Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng artesunat và dihydroartemisinin trong huyết tương bằng LC MS MS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH HÙNG
MÃ SINH VIÊN: 1201289

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁPĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT VÀ
DIHYDROARTEMISININ
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH HÙNG
MÃ SINH VIÊN: 1201289

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁPĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT VÀ
DIHYDROARTEMISININ TRONG
HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn
1. TS: Nguyễn Thị Thuận
2. ThS: Ngô Quang Trung

Nơi thực viện
Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia

Hà Nội-2017


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị
Thuận- cô giáo đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Ngô Quang Trung, các thầy cô
giáo, cán bộ kỹ thuật viên ở bộ môn Hóa dược và viện Công nghệ dược phẩm
quốc gia đã quan tâm và tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt khóa
luận này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đặc biệt là bạn
Nguyễn Thị Ngọc, Chu Huy Kiên, Lê Thị Quỳnh và Nguyễn Thị Bích
Ngọcđã quan tâm giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời
gian học tập và thực hiện khóa luận này.
Do thời gian thực hiện cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận
này còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè
để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Lê Đình Hùng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin và artesunat.................................................2
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của DHA và ART ..........................2
1.1.2. Đặc điểm dược động học của ART và DHA..............................................3
1.2. Các phương pháp định lượng đồng thời ART và DHA trong huyết tương ......4
1.2.1. Định lượng đồng thời ART và DHA trong huyết tương bằng HPLC ........5
1.2.2. Định lượng đồng thời ART và DHA trong huyết tương bằng LC-MS. .....6
1.3. Tổng quan về kỹ thuật LC-MS .........................................................................8
1.3.1. Khái niệm ...................................................................................................8
1.3.2. Nguyên tắc ..................................................................................................8
1.3.3. Cấu tạo và nguyên lý vận hành của hệ thống khối phổ [1] ........................9
1.3.4. Một số chế độ thu phổ. .............................................................................11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị..................................................................................13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................13
2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất ....................................................13
2.1.3. Thiết bị dụng cụ:.......................................................................................13
2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................14
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................14
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích ............................................................................14
2.3.2. Khảo sát và xây dựng phương pháp .........................................................16
2.3.3. Thẩm định phương pháp ..........................................................................17


2.4. Ứng dụng thực tế ............................................................................................21
2.5. Phương pháp xử lý kết quả .............................................................................21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................. 22
3.1. Khảo sát xây dựng phương pháp ....................................................................22
3.1.1. Xác định các điều kiện khối phổ ..............................................................22
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng .................................................................23

3.2. Thẩm định phương pháp .................................................................................25
3.2.1. Sự phù hợp hệ thống sắc ký. ....................................................................25
3.2.2. Độ chọn lọc/đặc hiệu ................................................................................26
3.2.3. Độ nhiễm chéo..........................................................................................27
3.2.4. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính..........................................................28
3.2.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ................30
3.2.6 Độ đúng, độ lặp lại ....................................................................................33
3.3. Ứng dụng thực tế ............................................................................................36
3.4. Bàn luận ..........................................................................................................38
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................. 41
4.1. Kết luận ...........................................................................................................41
4.2. Đề xuất ............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ACPI
AOAC
ART
ARN
C18
DĐVN IV
DHA
ESI
ESI
EtOAc
FDA
HPLC

HQC
HT
KST
IS
LC-MS/MS
LOD
LQC
LLOQ
MQC
MeCN
MeOH
MS
P.A
PĐ
r
R%
RSD
SD
SKD
SPE

Chú thích
Ion hóa học ở áp suất thường
Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống.
Artesunat
Artemisinin
Cột Octadecylsilan
Dược điển Việt Nam IV
Dihydroartemisinin
Ion hóa bằng phun điện tử

Ion hóa tia điện
Ethyl acetat
Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu kiểm tra nồng độ cao
Huyết tương
Ký sinh trùng
Chuẩn nội
Sắc ký lỏng khối phổ
Giới hạn phát hiện
Mẫu kiểm tra nồng độ thấp
Giới hạn định lượng dưới
Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình
Acetonitril
Methanol
Khối phổ
Tinh khiết phân tích
Pha động
Hệ số tương quan
Độ thu hồi
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Sinh khả dụng
Chiết pha rắn


Spic
TB
TĐSH
TCCS

Diện tích pic
Trung bình
Tương đương sinh học
Tiêu chuẩn cơ sở

Tltk

Tài liệu tham khảo

tR

Thời gian lưu giữ

ULOQ

Giới hạn định lượng trên


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lượng ART và DHA trong huyết tương. ............. 6
Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn ............................................................................... 13
Bảng 2.2: Danh mục thuốc thử ................................................................................. 13
Bảng 2.3: Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp ART và DHA .................................. 15
Bảng 2.4: Bảng nồng độ các mẫu QC ....................................................................... 15
Bảng 2.5: Cách pha dung dịch chuẩn QC ................................................................. 16
Bảng 2.6: Cách chuẩn bị các mẫu ............................................................................. 16
Bảng 3.1: Các thông số detector khối phổ ................................................................ 23
Bảng 3.2: Kết quả sự phù hợp hệ thống .................................................................... 26
Bảng 3.3: Kết quả xác định tính đặc hiệu và độ chọn lọc ......................................... 27

