Xây dựng phương pháp định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƯƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1201277

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG
IMIPENEM VÀ MEROPENEM
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƯƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1201277

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG
IMIPENEM VÀ MEROPENEM
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Vũ Ngân Bình

Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian hoàn thành khóa luận, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới
cô Vũ Ngân Bình – người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi từng thao tác trong quá
trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn học viên cao học Nông Thị Thanh Phương,
Nguyễn Thị Thu Thủy đã tạo điều kiện cho tôi được tiếp cận mẫu huyết tương bệnh
thực tế. Hơn nữa, tôi xin cảm ơn thầy Lê Đình Chi, cô Phạm Thị Thanh Hà, thầy Ngô
Minh Thúy cùng toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân
tích – Độc chất trường đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Viện Công nghệ Dược phẩm
Quốc gia đã luôn nhiệt tình giải đáp, giúp đỡ tôi trong quá trình làm nghiên cứu.
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô, ban giám hiệu trường
đại học Dược Hà Nội đã tận tâm giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt nhất cho tôi
trong năm năm học vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên tinh
thần để tôi có thể hoàn thành khóa lụận.
Do sự thiếu sót về kinh nghiệm và thời gian thực hiện nên đề tài không tránh
khỏi nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để khóa
luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội ngày 25 tháng 4 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Hương


MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… ....…1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN………………………………………………….. .......3
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh carbapenem .............................................3

1.1.1.

Nguồn gốc ...............................................................................................3

1.1.2.

Dược động học ........................................................................................3

1.1.3.

Phổ tác dụng ...........................................................................................4

1.1.4.

Tính chất lý hóa ......................................................................................4

1.1.5.

Liên quan giữa các thông số PK/PD đến hoạt tính diệt khuẩn của

kháng sinh nhóm carbapenem ..................................................................................6
1.1.6.

Một số phương pháp phân tích đã được nghiên cứu để định lượng

imipenem và meropenem trong huyết tương .............................................................7
1.2.
1.2.1.

Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............10
Nguyên tắc ............................................................................................10

1.2.2. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ..............10
1.2.3.

Tổng quan về phân tích thuốc trong dịch sinh học...............................11

CHƯƠNG 2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU………...…………………………………………………..……...13
2.1. Hóa chất, thiết bị .............................................................................................13
2.1.1.

Hóa chất ................................................................................................13

2.1.2.

Thiết bị ..................................................................................................13

2.2.

Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu ...................................14

2.2.1.

Nội dung nghiên cứu .............................................................................14

2.2.2.

Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................14

2.2.3.

Phương pháp nghiên cứu ......................................................................14

2.2.4.

Cách tiến hành thẩm định các tiêu chí .................................................15

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………….. ......18


3.1.

Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imipenem và

meropenem trong huyết tương ...............................................................................18
3.1.1.

Quy trình xử lý mẫu ..............................................................................19

3.1.2.

Lựa chọn cột sắc ký ..............................................................................23

3.1.3.

Lựa chọn thành phần pha động ............................................................23

3.1.4.

Lựa chọn chế độ gradient pha động .....................................................23

3.1.5.

Lựa chọn tốc độ dòng ...........................................................................25

3.1.6.

Lựa chọn bước sóng..............................................................................26

3.1.7.

Điều kiện sắc ký xây dựng được ...........................................................27

3.2.

Thẩm định phương pháp ..........................................................................27

3.2.1.

Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký ...........................................................27

3.2.2.

Thẩm định phương pháp .......................................................................29

3.3.

Ứng dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng imipenem và

meropenem trong huyết tương bệnh nhân. ............................................................47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………….. ..........51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các thông số dược động học của imipenem và meropenem ...................... 3
Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu đã thực hiện định lượng nồng độ carbapenem
trong máu ...................................................................................................9
Bảng 3.1. Pha các dung dịch chuẩn ......................................................................... 28
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống của phương pháp ....................... 29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của imipenmem .................................... 33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của meropenem .................................... 34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát LLOQ của Imipenem và Meropenem ........................... 36
Bảng 3.6. Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của imipenem và meropenem
..................................................................................................................38
Bảng 3.7. Tóm tắt khoảng dao động độ đúng, độ chính xác trong ngày của hai
kháng sinh ................................................................................................39
Bảng 3.8. Kết quả độ đúng, độ chính xác khác ngày ............................................... 40
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ ổn định của hai carbapenem sau ba chu kỳ đông rã
..................................................................................................................41

