi
khuẩn E.coli kháng với kháng sinh carbapenem đã đạt mức cao. Trong số 26 nước
báo cáo thì tỷ lệ kháng cao nhất tại Ấn Độ 11 %, Việt Nam đứng thứ 2 là 9 %, sau
đó đến Bulgaria. Tỷ lệ vi khuẩn này kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3
lên đến hơn 60 %. Colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng cho nhiễm trùng đe dọa
tính mạng do Enterobacteriaceae kháng carbapenem nhưng hiện tượng kháng
colistin gần đây đã được phát hiện ở một số nước và khu vực và nó đồng nghĩa với
việc bệnh nhân sẽ tử vong do không có thuốc điều trị [22], [29].
Với tình hình đó, thách thức đặt ra cho các nhà khoa học trong cuộc chiến
chống lại các vi khuẩn kháng thuốc là việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới, cải
tạo, nâng cao khả năng kháng khuẩn của kháng sinh.
Chi xạ khuẩn Streptomyces có nhiều loài xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

các kháng sinh đa dạng về cấu trúc và hoạt tính kháng khuẩn cao. Do đó, tại bộ môn
Vi sinh - Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội tôi chọn đề tài: “ Góp phần nghiên
cứu kháng sinh do Streptomyces 182.15 tổng hợp được” với những mục tiêu:
-

Tiến hành chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh.

-

Tiến hành lên men, chiết tách, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết.

-

Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Đại cương về kháng sinh

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Năm 1928, Alexander Flemming tình cờ phát hiện ra hiện tượng xung quanh
các tảng nấm, vi khuẩn bị tiêu diệt tạo thành vòng vô khuẩn. Năm 1929, ông công
bố hiện tượng đó trước công chúng và đồng thời nói rằng ông chưa thể chiết tách
được penicillin từ nấm. Năm 1940, Howard Walter Florey và Ernst Boris Chain đã
chiết xuất thành công penicillin. Năm 1943, penicillin được áp dụng vào điều trị.

Sau đó, nhiều kháng sinh đã được tìm ra. Cùng với việc tìm ra những kháng sinh
mới, công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con
đường tổng hợp và bán tổng hợp cũng dần phát triển [30].
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh.
Định nghĩa được coi là tương đối hoàn chỉnh: “Kháng sinh là những sản
phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc tự nhiên khác có hoạt
tính sinh học cao có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một
nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm,…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp”
[9].
1.1.3. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn
với kháng sinh, dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh, dựa vào cấu trúc hóa học,
phân loại theo dược động học - dược lực học, theo nguồn gốc,… [1], [3], [4], [11].
Trong đó, phân loại theo cấu trúc hóa học được sử dụng nhiều nhất.
Dựa vào cấu trúc hóa học, kháng sinh được chia thành các nhóm sau:
-

Nhóm β-lactam:
+ Penicillin: benzylpenicillin, oxacillin, ampicillin,…
+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor,…
+ Các β-lactam khác: cacbamazepim, chất ức chế β-lactamase,…
2


-

Nhóm Aminoglycosid: streptomycin, gentamicin,…

-

Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin,…

-

Nhóm lincosamid: lincomycin, clandamycin,…

-

Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol,…

-

Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin,…

-

Nhóm peptid:
+ Glucopeptid: vancomycin,…
+ Polypeptid: polymicin, bacitracin,…

1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các cơ chế tác dụng chủ yếu:
-

Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: beta-lactam, vancomycin,…

-

Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn: cloramphenicol,…

-

Ức chế tổng hợp acid nucleic: griseofulvin, actinomycin,…

-

Thay đổi tính thấm của màng sinh chất: colistin, polymicin,… [1], [3], [9],
[18], [34].

1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh
1.1.5.1.

Trong y học

Kháng sinh không chỉ sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn
mà còn được dùng để điều trị các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra và các bệnh ung
thư (ung thư vú, phổi, dạ dày,…) [9], [26], [30], [33].
1.1.5.2.