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo .............................................................. 28
Bảng 3.5: Kết quả xác định hệ số weighting ............................................................ 28
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát đường chuẩn ART ....................................................... 29
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát đường chuẩn DHA ....................................................... 30
Bảng 3.8: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới ART .................................... 31
Bảng 3.9: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới DHA .................................... 32
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của ART .................... 33
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của DHA .................... 33
Bảng 3.12: Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của ART ..................... 34
Bảng 3.13: Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của DHA .................... 35
Bảng 3.14: Nồng độ ART trong huyết tương chó theo đường chuẩn ....................... 36
Bảng 3.15: Nồng độ DHA trong huyết tương chó theo đường chuẩn ...................... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo DHA .............................................................................. 2
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của ART ........................................................................ 2
Hình 1.3. Cấu tạo thiết bị khối phổ ............................................................................. 9
Hình 3.1. Phổ Scan dung dịch chuẩn đặc ART, DHA, ARN. .................................. 22
Hình 3.2. Phổ product ion dung dịch chuẩn đặc ....................................................... 22
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch ART qua cột SB-C18 (2,1 x 50 mm;1,8 µm) .......... 24
Hình 3.4. Cột Rp Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD ..................................... 24
Hình 3.5. Sắc ký đồ pha động 1: acid acetic 0,1% : MeCN : MeOH (45:15:40) ..... 24
Hình 3.6. Sắc ký đồ pha động 2: acid acetic 0,1% : MeCN : MeOH (45:25:30) ..... 25
Hình 3.7. Sắc ký đồ pha động 3: acid acetic 0,1% : MeCN : MeOH (55:5:40) ....... 25
Hình 3.8. Sắc ký đồ pha động 4: acid acetic 0,1% : MeCN (55:45) ......................... 25
Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dich ART, DHA, IS/MeOH nồng độ 50,100,100 ng/ml . 26
Hình 3.10. Sắc ký đồ huyết tương trắng ................................................................... 27
Hình 3.11. Sắc ký đồ HT trắng pha IS ...................................................................... 27
Hình 3.12. Sắc ký đồ HT trắng pha ART, DHA nồng độ LLOQ ............................. 27

Hình 3.13. Giới hạn phát hiện của ART ................................................................... 31
Hình 3.14. Giới hạn phát hiện của DHA ................................................................... 32
Hình 3.15. Đồ thị nồng độ ART trong HT chó theo thời gian .................................. 37
Hình 3.16. Đồ thị nồng độ DHA trong HT chó theo thời gian. ................................ 38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Artesunate (ART) là một dẫn xuất bán tổng hợp của artemisinin (ARN), thành
phần hoạt chất chính trong cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua). Cả ARN,
ART đều có khả năng diệt Plasmodium falciparum và P. vivax đa kháng thuốc nên
đã trở thành vị cứu tinh của hàng ngàn bệnh nhân sốt rét trên toàn thế giới. Ngoài
tác dụng trên, tác dụng đối với tế bào ung thư của ART cũng đang được nghiên cứu
[10]. Kết quả ban đầu cho thấy, ART có tác dụng lên nhiều dòng tế bào khối u ác
tính.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương
đương sinh học (TĐSH) các thuốc nói chung và ART nói riêng, yêu cầu quan trọng
là phải có quy trình phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học. Quá trình phân
tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong
mẫu thường thấp và có nhiều tạp chất.
Hệ thống phân tích LC-MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo
điều kiện cho các nhà khoa học thực hiện các nghiên cứu SKD phức tạp. Với ưu
điểm vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu cao, kỹ thuật phân tích này ngày càng
được áp dụng nhiều trong nghiên cứu các chế phẩm có hàm lượng thấp. Tuy nhiên ở
Việt Nam kỹ thuật này còn mới mẻ và khả năng ứng dụng còn hạn chế.
Nhằm mục đích tạo cơ sở cho việc đánh giá SKD và TĐSH của các thuốc chứa
ART chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp
định lượng artesunat và dihydroartemisinin trong huyết tương bằng LCMS/MS” với các nội dung chính sau:
1. Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời ART và DHA
trong huyết tương.
2. Đánh giá được phương pháp vừa xây dựng.