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ ổn định trong ngày của hai carbapenem .............. 42
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định dài ngày của hai carbapenem .................. 43
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của imipenem và meropenem ................. 46
Bảng 3.13. Kết quả định lượng một số mẫu máu của bệnh nhân dùng imipenem ... 47
Bảng 3.14. Kết quả định lượng mẫu máu bệnh nhân dùng meropenem .................. 48


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của imipenem ...............................................................4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của meropenem ............................................................5
Hình 3.1. Quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương trắng .....................20
Hình 3.2. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương bệnh ..........22
Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ gradient (1) ...................................................................24
Hình 3.4. Sắc ký đồ chế độ gradient (2) ...................................................................24
Hình 3.5. Sắc ký đồ chế độ gradient (3) ...................................................................25
Hình 3.6. Phổ UV của imipenem ..............................................................................26
Hình 3.7. Phổ UV của meropenem ...........................................................................26
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng .............................................................31
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thêm imipenem (a) meropenem (b).....31
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thêm imipenem và meropenem .........32
Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu chuẩn cilastatin pha trong dung dịch MOPS .................32
Hình 3.12. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa tỉ số diện tích pic
imipenem/meropenem và nồng độ imipenem ............................................................33
Hình 3.13. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa tỉ số diện tích pic
meropenem/imipenem và nồng độ meropenem .........................................................34
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng imipenem ..................................48
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng meropenem ...............................49


DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ cái viết tắt

Nghĩa tiếng anh

Nghĩa tiếng việt

DHP – 1

Dehydropeptidase – 1

ES

External Standard

Chuẩn ngoại

IS

Internal Standard

Chuẩn nội

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
HQC

High Quality Control

Mẫu chuẩn nồng độ cao

LQC

Low Quality Control

Mẫu chuẩn nồng độ thấp

LLOQ

Lower Limit of Quantification

Giới hạn định lượng dưới

MIC

Minimum Inhibitory

Nồng độ ức chế tối thiểu

Concentration
MOPS

3-morpholinopropanesulfonic

MQC

Medium Quality Control

Mẫu chuẩn nồng độ trung
bình

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

PD

Pharmacodynamic

Dược lực học

PK

Pharmacokinetic

Dược động học

Ppm

Part per million

Nồng độ phần triệu

QC

Quality Control

Mẫu chuẩn

RSD (%)

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn
Giá trị trung bình

TB
T/MIC

Time above MIC

Thời gian nồng độ thuốc lớn
hơn nồng độ ức chế tối thiểu

UPLC

Ultra Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh là nhóm thuốc quan trọng hàng đầu hiện nay, đặc biệt ở một nước
nhiệt đới với các loại nhiễm khuẩn đa dạng và nguy hiểm như Việt Nam. Việc sử
dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn đến hệ lụy là xuất hiện một loạt các chủng vi
khuẩn kháng thuốc và nhiều loại kháng sinh đã không còn được sử dụng vì bị đề
kháng quá nhiều. Nhiều nhóm kháng sinh quý như aminoglycosid, cephalosporin…
đang bị đề kháng với tỷ lệ đáng báo động [6]. Các kháng sinh được xem như phòng
tuyến cuối cùng của con người với vi khuẩn như colistin, carbapenem cũng đã xuất
hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc [7,9]. Hiện nay, carbapenem, hay được sử
dụng nhất là imipenem và meropenem, được xem là lựa chọn cuối cùng để điều trị
các chủng vi khuẩn đa kháng và là lựa chọn hàng đầu trong điều trị kinh nghiệm tại
khoa điều trị tích cực (ICU). Để tránh hiện tượng đề kháng carbapenem, cần sử dụng
phác đồ kháng sinh hợp lý để tối ưu hóa tác dụng của thuốc và giảm sự đề kháng của
vi khuẩn. Carbapenem là một nhóm kháng sinh phụ thuộc thời gian, tức là hiệu lực
tác dụng của kháng sinh phụ thuộc khoảng thời gian nồng độ thuốc trong máu cao
hơn nồng độ ức chế tối thiểu (T/MIC) [8]. Mô hình dược động học của thuốc với từng
cá thể bệnh nhân, đặc biệt là các bệnh nhân nặng như bệnh nhân suy thận, bệnh nhân
bỏng nặng…có sự dao động rất lớn so với quần thể thông thường [18]. Vì vậy, việc
giám sát nồng độ thuốc trong máu trên những bệnh nhân sử dụng carbapenem đặc
biệt là nhóm bệnh nhân có thay đổi nhiều về các thông dược động học đóng vai trò
quan trọng đối với sự thành công của chiến lược điều trị bằng kháng sinh. Hiện nay,
ở Việt Nam đã có phương pháp định lượng imipenem, meropenem và ertapenem bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể áp dụng trong phân tích thường quy [10]. Tuy nhiên,
phương pháp còn một số điểm có thể cải thiện để thuận lợi cho quá trình phân tích
như thời gian phân tích mẫu tương đối dài. Xuất phát từ yêu cầu thực tế lâm sàng cần
xác định nồng độ imipenem và meropenem trong huyết tương để xây dựng mô hình