Trong nông nghiệp

Trong chăn nuôi: Phòng và điều trị bệnh cho động vật, chất kích thích tăng
trọng gia súc, gia cầm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với tác dụng ức chế và loại
bỏ sự hoạt động của VK gây bệnh đường tiêu hoá, hô hấp [9], [26].
Trong trồng trọt: Thuốc bảo vệ thực vật, đem lại hiệu quả kinh tế cao, khắc phục
được nhược điểm của các thuốc hóa học (hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm, chất độc
tồn dư,…) [9], [26].

3

1.1.5.3.

Trong công nghiệp thực phẩm.

Chất bảo quản thực phẩm: nisin, subtilin, clotetracyclin,… ưu điểm: thời
gian khử trùng bằng nhiệt ngắn đi, nhiệt độ khử trùng giảm. Nồng độ kháng sinh rất
thấp, bảo quản được lâu dài, chất lượng tốt hơn, vitamin không bị phá hủy, hương vị
ít bị biến đổi [8], [9], [10], [26].
1.1.6. Sơ đồ tổng quát lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Được giới thiệu ở hình PH.1 phần phụ lục [14], [17].
1.2.

Đặc điểm xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là các VK

Gr(+), có tỷ lệ G + C > 55 %. Phân bố rộng rãi trong đất, nước, bùn,… [6], [18].
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phát triển thành dạng sợi phân nhánh.
Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn
ty của xạ khuẩn thường không có vách ngăn, không tự đứt đoạn, đường kính 0,3 –
2,0 µm, màu sắc rất phong phú: trắng, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen,... [13], [18].
- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm
nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng.
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian
thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh.
Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ty khí sinh xuất hiện chuỗi
bào tử.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình tròn, bầu dục, hình

que, hình trụ,… Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vảy, có gai, có lông.
Khuẩn lạc xạ khuẩn: Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo
thành khuẩn lạc xạ khuẩn. Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô
ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc
đường tròn đồng tâm,… [6], [18].
4


1.2.2. Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng
Streptomyces thuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tối thích
22 - 32oC, pH tối thích 6,5 - 7,5.
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn dinh dưỡng, đồng thời thủy phân các hợp
chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit [13], [18].
1.2.3. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn
Cấu tạo gồm 3 phần: Thành tế bào, màng tế bào và tế bào chất. Thành tế bào
xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CWI, có chứa L-diaminopimelic acid (L-ADP)
và glycin [15], [18].
1.2.4. Phân loại xạ khuẩn
Nhiều khoá phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học trên thế giới xây
dựng: Waksman, Krassilnhikov, Gauze,…
Phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces theo khoá phân loại ISP của
E.B.Shirling & Gottlieb được sử dụng rộng rãi, khoá phân loại dựa vào các đặc
trưng:
- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty
khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả
năng sử dụng các nguồn đường [5], [18], [27].
Ngày nay, người ta cũng thường sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S
rADN để phân loại Streptomyces. Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin

cậy [6], [18].
1.2.5. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành kháng sinh,
60 -70 % xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.

5


Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều kháng
sinh có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau. Bảng PB.1 giới thiệu
một số chất kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces [6], [13], [26].
1.3.

Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh
Để phân lập trước tiên người ta lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau:

Đất, bùn, nước ở sông hồ,…đem phân lập thuần khiết những vi sinh vật sinh kháng
sinh bằng các phương pháp đặc trưng và cấy trên các môi trường chọn lọc.
Các phương pháp phân lập: Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch;
phương pháp cấy trực tiếp đất lên bề thạch đã chứa VSV kiểm định; phương pháp
làm giàu đất bằng VSV kiểm định; phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường
phân lập; phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư [9].
1.4.

Cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn
VSV tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt

tính thấp. Vì vậy, để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi
phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện
nuôi cấy thích hợp [9].