3. Ứng dụng xác định nồng độ ART, DHA trong một số mẫu huyết tương chó.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin và artesunat
1.1.1. Công thức
ức cấu tạo và
v tính chất hóa lý của DHA và ART
Dihydroartemisinin (DHA)
DHA là chất chuyển
ển hóa có hoạt tính của ART, ARN và
v cũng
ũng đđược sử dụng trực
tiếp như một thuốc thành
ành phẩm.
ph
Tên khoa học:
ọc: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)
(3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)decahydro -3,6,9 - trimethyl--3,12- epoxy -12Hpyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin
benzodioxepin -10-ol.
Tên khác:Dihydroqinghaosu, Artenimol ho
hoặc DHA.
Công thức phân tử: C15H24O5
Khối lượng
ợng phân tử: 284,35 g/mol.
Hình 1.1. Công thức cấu
ấu tạo
t DHA

Tính chất
ất vật lý: Tinh thể hoặc bột kết tinh màu
m trắng,
ắng, không m
mùi. Khối lượng
riêng 1,3±0,1 g/cm3. Nóng chảy
ch ở nhiệt độ: 140oC [17].
7]. Tan nh
nhẹ trong acetonitril,
ethanol (~750 g/l) và dicloromethan. Khó tan trong nước.
ớc. Cụ thể, độ tan của DH
DHA
là 8,4 mg/L trong H2O ở 25oC [27].
Tính chất
ất hóa học: Cầu nối peroxid mang tính oxy hóa, có khả năng tạo gốc tự do
khi tham gia phản
ản ứng. DHA dễ bị thủy phân mất hoạt tính do có nhóm chức lacton,
tốc
ốc độ thủy phân phụ thuộc vào
v nhiệt độ, độ ẩm và mức
ức độ kiềm. Nhóm –OH có thể
tham gia phản
ản ứng acyl hóa tạo dẫn chất dễ tan hơn.
h
Artesunat (ART)
Tên

khoa

hhọc:

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)
(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)Decahydro-3,6,9-trimethyl--3,12-epoxy-12Hpyrano

[4,3-j]-1,2-benzodioxepin
benzodioxepin-10-ol,

hydrogen succinate.

Hình 1.2: Công thức cấuu tạo
t của ART

2


Tên khác: acid artesunic.

Khối lượng phân tử: 384,421 g/mol .

Công thức phân tử: C19H28O8
ART là một dẫn chất của DHA trong đó nhóm –OH đã được este hóa với acid
succinic (hoặc anhydrid succinic) nên ART mang hầu hết đặc tính hóa học của
DHA.
Tính chất vật lý: Tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng, không mùi. Nóng chảy ở
nhiệt độ:132-135oC. Dễ tan trong dicloromethan, rất dễ tan trong aceton và ethanol
96%. Rất khó tan trong nước. Cụ thể, độ tan của ART là 565 mg/L trong H2O ở 23oC
[27].
Tính chất hóa học: Ngoài các tính chất giống DHA như dễ bị thủy phân do có
nhóm chức lacton, chức ester do có nhóm carboxylic trong phân tử nên artesunat có
tính acid yếu với pKa ≈ 4,35 [2,30].

1.1.2. Đặc điểm dược động học của ART và DHA
Sau khi vào trong máu ART bị thủy phân thành chất chuyển hóa có hoạt tính là
DHA, vì vậy phải xác định đồng thời nồng độ DHA và ART trong máu. Thời gian
bán thải khi tiêm tĩnh mạch của ART là khoảng 2,3 đến 4,3 phút, của DHA là 40
đến 64 phút [30]. Vì thuốc tích tụ chọn lọc trong ký sinh trùng (KST), cần diễn giải
một cách thận trọng dữ liệu dược động học nồng độ trong huyết tương ở dạng
không liên kết của artesunat hoặc DHA. Trong các thí nghiệm in vitro, nồng độ của
DHA trong hồng cầu nhiễm KST sốt rét cao hơn 300 lần so với nồng độ trong huyết
tương [16].
 Dược lý dược lâm sàng
Tác dụng dược lý
Vì DHA là chất chuyển hóa có hoạt tính của ART nêncó thể coi tác dụng dược lý
của DHA là tác dụng của ART. Cũng như các dẫn chất khác của ARN, ART có hoạt
tính diệt KST sốt rét. Hoạt tính của ART gấp 5 lần artemisinin. ART không có tác
dụng diệt giao bào và không tác dụng lên giai đoạn ngoại hồng cầu, hơn nữa thời
gian tác dụng ngắn nên không dùng làm thuốc dự phòng và không dùng chống tái
phát [5].

3


Bên cạnh đó, một số tác dụng gần đây cho thấy ART còn có tác dụng chống ung
thư trên nhiều dòng tế bào như tế bào biểu mô, tế bào phổi…[9,10,19].
Eferth và cộng sự (2001) đã chứng minh tác dụng chống ung thư của ART trên
các dòng tế bào ung thư ở người được thiết kế bởi chương trình nghiên cứu các liệu
pháp điều trị của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ. Kết quả cho thấy ART có tác dụng
mạnh nhất với dòng tế bào ung thư bạch cầu và đại tràng với giá trị tiếp theo là
dòng tế bào ung thư hắc tố do melanosa, ung thư vú, buồng trứng…So sánh với một
số thuốc chuẩn khác đang dùng để điều trị ung thư cho thấy ART có hiệu quả cao
độc tính thấp hơn [10].