dược động học của thuốc tương ứng với cá thể bệnh nhân, chúng tôi cải tiến phương
pháp trên để rút ngắn thời gian phân tích. Đề tài “Xây dựng phương định lượng
1


imipenem và meropenem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” được
thực hiện với hai mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng imipenem và meropenem trong
huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng.
2. Ứng dụng phương pháp trên định lượng nồng độ imipenem và meropenem trong
huyết tương bệnh nhân sử dụng các kháng sinh này.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh carbapenem

1.1.1. Nguồn gốc
Carbapenem là dẫn xuất tự nhiên của thienamycin. Thienamycin được lấy từ
Streptomyces catteifa nhưng không bền nên không được dùng trong điều trị.
Imipenem là dẫn xuất N – formidoyl và meropenem là dẫn xuất demethylcarbamoyl
pyrolidinyl của thienamycin bền vững hơn [1].
1.1.2. Dược động học
Carbapenem không hấp thu qua đường tiêu hóa, chỉ dùng đường tiêm tĩnh mạch.
Thuốc khuyếch tán tốt vào các mô và dịch cơ thể. Thuốc được thải trừ chủ yếu qua
nước tiểu.
Imipenem bị thủy phân bởi enzym dehydropeptidase – 1 (DHP – 1) do thận tiết ra

do đó luôn được phối hợp với một chất ức chế DHP – 1 là cilastatin để kéo dài thời
gian bán thải và ức chế tạo chất chuyển hóa gây độc cho thận. Meropenem bền với
dipeptidase hơn nên không cần phối hợp với thuốc ức chế men DHP – 1 [1].
Các thông số dược động học của imipenem và meropenem được trình bày trong
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các thông số dược động học của imipenem và meropenem [25]
Kháng sinh

Imipenem

Meropenem

Liều
IV
(g)

Cmax
(µg/mL)

AUC
(mg.h/L)

0,25

30 – 35

42,2

0,5

60 - 70

186

0,5

26

27,2 – 32,4

1

50 – 60

66,9 – 77,5

t1/2
(h)

Vd
(L/kg)

% liên kết
protein
huyết
tương

% thải trừ
nguyên
vẹn

1

0,23 –
0,31

20

60 – 70*

1

0,23 –
0,35

2

70

*có cilastatin
(Cmax: nồng độ cực đại trong máu, AUC: diện tích dưới đường cong, t1/2: thời gian
bán thải, Vd: thể tích phân bố)
3


Với đường truyền tĩnh mạch:
Imipenem: truyền tĩnh mạch 500 mg imipenem trong 30 phút cho người trẻ và
người trung niên, đạt đỉnh nồng độ huyết thanh 30 - 40 mg/lít. Nồng độ này đủ để
điều trị phần lớn những nhiễm khuẩn [2].
Meropenme: truyền tĩnh mạch chậm liều 500, 1000 mg trong 30 phút cho