1.4.1. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn
Mục đích:
-

Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.

-

Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt hơn, rút
ngắn thời gian lên men,…

-

VSV chỉ tạo 1 sản phẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho tách chiết và tinh chế.

-

Sinh tổng hợp các chất mới với tác dụng mới [4], [9].

1.4.1.1.

Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV luôn có các biến dị tự nhiên với tần số khoảng 10-10 - 10-5 trong
ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau. Trong đó, có những biến
chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20 – 30 % các biến chủng khác. Cần phải
chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [4], [9].
6

1.4.1.2.

Đột biến cải tạo giống

Chọn lọc tự nhiên chưa đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp, cần thiết
phải dùng đến các phương pháp đột biến nhân tạo.
Các tác nhân đột biến bao gồm:
+ Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hoá khác.
Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào bước sóng, cường độ,
khoảng cách và thời gian chiếu ánh sáng UV.
+ Tác nhân hoá học: Nitrozoguanidin, HNO2, ethylenimin,…
+ Tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động.
Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, phải tiến
hành đột biến bậc thang kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ
hợp cận hữu tính, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.
Sau khi đột biến, hầu hết các VSV chết. Trong số các biến chủng sống sót, có
biến chủng có HTKS tăng (đột biến dương) hoặc giảm (đột biến âm). Cần SLNN
sau đột biến để chọn ra các biến chủng có HTKS cao để nghiên cứu tiếp [4], [9].
1.4.2. Bảo quản giống xạ khuẩn
Việc bảo quản giống đóng vai trò rất quan trọng. Nếu việc bảo quản giống
không tốt thì tỷ lệ sống sót thấp, không duy trì được các tính trạng tốt đã được phát
hiện.
Các phương pháp bảo quản: Bảo quản lạnh, bảo quản lạnh sâu, phương pháp
đông khô, phương pháp cấy truyền giữ giống [9].
1.5.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.5.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm

tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần
tế bào.

7


Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh
trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng [6], [9], [17], [18].
1.5.2. Các phương pháp lên men
1.5.2.1.

Lên men bề mặt

VSV được nuôi cấy trên bề mặt dịch thể hoặc bề mặt bán rắn, hấp thu các
chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện; trang thiết bị đơn giản; dễ xử lý cục bộ.
Nhược điểm: Hiệu suất sử dụng trường không gian thấp; khó giữ vô trùng;
khó cơ giới hoá, tự động hoá; tốn diện tích, tốn nhân công [4], [9], [16].
1.5.2.2.

Lên men chìm

Là phương pháp lên men mà VSV phát triển trong môi trường lỏng.
Ưu điểm: Hiệu suất quá trình lên men cao; giữ được vô trùng; dễ kiểm soát
toàn bộ; dễ cơ giới hoá, tự động hoá; tốn ít diện tích, nhân công.
Nhược điểm: Chi phí cho trang thiết bị lớn (thiết bị chuyên dụng, chịu được
áp lực, vô trùng tuyệt đối), cần cán bộ chuyên môn hoá, có kinh nghiệm; không thể
xử lý cục bộ.
Các kiểu lên men chìm: Lên men mẻ (gián đoạn), lên men có bổ sung, lên
men liên tục, lên men bán liên tục [4], [9], [16].

1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
pH môi trường: Ảnh hưởng do tác dụng trực tiếp của ion H+ hay OH – đến
tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc tác dụng gián tiếp.
Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng, kiểu sinh sản, hình thái,
trao đổi chất, nhu cầu dinh dưỡng của VSV. Nhiệt độ thấp VSV không phát triển,
nhiệt độ cao VSV bị chết do biến tính protein và ADN. Vì vậy, thiết bị lên men cần
có bộ phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối ưu cho VSV.
Độ hoà tan oxy và thông khí: Thiếu oxy sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào,
phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hoà tan oxy tương thích với tốc độ sử dụng oxy
8


của VSV. Một số VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha
tiềm tàng.
Như vậy, trong sản xuất cần nghiên cứu kỹ các yếu tố ảnh hưởng tới quá
trình lên men để tối ưu hoá các điều kiện tạo thuận lợi cho sinh tổng hợp các chất
mong muốn [4], [9], [16].
1.6.