Trong nghiên cứu điều trị ung thư thanh quản ở người [28], bệnh nhân được tiêm
và uống ART trong thời gian 9 tháng khối u đã giảm tới 90% kích thước sau 2 tháng.
Chỉ định và liều dùng
Hiện nay mới chỉ có chỉ định và liều dùng trong điều trị sốt rét, việc sử dụng
thuốc điều trị ung thư còn ở giai đoạn nghiên cứu.
Chỉ định: Điều trị sốt rét do P. falciparum đa kháng thuốc, sốt rét ác tính [3,4].
Liều dùng theo hướng dẫn của WHO 2010 [32]: Uống, người lớn và trẻ em trên 6
tháng tuổi: 4 mg/kg/ngày trong 3 ngày, cùng với 1 liều duy nhất mefloquin 15
mg/kg (hoặc đôi khi 25 mg/kg nếu cần) uống vào ngày 2 hoặc 3 để điều trị triệt để.
Nếu dùng artesunat đơn độc, 4 mg/kg vào ngày thứ nhất, sau đó 2 mg/kg/ngày trong
6 ngày.
Chống chỉ định [3]
Các trường hợp phụ nữ trong 3 tháng đầu thai kỳ tuyệt đối không được sử dụng
ART.
Tác dụng không mong muốn
Theo nghiên cứu của Riberio và Olliaro, các dẫn chất của ARN nói chung hay
ART nói riêng có mức độ an toàn cao cũng như khả năng dụng nạp tốt [25].
Các tác dụng phụ của ART đã được WHO ghi nhận bao gồm các triệu chứng rối
loạn tiêu hóa, đau đầu, chóng mặt và chậm nhịp tim [23].
1.2. Các phương pháp định lượng đồng thời ART và DHA trong huyết tương

4


1.2.1. Định lượng đồng thời ART và DHA trong huyết tương bằng HPLC
Do DHA là chất chuyển hóa có hoạt tính của ART nên để có thể nghiên cứu
SKD của ART thì cần phải có phương pháp xác định cả 2 thành phần này. Có nhiều
phương pháp định lượng ART, DHA trong nguyên liệu, thành phẩm…Tuy nhiên
khi nghiên cứu dược động học, do đặc trưng nồng độ trong huyết tương thấp, nền
mẫu phức tạp nên định lượng ART và DHA trong huyết tương giới hạn ở các

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các detector khác nhau (detector UVVIS, detector điện thế, detector khối phổ).
Phương pháp HPLC với detector UV
Trong số các detector trên, detector UV là phổ biến nhất. Trong nghiên cứu của
mình, R.B Taylor và cộng sự [26] đã dùng cetyltrimethyl amoni brom làm chất tạo
cặp ion và 2-naphthoic acid 100 ng/ml làm chuẩn nội. Mẫu được xử lý bằng phương
pháp chiết pha rắn với Phenyl BondElut cartridges sau đó được đưa vào cột phản
ứng C18 (100 mmx4,6 mm; 5 µm)trước khi được dẫn qua cột phân tích
octadecylsilica 100x4,6 mm 3 µm. Do ART có độ hấp thụ quang nhỏ tại vùng UV
có bước sóng dài nên để xác định cần phải biến đổi cấu trúc bằng cách kiềm hóa
bằng KOH/MeOH trước khi gây ra đáp ứng trên detector để tăng độ hấp thụ quang
tại bước sóng 289 nm. Phương pháp cho khoảng tuyến tính là 100–1600 ng/ml và
LOD =20 ng/ml do đáp ứng pic sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi hiệu suất của phản ứng
kiềm hóa bằng KOH/MeOH. Độ nhạy phương pháp thấp do vậy không đáp ứng
được yêu cầu định lượng ART và DHA trong huyết tương khi sử dụng liều thấp.
Phương pháp HPLC với detector điện hóa
Trong phân tử ARN và các dẫn chất của nó có chứa cầu nối peroxyd nội phân tử.
Chính do sự có mặt của cầu nối peroxyd mà người ta đã sử dụng phương pháp
HPLC với detector điện hóa để định lượng Artesunat.
Năm 2010, Piero Olliaro và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp HPLC
detector điện hóa tiến hành định lượng ART và DHA. Khi chạy sắc ký ở nhiệt độ
phòng (25°C), cột Hypersil C4 (250 x 4,6 mm ID, 5 μm), pha động gồm MeCN và
đệm acetat (0,05 M, pH= 5,2), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, detecter -1000 mV trong