Cmax trung bình khoảng 23 và 49 µg/mL với giá trị AUC tương ứng là 39,3 và 63,2
μg.h/mL [27].
1.1.3. Phổ tác dụng
Carbapenem là nhóm kháng sinh diệt khuẩn có phổ kháng khuẩn rộng nhất
hiện nay. Chúng có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn Gram âm và dương, vi khuẩn
hiếu khí và kỵ khí, các vi khuẩn tiết ra β lactamase kể cả chủng kháng methicillin
[1]. Imipenem và meropenem có hoạt tính tốt trên Pseudomonas aeruginosa, không
có tác dụng trên Staphylococcus aureus kháng methicillin và Enterococcus faecium
[21].
Imipenem và meropenem được sử dụng điều trị nhiễm khuẩn nặng bao gồm
nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi mắc phải tại bệnh viện, nhiễm khuẩn đường ruột,
nhiễm khuẩn da và mô mềm, nhiễm khuẩn tiết niệu có biến chứng [21].
1.1.4. Tính chất lý hóa
1.1.4.1. Tính chất lý hóa của imipenem [17]


Công thức cấu tạo của imipenem như hình 1.1.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của imipenem
4




Danh pháp: (5R,6S)-3-[2-(aminomethylideneamino)ethylsulfanyl]-6-[(1R)-1hydroxyethyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid.



Công thức phân tử: C12H17N3O4S



PTL: 299,35



pKa1 = 3,2; pKa2 = 9,9.



Dạng dược dụng: imipenem monohydrat.



Tính chất vật lý: bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng đến ánh vàng, hơi
tan trong nước, ít tan trong methanol.



Dạng bào chế:
Bột pha tiêm tĩnh mạch imipenem/cilastatin 250 mg/250 mg; 500 mg/500 mg;
750 mg/750 mg.
Bột pha tiêm bắp imipenem/cilastatin 250 mg/250 mg; 500 mg/500 mg; 750

mg/750 mg.


Độ ổn định: Dung dịch sau hoàn nguyên nên được dùng ngay lập tức, khoảng
thời gian giữa lúc hoàn nguyên và tiêm truyền không nên quá 2 giờ [0].



Biệt dược gốc: TIENAM® (Merck)

1.1.4.2. Tính chất lý hóa của meropenem [17]
 Công thức cấu tạo của meropenem như hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của meropenem


Danh pháp: (4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin3yl]sulfanyl-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]-4-methyl-7-oxo-1azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid.
5


 Công thức phân tử: C12H25N3O5S.


PTL: 383,46.



pKa1 = 2,9; pKa2 = 7,4.



Dạng dược dụng: meropenem trihydrat, dạng bột tinh thể màu trắng đến vàng
nhẹ.



Độ tan: hơi tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 95% và diethyl ete.



Dạng bào chế, hàm lượng: bột pha tiêm tĩnh mạch 500 mg, 1000 mg.



Độ ổn định: Độ ổn định của chế phẩm pha tiêm trong nước được chứng minh lên
đến 3 giờ ở 25oC và 12 giờ ở điều kiện bảo quản lạnh (2 – 8oC) [27].

 Biệt dược gốc: MERONEM® (AstraZeneca)
Imipenem và meropenem thuộc nhóm kháng sinh β-lactam, không ổn định về
mặt vật lý và hóa học. Trong cấu trúc imipenem và meropenem có vòng β-lactam dễ
bị mở vòng bởi nhiều tác nhân ái nhân, tác nhân acid – base, ion kim loại, tác nhân
oxy hóa và thậm chí là dung môi như nước, alcol [15]. Độ ổn định ở nhiệt độ phòng
(khoảng thời gian sự phân hủy dưới 10%) với imipenem là khoảng từ 4 đến 10 giờ
(tùy thuộc loại dịch truyền) và 9 giờ đối với meropenem [18]. Do vậy các dung dịch
chuẩn và mẫu huyết tương trong các nghiên cứu thường được pha trong các dung
dịch bảo quản như 3–morpholinopropanesulfonic (MOPS) hoặc acid
2–[N–morpholino]ethansulfonic (MES) để đảm bảo độ ổn định của mẫu [0,10,
14,16,24].
1.1.5. Liên quan giữa các thông số PK/PD đến hoạt tính diệt khuẩn của kháng sinh
nhóm carbapenem
Carbapenem là kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, nhóm kháng sinh này tác dụng
theo cơ chế ức chế tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn và gắn với protein gắn
penicillin. β-lactam đạt hiệu quả cao nhất khi nồng độ thuốc đạt trên 4 lần nồng độ
ức chế tối thiểu (MIC). Nồng độ trên giá trị này sẽ không làm tăng hiệu quả diệt
khuẩn. Chỉ số tối ưu để đánh giá hiệu quả của nhóm β-lactam nói chung là khoảng
thời gian nồng độ thuốc cao hơn MIC (T/MIC). Với hầu hết các β-lactam, khoảng