Chiết tách, tinh chế kháng sinh

1.6.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đóng vai trò rất quan trọng vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men
thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp. Để
thu được kháng sinh có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách, tinh chế
thích hợp [9], [14].
1.6.2. Chiết xuất kháng sinh
Là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi hỗn hợp. Đó là quá trình
phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha
rắn (cân bằng lỏng - rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng - lỏng).

Với kháng sinh ngoại bào: Tồn tại trong dịch lên men người ta ứng dụng
phương pháp chiết lỏng - lỏng.
Với kháng sinh nội bào: Tiến hành chiết lỏng - rắn. Nguyên tắc của phương
pháp này là dựa vào sự khuyếch tán của kháng sinh vào dung môi chiết [8],[9],[15].
1.6.3. Tách và tinh chế kháng sinh
Là nhóm các phương pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp đến một hỗn hợp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng
chất.
Bao gồm các phương pháp: chiết, thẩm thấu, sắc ký.
 Phương pháp sắc ký:
Nguyên lý tách: mẫu phân tích hoà tan trong pha động => cho qua pha tĩnh
liên tục và không hoà lẫn vào pha tĩnh => các chất tan trong mẫu sẽ di chuyển qua

9


pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh - pha động chất tan => các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ
nhờ tốc độ di chuyển khác nhau [2], [15].
 Sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Các hạt trong pha tĩnh tách các thành phần theo cơ chế hấp phụ
(là chủ yếu), phân bố, trao đổi ion,…
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf :
Rf =
Trong đó:dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
ddm: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
(cm).
Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng: Chiếu đèn UV, thuốc thử hiện
màu, nhìn bằng mắt thường,…
 Sắc ký cột
Là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của

từng chất.
Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của
dung môi pha động [2], [15].
1.7.

Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh

1.7.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại (IR) là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ
bức xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau [2], [25].
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ bức xạ hồng ngoại làm
tăng các dao động sẵn có của nhóm nguyên tử đó sẽ tạo nên một dải hấp thụ trên
phổ IR với các pic đặc trưng, được sử dụng để nhận dạng các nhóm chức đặc biệt
trong phân tử và định tính bằng cách so sánh với phổ chuẩn [2], [33].

10


1.7.2. Phổ tử ngoại - khả kiếm (UV - VIS)
Phổ UV - VIS là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV
vào bước sóng hay số sóng. Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại làm thay đổi mức
năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản E0 lên trạng thái kích E1, E2,…
Phổ UV - VIS được sử dụng để định tính bằng cách so sánh với phổ của chất
chuẩn đã có sẵn (về vị trí cực đại, cực tiểu và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng
đó), tuy nhiên phổ UV - VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu trúc nên vẫn thường
sử dụng phổ IR để xác định cấu trúc [2], [33].
1.7.3. Phổ khối (MS)
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ

bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion được
thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp lại thành phổ khối
(MS) [2], [33].
1.7.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân được xem là một phương pháp ưu việt áp dụng vào
việc nghiên cứu, biện giải và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Có rất nhiều
hạt nhân được nghiên cứu nhưng Hydro và Carbon là phổ biến nhất [2], [33].
Phối hợp các phương pháp trên để biện giải cấu trúc kháng sinh.
1.8.

Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces

1.8.1. Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn
Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học
Tunicamycin là một kháng sinh nucleotid được phân lập từ dịch lên men
chủng Streptomyces T - 4. Theo đặc điểm hình thái học, sinh lý, sinh hoá và phân
tích chuỗi 16S rADN chủng T - 4 được xác định là Streptomyces torulosus. Trong

11


các thử nghiệm in vivo, nó chống lại một số vi sinh vật gây bệnh như:
Staphylococcus aureus, NCTC 7447; Micrococcus lutea, ATCC 9341; Bacillus
subtilis, NCTC 10400; Bacillus pumilus, NCTC; Klebsiella pneumonia, NCIMB
9111; Escherichia coli, NCTC 10416; Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145;
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763; Candida albicans, IMRU 3669; Aspergillus
flavus, IMI 111023; Aspergillus niger IMI 31276; Aspergillus fumigatus ATCC
16424.
Phương tiện sản xuất được tối ưu hóa để cho sản lượng tối đa của chất
chuyển hóa thứ cấp. Điều kiện lên men: Thời gian nuôi cấy 5 ngày, ở pH 7,0, nhiệt

độ 350C, glucose là nguồn carbon chính, KNO3 là nguồn nitơ chính. Vi sinh vật
kiểm định đại diện cho vi khuẩn Gr(+), Gr(-) và nấm. Các chất chuyển hóa được
chiết xuất bằng n-butanol (1 : 1, v/v) ở pH 7,0 sau đó bốc hơi dưới áp suất giảm và
cất quay thu được tinh thể màu vàng. Sau đó, tách riêng các thành phần bằng SKLM
với hệ DM chloroform - methanol (24 - 1, v/v) và sắc ký cột với chất nhồi cột là
sillicagel, DM chạy cột là hệ chloroform - methanol (10 - 2, v/v). Xác định được
một chất có Rf = 0,55. Tiến hành phân tích tiếp xác định được nhiệt độ nóng chảy
và phân tử khối của kháng sinh là 2350C và 865 đvC, phổ UV cho đỉnh hấp thụ cực
đại tại 260 nm, phổ IR có 26 đỉnh. Công thức được xác định là C38H62N4O16 và
được xác nhận rằng hợp chất được sản xuất bởi Streptomyces torulosus, T - 4 là
kháng sinh Tunicamycin [23].
1.8.2. Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một streptomycete có sắc tố khuếch tán
màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam
Một xạ khuẩn được đặt tên là GIMV4.0001, được phân lập từ mẫu đất rừng
tại Việt Nam. Chúng tạo ra các sợi khuẩn ty khí sinh có màu trắng và sắc tố khuếch
tán màu xanh tím trên môi trường thạch tổng hợp của Gauze. Màu sợi nấm bề mặt
không nhạy cảm với pH. Quan sát chuỗi bào tử chủng GIMV4.0001 dưới kính hiển
vi thấy chuỗi bào tử thẳng, dài, hình trụ, và thông tin về hoá định dạng khẳng định
rằng chủng này thuộc các chi Streptomyces. Chủng có sinh sắc tố melanoid nhưng
không có hoạt tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

12


Bacillus subtilis, Candida albicans hoặc Penicillium citrinum. Phân tích trình tự gen
16S rADN của chủng GIMV4.0001 cho thấy chủng có sự tương đồng cao nhất
(99,4 %) là Streptomyces bikiniensis ATCC 11062. Tuy nhiên, sự liên quan DNA DNA giữa chủng GIMV4.0001 và S.bikiniensis ATCC 11062 được tìm thấy chỉ là
50,3 %. Chủng GIMV4.0001 cũng có thể được phân biệt với S.bikiniensis ATCC
11062 (T) và các loài Streptomyces có trình tự gen 16S rADN giống nhau cao (98 –
99 %) dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá. Trên cơ sở tính chất sinh lý