5


môi trường không có oxy, nhóm nghiên cứu thu được kết quả khoảng tuyến tính
ART và DHA là 20 ng/1 ml - 1600 ng/1 ml. LLOQ của ART và DHA đều là 20
ng/1 ml.Phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp trong việc
định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật. Tuy nhiên phương pháp này

yêu cầu môi trường không có oxy, điều kiện này khó được đảm bảo. Mặt khác
detector điện hóa ít phổ biến.
Phương pháp HPLC với detector khối phổ[22].
Phương pháp HPLC kết hợp detector khối phổ có nhiều ưu điểm hơn, ngày càng
được áp dụng rộng rãi do vậy chúng tôi sẽ trình bày cụ thể hơn ở các phần sau.
1.2.2. Định lượng đồng thời ART và DHA trong huyết tương bằng LC-MS.
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lượng ART và DHA trong huyết tương.
STT Tlkl

Điều kiện sắc ký

Phương
pháp chiết

1

Cột Xterra RP18 (100 mm x 2,1 mm ; 3,5µm).
Pha động:H2O: MeCN (50:50).
Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
Chuẩn nội: Artemisinin.
[29] Đường chuẩn: 10-1000 ng/ml DHA; 25-1000 ng/ml
ART.
LOQ:10 ng/ml DHA 25ng/ml ART.
Dung môi chiết EtOAc.
Thời gian phân tích 9 phút.

Chiết lỏng
lỏng

2

Cột: Elipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, 5µm).
Pha động: MeCN : acetic acid 0,003M (62:38 v/v).
Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
Chuẩn nội: Artemisinin.
[31] Đường chuẩn: 10-3200 ng/ml DHA; 10-3200 ng/ml
ART.
LOQ: 10 ng/ml DHA; 10ng/ml ART.
Dung môi: DCM : tert.-methyl butyl ether (8:2).
Thời gian phân tích 12 phút.

Chiết lỏng
lỏng

3

Cột: XTerra MS C18 (2,1 mm × 50 mm ; 3,5 µm).
[24] Pha động: Gradien đệm amoni acetat (pH 4,5 ; 6,25
mM) và MeCN :H2O.
6

Chiết lỏng
lỏng


Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.
Chuẩn nội: Artemisinin.
Đường chuẩn: 3,20–3,00ART; 5,33-5,00 nM DHA.
LOQ: 1.02 nM (0.39 ng/ml) ART; 0.44 nM (0,13
ng/ml) DHA.

Dung môi chiết: MeCN.
Thời gian phân tích 12 phút.

4

Cột: Accucore RP – C18 (50 mm x2.1 mm: 2,6 µm).
Pha động: H2O : acid formic 0,1 % (60:40 v/v).
[15]
Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
Thời gian phân tích 3 phút.

5

Cột: Hypersil Gold C18 (150 mm × 2,1 mm, 5 µm).
Pha động: Gradien acetonitril : amoni acetate (10 mM
pH 3,5) (40/60 v/v).
Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút hoặc 1 ml/phút.
Chuẩn nội: Artemisinin.
[22] Đường chuẩn: 1,96-2500 ng/mL DHA; 1,38-850
ng/ml ART.
LLOQ: 1,96ng/ml DHA; 1,38ng/ml ART.
Xử lý huyết tương bằng K2Cr2O7.
Thời gian phân tích 10 phút.

6

Cột: Synergi Max-RP18 (75 mm .4,6 mm; 4 µm).
Pha động: acetic acid (0,1%): MeOH: MeCN
(38:46,5:15,5, v/v).
Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

[13]
Chuẩn nội: Artemisinin.
Đường chuẩn:1-3000 ng/ml DHA; 1 3000ng/ml ART.
LOQ: 1 ng/ml DHA; 1 ng/ml ART.
Thời gian phân tích 21 phút.

Chiết pha
rắn.

Chiết pha
rắn

Chiết pha
rắn

Nhận xét:
Phương pháp xử lý mẫu: Các nghiên cứu trên sử dụng 2 phương pháp chiết được
sử dụng là chiết pha rắn và phương pháp chiết lỏng - lỏng. Phương pháp chiết pha
rắn để xử lý mẫu cho hiệu quả cao nhưng việc xử lý mẫu này tốn kém và phức tạp.
Phương pháp chiết lỏng lỏng tuy hiệu quả không cao bằng nhưng phù hợp với điều
kiện thực tế của cơ sở nên chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp này để tiến hành
nghiên cứu của mình.
7


Điều kiện sắc ký: Các nghiên cứu đều sử dụng chuẩn nội ARN, cột Rp C18 pha
động acid acetic : MeCN: MeOH hoặc nước: MeCN… điều chỉnh tới tốc độ dòng
phù hợp. Kết quả khoảng tuyến tính đạt được trong khoảng 10-3000 ng/ml.
Trên cơ sở các nghiên cứu trên và yêu cầu thực tế, chúng tôi chọn chuẩn nội là
ARN, phương pháp xử lý mẫu là chiết lỏng lỏng với dung môi thích hợp, cột sắc ký