6


thời gian nồng độ thuốc trong máu trên MIC đạt từ 40% trở lên so với khoảng đưa
liều được xem là đạt hiệu quả điều trị. Với các kháng sinh phân nhóm carbapenem,
giá trị khoảng thời gian này có thể thấp hơn. Đối với vi khuẩn Gram âm, khoảng thời
gian nồng độ thuốc trong máu trên MIC đạt 20% được báo cáo là có tác dụng kìm
khuẩn, đạt 40% được báo cáo là có tác dụng diệt khuẩn [8].
Để giá trị T/MIC đạt hiệu quả, có thể tăng liều, giảm khoảng cách đưa thuốc
hoặc truyền liên tục [8]. Nghiên cứu cho thấy truyền tĩnh mạch liên tục cả imipenem
và meropenem ở mức liều 1 g/24 giờ cho tác dụng vượt trội hơn đưa thuốc ngắt quãng
3 g/24 giờ trong điều trị nhiễm khuẩn P. aeruginosa [18]. Ứng dụng các thông số
PK/PD có thể giảm liều dùng của thuốc mà vẫn đạt hiệu quả điều trị mong muốn,
giúp giảm chi phí điều trị, giảm đề kháng. Do đó, nhiều nghiên cứu về mô hình dược
động học cá thể được tiến hành với hai kháng sinh imipenem và meropenem để giám
sát điều trị, chỉnh liều hai kháng sinh này phù hợp với đáp ứng lâm sàng, tối ưu hóa
chiến lược điều trị bằng kháng sinh và giảm đề kháng thuốc.
1.1.6. Một số phương pháp phân tích đã được nghiên cứu để định lượng imipenem
và meropenem trong huyết tương
Các phương pháp phân tích imipenem và meropenem trong huyết tương thường
sử dụng sắc ký lỏng pha đảo kết hợp detector khối phổ hoặc detector tử ngoại – khả
kiến. Ngoài ra sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) cũng được sử dụng. Với
meropenem, các nghiên cứu sử dụng cột C18, C8, PFP (pentafluorophenyl propyl)
[10, 11, 15, 16, 20, 24].Thông thường, pha tĩnh C18 lưu giữ chất phân tích tốt hơn
pha tĩnh C18, tuy nhiên với imipenem là một chất phân cực và pha động sử dụng ít
dung môi hữu cơ, các nghiên cứu thường sử dụng cột C8, cột HILIC [10, 14, 16] để
pha tĩnh có khả năng lưu giữ chất phân tích tốt hơn. Các phương pháp sử dụng
detector khố phổ cho kết quả có LOD và LOQ thấp hơn so với detector UV nhưng
phương pháp này có giá thành cao và chi phí vận hành lớn.
Hầu hết các phương pháp định lượng trong huyết tương đều dùng chuẩn nội,

chất chuẩn nội được sử dụng trong các nghiên cứu thường là các kháng sinh cùng
nhóm với chất phân tích [10, 11, 14, 16, 20] để đảm bảo các chất chuẩn và chuẩn nội
7


có cấu trúc gần giống nhau và hạn chế ảnh hưởng của chất chuẩn nội tới kết quả phân
tích do các kháng sinh cùng nhóm không được sử dụng đồng thời trên lâm sàng.
Một số phương pháp định lượng carbapenem trong dịch sinh học được trình
bày ở bảng 1.3.

8


Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu đã thực hiện định lượng nồng độ carbapenem trong máu
Tác giả

Đối tượng

Pha tĩnh

Lương Quốc
Huy (2007) [5]

Imipenem

Cột C18

Kato R et al.
(2016) [14]

Biapenem, panipenem,
imipenem, doripenem và
meropenem

Amino HILIC
(50×3 mm, 3 µm)

Marie.C et al.
(2011) [24]
Trần Mạnh
Thông [9]
Tiphaine.L et al.
(2008) [16]
E. Daillya
(2011) [11]
Lin G et al.
(2011) [15]
Rigo.R et al.
[20]

12 kháng sinh nhóm βlactam
Imipenem,
meropenem và
ertapenem
Imipenem, meropenem
và ertapenem
Imipenem, doripenem,
ertapenem và
meropenem
Meropenem

Meropenem trong huyết
tương, dịch thẩm tách và
nước tiểu

Atlantis T3 (C18)

Cột C8
Cột C8
Cột PentaFluoro
Phenyl
PFP Propyl (2,1 ×
100 mm; 5 μm)
Cột C18

Pha động

Chuẩn nội

Detector

LOD
LOQ

Acid boric 0,2 M và
methanol
Amoni acetat 10 mM
(pH 6,8) và acetonitrile.