và phân tử của nó, rõ ràng là chủng GIMV4.0001 đại diện cho một loài mới thuộc
chi Streptomyces, mà tên Streptomyces vietnamensis sp.Nov được đề xuất. Loại
chủng là GIMV4.0001 (= CCTCC M 205.143 = IAM 15.340) [31].
1.8.3. Có bao nhiêu loại kháng sinh được sản xuất bởi streptomyces
Streptomyces là chi lớn nhất sản sinh ra kháng sinh trong giới vi sinh vật
được phát hiện cho đến nay. Số lượng các hợp chất diệt VK được báo cáo từ các
loài thuộc chi này mỗi năm đã tăng gần như theo cấp số nhân trong khoảng hai thập
kỷ, đạt được đỉnh điểm vào những năm 1970, và suy giảm đáng kể vào cuối những
năm 1980 và 1990. Số liệu tích lũy cho thấy một đường cong sigmoid có độ dốc
nhỏ hơn nhiều những gì dự đoán từ phương trình toán học. Tác giả đã cố gắng chỉ
ra một mô hình toán học phù hợp cho đường cong này để ước tính số lượng các
kháng sinh chưa được khám phá từ chi này cũng như để dự đoán các xu hướng tìm
kiếm trong tương lai gần. Một mô hình giả định rằng những nỗ lực sàng lọc được
khuyến khích bởi thành công của những năm trước và xác suất tìm ra kháng sinh
mới đã được cung cấp phù hợp sau khi tối ưu hóa các thông số. Mô hình này ước
tính tổng số các hợp chất kháng khuẩn mà chi này có thể sản xuất được có thể là
100.000 - một phần nhỏ trong số đó đã được xác định cho đến nay. Sự suy giảm độ
dốc đường cong dường như là do sự suy giảm trong các nỗ lực tìm kiếm chứ không
phải là sự cạn kiệt của các hợp chất. Độ dốc sẽ trở thành con số không trong một
hoặc hai thập kỷ tới, nhưng nếu những nỗ lực sàng lọc được duy trì liên tục, tỷ lệ
phát hiện các hợp chất mới sẽ không giảm trong vài thập kỷ tới [28].

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: Giống xạ khuẩn Streptomycs 182.15 có HTKS mạnh
nhất được lưu sau đề tài nghiên cứu năm 2016.
 Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do bộ môn
Vi sinh - Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp:
Bacillus pumilus ATCC 6633, Shighella flexneri DT 112.
 Môi trường nuôi cấy:
 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.
Bảng 2. 1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước

(g)

(g)

(g)

(ml)

(g)

pH

MT
Canh thang

0,5

0,3

0,5

0

100 (vđ)

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,6 - 1,8

100 (vđ)

 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2. 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần (g)

MT1

MT2

MT6

Tinh bột

2

2

2

KNO3

0,1

KCl

0,05

NaNO3

0,2

CaCO3

0,2

(NH4)2SO4

0,2

K2HPO4

0,05

14

0,1

7,0 - 7,4


MgSO4.7H2O

0,05

NaCl

0,05

0,05
0,1

Cao nấm men

0,5

Thạch

1,8

2

Nước vđ (ml)

100

100

pH

2

6,8 - 7,2

 Các môi trường dịch thể (MTdt): Thành phần tương ứng như MT nuôi cấy xạ
khuẩn nhưng không có thạch.
-

Chú ý: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, nuôi cấy VSV kiểm định, môi
trường lên men được tiệt trùng ở 118 - 1200C trong 30 phút.

 Dung môi: Các dung môi đã được sử dụng được giới thiệu trong bảng 2.3.
Bảng 2. 3: Các dung môi sử dụng
Khối lượng riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (0C)

Aceton, Xilong - Trung Quốc

0,79

56

n-butanol, Xilong - Trung Quốc

0,81

116 - 118

n-hexan, Merck - Đức

0,655

Dung môi

68

Ethanol, Xilong - Trung Quốc

0,789 - 0,791

78,3

Ethylacetat, Merck - Đức

0,889 - 0,901

70,4

Butylacetat, Xilong - Trung Quốc

0,880 - 0,885

117 - 118

Methanol, Xilong - Trung Quốc

0,791 - 0,793

64,5

Triethylamin, Xilong-Trung Quốc

0,726 - 0,728

90

15