Rp C18 với pha động thích hợp, khoảng nồng độ khảo sát là từ 5-1000 ng/ml.
1.3. Tổng quan về kỹ thuật LC-MS
1.3.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng khối phổ (HPLC-MS, hoặc LC-MS) là một kỹ thuật phân tích hóa học
kết hợp khả năng tách vật chất của phương pháp sắc ký lỏng với khả năng phân tích
khối lượng của khối phổ (MS). LC-MS là một kỹ thuật hiện đại có độ nhạy rất cao,
hữu ích trong nhiều ứng dụng. Ứng dụng được định hướng theo hướng tách, nhận
diện chất hóa học dựa trên khối lượng phân tử trong sự hiện diện của các chất khác
[14].
1.3.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và cho qua cột bằng một dòng chất
lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu di chuyển qua cột theo
pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha
tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu
sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng.
Phương pháp khối phổ là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ
số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (atomic mas unit) và bằng
khối lượng của nguyên tử hydro.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối phổ trước khi đến bộ phận phát hiện (detector). Quá trình phân
tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (p≈10-5-10-8 Torr).
Đối với các chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hóa phân tử trung
hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ các mảnh cấu

8


trúc phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có
khối lượng nhỏ hơn) bằng các phân tử mang năng lượng cao.

Quá trình phân mảnh mang đặc trưng cho cấu trúc phân tử và chỉ ra sự có mặt
của những nhóm chức đặc thù, cung cấp cho người phân tích những thông tin hữu
ích về cấu tạo hoặc nhận dạng của chất phân tích. Quá trình phân mảnh là cơ sở
giúp giải phổ, nhận dạng hoặc khẳng định cấu trúc của chất phân tích.
1.3.3. Cấu tạo và nguyên lý vận hành của hệ thống khối phổ [1]
Hiện nay, kỹ thuật HPLC đã trở nên phổ biến, được áp dụng rộng rãi trong thực tế
nhiều năm qua do vậy chúng tôi sẽ không mô tả cấu tạo phần LC mà tập trung vào phần
MS.
Cấu tạo: Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm các phần chính: bộ phận nạp mẫu, bộ
nguồn ion, bộ phân tích khối, detector và bộ phận xử lý dữ liệu. Mẫu được đưa vào
qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách
riêng nhờ bộ phận phân tích khối để tách các ion theo trị số m/z trước khi đến
detector.

Hình 1.3. Cấu tạo thiết bị khối phổ
Trong đó: (1)Bộ phận nạp mẫu (3)Bộ phận phân tích khối
(2)Bộ nguồn ion hóa (4)Bộ phận phát hiện
(5)Bộ ghi và xử lý số liệu
Bộ phận nạp mẫu (inlet)

9


Nạp mẫu trực tiếp: Với mẫu lỏng, mẫu được đưa vào buồng trung gian (áp suất
giảm) trước khi vào buồng chân không của máy. Có thể tách phần hơi của mẫu
trắng bằng một màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa.
Nạp mẫu gián tiếp: ở đây bộ phận nạp mẫu là đẩu của một thiết bị phân tích khác
được kết nối với khối phổ, đó là GC-MS, LC-MS... Các chất phân tích cần chuyển
từ pha lỏng sang pha hơi để ion hóa.
Bộ nguồn ion (ion source)

Một số kỹ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như ion hóa
phun điện tử (ESI), ion hóa học ở áp suất khí quyển (APCI).
- Ion hóa phun điện tử (ESI): Được thực hiện ở áp suất khí quyển. Các mẫu thử
trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này
có một điện thế có thể lên đến + 4000V. Đồng thời, các dung dịch mẫu này được
phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo ra các hạt mang điện
tích và được gia tốc đến điện cực.
- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI): được thực hiện ở áp suất khí quyển
nhờ tác động của một điện cực có điện thế cao đặt trên đường đi của pha động, pha
động được phun sương bằng hiệu ứng nhiệt và một luồng khí nito. Các ion hình
thành có một điện tích và là ion kiểu [M-H]+ trong chế độ phân cực dương và kiểu
[M-H]* trong phân cực âm.
Bộ phận phân tích khối (mas analyzer)
Bộ phân tích khối được coi như quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ phân
tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Một số phân tích
khối thường dùng như bộ phân tích bẫy ion tứ cực, bộ phân tích thời gian bay, bộ
phân tích từ.
Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phân tích tứ cực chập gồm ba tứ cực xếp nối
tiếp nhau Q1, Q2, Q3.
Tứ cực Q1 sẽ tách các ion; một số ion được chọn lọc (thường gọi là tiền ion) từ
đây vào Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm
với khí trơ có mặt như nitơ…Bộ Q2 tạo phân ly do va chạm, nhờ va chạm này năng

10


lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo
ra các ion nhỏ hơn (ion con). Các ion con tạo thành được dẫn tới Q3 tách riêng và
đến detector. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này gọi là khối phổ hai lần.
Detector

Nhân electron (electron multiplier): Tác động của ion lên bề mặt của các bán dẫn
sẽ tạo ra electron. Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của các bán dẫn khác
để tạo ra các electron khác. Quá trình cứ thế tiếp diễn để tạo ra nhiều electron. Các
electron được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ thuận với cường độ tín hiệu-tức
là số lượng ion đến detector.
Bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier): Các electron tạo ra theo cách va
chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon. Các photon này được thu nhận
và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu.
1.3.4. Một số chế độ thu phổ.
Thu tín hiệu toàn phổ ( Scan )
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường
dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu
dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
Thu tín hiệu chọn lọc hai lần
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2 kỹ
thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion
sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên
các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông
dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân
mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion
con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò
để phát hiện.