Không dùng
chuẩn nội

UV ở 298 nm

LOD: 0,02 ppm

Piperacillin

Detector khối phổ
(MS)

LOD: 1,25 ppm;
2,5 – 5 ppm

Acetonitril và acid
phosphoric pH = 2

Không dùng
chuẩn nội

UV λ = 210 nm,
230 nm và 298 nm
ứng với từng loại
kháng sinh

LOD: dưới 1 – 2 ppm
LOQ: 2 – 5 ppm

Đệm phosphat 0,1 M
pH 7,4 và methanol
40% trong nước

Đệm phosphat pH = 6,8
0,1 M và methanol

Meropenem;
imipenem;
imipenem

UV λ = 298 nm

LLOQ: 0,5 ppm

Ceftazidim

UV λ = 298 nm

LOD: 0,5 ppm

Ceftazidim

UV λ = 295 nm

LOQ: 0,5 ppm cho cả
4 kháng sinh

MS

LOD: 0,04 ppm
LOQ: 0,1 ppm

Đệm Na2HPO4 0,1 M

pH 7 và methanol
HCOOH 0,1% và
acetonitril
Acetonitril và 0,1%
HCOOH trong nước

9

Triazolam

Ertapenem

MS

LOD: 0,09 - 0,29 ppm
LLOQ: 0,24 - 1,22
ppm


1.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.2.1. Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích
di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh với tốc độ khác nhau liên quan đến ái lực
tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động [3].
Có nhiều kỹ thuật sắc ký lỏng, trong đó hiện nay sử dụng phổ biến nhất kỹ thuật
sắc ký phân bố pha liên kết. Sắc ký phân bố pha liên kết sử dụng pha tĩnh có liên kết
hóa học với bề mặt chất mang rắn (hay gặp nhất là silica). Nhóm silanol trên bề mặt
hạt silica phản ứng với clorosilan tạo ra dẫn chất có độ phân cực khác nhau. Phụ thuộc
vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh, người ta phân ra hai loại : sắc
ký pha thuận và sắc ký pha đảo. Sắc ký pha đảo là loại hình hay được sử dụng trong

phân tích thuốc. Kỹ thuật này sử dụng pha tĩnh kém phân cực hơn so với pha động.
Pha tĩnh hay dùng là dẫn chất C18, C8, phenyl (C6H5) và pha động là các dung môi
phân cực như nước, đệm, methanol, acetonitril… Ưu điểm của sắc ký lỏng pha đảo
là sử dụng dung môi thân nước, ít độc hại [3]. Tuy nhiên sắc ký lỏng pha đảo không
lưu giữ hoặc kém lưu giữ các chất phân cực. Phần lớn các nghiên cứu phân tích
carbapenem trong huyết tương đều sử dụng sắc ký lỏng pha đảo [9, 15, 16, 20, 25].
Carbapenem, đặc biệt là imipenem là những chất tương đối phân cực, sẽ ít bị lưu giữ
khi sử dụng cột kém phân cực C18, do đó thường sử dụng pha tĩnh phân cực hơn là
cột C8.
1.2.2. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng
độ chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của pic trên sắc ký đồ. Có bốn
phương pháp hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp ngoại chuẩn, nội chuẩn,
thêm chuẩn và chuẩn hóa diện tích. Trong đó phương pháp chuẩn nội thường được
sử dụng trong phân tích thuốc trong dịch sinh học do hạn chế được sai số trong quá
trình xử lý mẫu.