11


Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng phương pháp Scan để xác định mảnh

mẹ và MRM để định lượng các chất cần phân tích có trong mẫu.
Ưu điểm và ứng dụng khi lựa chọn MS kết nối với HPLC
Ưu điểmkhi lựa chọn MS kết nối với HPLC
MS cho thông tin về cấu trúc của các phân tử bao gồm phân tử lượng, phổ khối
lượng...định lượng nhiều cấu tử mà không cần tách triệt để. Có thể tìm ra các pic
không tinh khiết. Với hầu hết các chất phân tích, độ nhạy cao hơn nhiều so với
detector khác khi phân tích bằng HPLC. LC-MS bổ sung cho các loại detector khác
phân biệt các cấu tử có cùng phổ UV hoặc cấu tử không có đáp ứng cho bất kỳ một
loại detector HPLC nào khác. Kỹ thuật MS nhiều lần cho phép nghiên cứu cấu trúc
các hợp chất chưa biết.
Ứng dụngkhi lựa chọn MS kết nối với HPLC
Sắc ký lỏng khối phổ thường được dùng trong dược phẩm để phân tích nhiều loại
hoạt chất, các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC không giải quyết được.
Ngoài ra, LC-MS còn được dùng để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc
mẫu chuẩn cần phân tích, phân tích độc chất học,dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo
quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm,mỹ phẩm, phân tích các hợp chất tự nhiên
trong cây thuốc và đặc biệt phân tích thuốc trong dịch sinh học.

12


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là Artesunat và Dihydroartemisinin.
2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất
Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn
Tên chuẩn

Nguồn gốc

Artesunat

Lô SX

Hàm lượng

0209012

100,05 %

Artemisinin

Viện kiểm nghiệm

0209012

99,08%

DHA

thuốc trung ương

0309136.01

99,46%

Bảng 2.2: Danh mục thuốc thử
STT

Tên

Độ tinh khiết

Hãng sản xuất

1

Methanol

HPLC

Merck – Đức

2

Acetonitril

LCMS

Merck – Đức

3

Ethyl acetat

P.A

Merck – Đức

4

Kali dicromat

P.A.

Chemapol – Nga

5

Acid acetic băng

P.A.

Merck – Đức

6

Natri Clorid

P.A.

Merck – Đức

Huyết tương chó được tách từ máu chó nuôi bình thường, không dùng thuốc
trong ít nhất 1 tuần trước khi lấy máu.
2.1.3. Thiết bị dụng cụ:
Thiết bị:
 Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent 1290/6460.
 Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45 µm).

 Cân phân tích Mettler Toledo XPE 105.
 Máy lắc xoáy Vortex ZX3.
 Máy lắc ngang GFL 3006.

13


 Máy ly tâm Herme Z306.
 Máy siêu âm Daihan WUC – A06H.
 Máy cô nitơ Hanon HN200.
 Tủ lạnh âm sâu Sanyon MDF U333.
 Tủ lạnh bảo quản chuẩn HAIER HYC – 940.
 Tủ sấy Memmert ULM 500.
Dụng cụ:
Ống ly tâm thủy tinh, vial, đầu típ micropipet, micropipet, quả bóp cao su, bình
định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác.
2.2. Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng đồng thời ART và
DHA trong huyết tương trên thiết bị LC-MS/MS (xác định điều kiện LC, xác
định điều kiện MS, khảo sát dung môi chiết).
 Thẩm định phương pháp định lượng ( tính thích hợp hệ thống, độ chọn lọc/
đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, LOD, giới hạn định lượng).
 Ứng dụng đánh giá nồng độ ART, DHA trong một số mẫu HT chó.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong MeOH
Dung dịch chuẩn gốc ART (DHA): cân chính xác khoảng 12,5 mg ART (DHA)
thêm MeOH định mức đến 50 ml. Cân và pha riêng dung dịch chuẩn gốc dùng pha
dung dịch chuẩn và chuẩn gốc pha dung dịch chuẩn QC.
Dung dịch chuẩn nội gốc ARN: cân chính xác khoảng 10,0 mg chất chuẩn ARN

thêm MeOH định mức đến 50 ml.
Dung dịch chuẩn loãng:
Hút chính xác 0,2 ml dung dịch chuẩn gốc ART (DHA) cho vào bình định mức
10 ml. Pha loãng vừa đủ tới thể tích bằng MeOH.
Hút chính xác 0,6 ml dung dịch chuẩn nội gốc ARN cho vào bình định mức 25
ml. Pha loãng vừa đủ tới thể tích bằng MeOH.
14


Dung dịch chuẩn hỗn hợp ART và DHA: Từ các dung dịch chuẩn gốc pha thành
10 dung dịch chuẩn hỗn hợp, với nồng độ ART và DHA từ 0,1 đến 20 µg/ml. Pha
các dung dịch như sau:
Bảng 2.3: Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp ART và DHA

VART gốc (ml)
VDHA gốc (ml)
Tổng V (ml)

10

9

8

7

6

2
1

25

1
2
25

1,6
0,4
25

0,4
1,6
25

V dd khác (ml)
Tổng V (ml)
[C]/MeOH ART
(µg/ml) DHA

20
10

10
20

16
4

4
16

5

4

1ml 1 ml 1 ml
dd 10 dd 9 dd8
10
10 10
2
1
1,6
1
2
0,4

3

2

1

11

1 ml
dd7
10
0,4
1,6

1 ml
dd6
10
0,2
0,1

1 ml
dd5
10
0,1
0,2

5 ml
dd1
10
0,05
0,1

Dung dịch chuẩn nội: Hút chính xác 0,1 ml dung dịch chuẩn nội gốc ARN cho
vào bình định mức 20 ml. Pha loãng vừa đủ tới thể tích bằng MeOH.
Dung dịch chuẩn QC: Từ các dung dịch chuẩn gốc để pha QC pha thành 3 dung
dịch hỗn hợp QC có nồng độ tương ứng với LQC, MQC, HQC.
Bảng 2.4: Bảng nồng độ các mẫu QC
Mẫu QC

Mã

Khoảng nồng độ

Giá trị (ng/ml)

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

LQC

≤3 x LLOQ

15(ART) - 30
(DHA)

Mẫu kiểm tra nồng độ
trung bình

MQC

Gần điểm giữa của
đường chuẩn

500

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

HQC

70%-80% ULOQ

750

Pha các dung dịch như sau:
Pha dung dịch VART gốc QC (ml) loãng 33,3 lần: hút 0,6 ml dung dịch VART

gốc QC pha vừa đủ trong bình định mức đến 20 ml.
Pha dung dịch VDHA gốc QC (ml) loãng 33,3 lần: hút 0,6 ml dung dịch VART
gốc QC pha vừa đủ trong bình định mức đến 20 ml.

15


Bảng 2.5: Cách pha dung dịch chuẩn QC
Thể tích
Dung dịch
VART gốc QC (ml)
VDHA gốc QC(ml)
VART gốc QC (ml)loãng 33,3 lần
VDHA gốc QC(ml) loãng 33,3 lần
Tổng V (ml)
[C]/MeOH (µg/ml)

ART
DHA

QC_1
0,0
1,0
1,0
0,0
25
0,3
10

QC_2

1,0
1,5
0,0
0,0
25
10
15

QC_3
1,5
0,0
0,0
2,0
25
15
0,6

Chuẩn bị các mẫu
Quy trình chuẩn bị các mẫu được trình bày theo bảng sau:
Bảng 2.6:Cách chuẩn bị các mẫu
Tên mẫu
Trắng ULOQ LLOQ LOD
50 µl dd chuẩn
10
1
11
hỗn hợp số
50
VMeOH (µl)
950

950
950
950
VHT (µl)
0
1000
15
2
[C]/HT ART
(ng/ml) DHA
0
1000
30
5

ĐCi

QC_1

QC_2 QC_3

i

QC_1

QC_2 QC_3

950
Ci
Ci

950
15
500

950
500
750

950
750
30

Quy trình xử lý mẫu
Tham khảo một số tài liệu xử lý mẫu như bảo vệ cầu nối peroxyd[22], lựa chọn
chuẩn nội[13,22,24,29,31], lựa chọn dung môi chiết[29] và dung môi hòa tan
mẫu[13] chúng tôi tiến hành sử lý mẫu với quy trình xử lý mẫu như sau:
Tiến hành thêm 100 µl thể tích K2Cr2O7 0,4M vào 1 ml mẫu lắc đều 5 giây, thêm
tiếp 100 µl dung dịch chuẩn IS (1000ng/ml) lắc đều 5 giây. Sau đó thêm 0,5 ml
dung dịch NaCl bão hòa vào lắc đều 5 giây. Thêm tiếp 5 ml dung môi EtOAc lắc
ngang 10 phút tốc độ 60 lần/phút, ly tâm 15 phút tốc độ 5000 vòng/phút. Hút 3 ml
lớp dung môi hữu cơ cô nitơ ở nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong 1ml
MeOH sau đó tiến hành chạy sắc ký.
2.3.2. Khảo sát và xây dựng phương pháp
 Khảo sát điều kiện khối phổ
16