10


Phương pháp nội chuẩn được tiến hành như sau: Thêm vào cả mẫu chuẩn và
mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện. Chất thêm vào được gọi là chuẩn nội.
Phương pháp định lượng sử dụng chất chuẩn nôi dựa sự tương quan giữa giữa
tỉ số diện tích (hoặc chiều cao) của chuẩn trên chuẩn nội (SS/SIS) với nồng độ chuẩn
ngoại (CS) hoặc tỉ số nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (CS/CIS). Từ diện tích pic
chuẩn, chuẩn nội và chất phân tích trong mẫu thử, có thể xác định hàm lượng của
thành phần cần định lượng trong mẫu thử [4].
Yêu cầu đối với chất chuẩn nội:


Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời

gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.


Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.



Có nồng độ xấp xỉ nồng độ của chất thử.



Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.



Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm [4].

1.2.3. Tổng quan về phân tích thuốc trong dịch sinh học
Dịch sinh học thường có nền mẫu rất phức tạp và các chất phân tích thường tồn
tại ở nồng độ rất thấp. Các bước của quá trình phân tích trong dịch sinh học gồm: lấy
mẫu, chuẩn bị mẫu, tách, phát hiện, định tính và định lượng.
Chuẩn bị mẫu là giai đoạn rất quan trọng nhằm loại bỏ các thành phần tạp không
mong muốn và làm giàu mẫu. Nếu protein trong huyết tương được tiêm vào cột sắc
ký thì nó có thể bị tủa bởi pha động gây tắc đường dẫn, tăng áp suất hệ thống. Phương
pháp phổ biến để loại protein là kết tủa protein bằng acid hoặc dung môi hữu cơ tan
trong nước, trong đó acetonitril hay được sử dụng nhất. Ngoài ra, các phương pháp
chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) cũng được dùng để làm sạch mẫu, làm giàu

chất phân tích.

11


Các chất trong dịch sinh học có thể được tách bằng HPLC, UPLC, sắc ký khí
(GC)… trong đó HPLC và UPLC hay được sử dụng để phát hiện và giám sát nồng độ
thuốc trong máu.
Detector khối phổ được sử dụng nhiều nhất trong phát hiện các chất trong dịch
sinh học, tuy nhiên, nó có giá thành cao và chi phí vận hành lớn. Một số detector khác
có thể dùng như UV, huỳnh quang hay detector diện hóa.
Để định lượng các chất trong huyết tương, có thể sử dụng phương pháp ngoại
chuẩn hoặc nội chuẩn trong đó nội chuẩn được ưu tiên hơn vì cho kết quả tin cậy hơn.
Chất chuẩn nội nên được thêm vào ngay khi bắt đầu xử lý mẫu, trước khi thêm tác
nhân tủa protein huyết tương. Khi dung dịch chuẩn và dung dịch thử được xử lý theo
cùng một quy trình, tỉ lệ giữa nồng chất phân tích và chất chuẩn nội luôn là hằng số
[19].

12


CHƯƠNG 2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất, thiết bị
2.1.1. Hóa chất


TIENAM® (Merck) 500 mg imipenem/500 mg cilastatin: mỗi lọ có chứa 530,1

mg imipenem monohydrate và 530,8 mg cilastatin natri.



MERREM® (AstraZeneca) 1g meropenem: mỗi lọ có 1141,0 mg meropenem

trihydrat và 207,9 mg natri carbonat.


Huyết tương trắng (Viện Huyết học và truyền máu trung ương).



Kali dihydrophosphat (Merck).



Dikali hydrophosphat (Merck).



Natri hydroxyd (Merck).



3 – morpholinopropansulfonic (MOPS) (Sigma – Aldrich).



Methanol HPLC (Merck).



Nước cất hai lần.



Khí nitơ.

2.1.2. Thiết bị


Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Algilent 1100.



Cột sắc ký Apollo C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm) (Alltech)



Máy li tâm Kubota 6500.



Cân phân tích Sartorius.



Tủ lạnh âm sâu -80oC Model panasonic MDF-594-PB.



Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H.



Máy lắc xoáy Labinco L46.



Máy đo pH Mettler Toledo.



Micropipet 10 – 100 µL ABMATE pro, 100 - 1000 µL Nichipet EX.



Ống ly tâm Eppendorf 1,5 mL.



Máy cô nitơ Hanon HN 200.
13




Máy sinh khí nitơ PEAK INFINITY 9000.



Bình định mức 5 mL (Merck).



Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,45 µm để lọc dung môi (Sartorius stedim)

2.2.

Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký


Lựa chọn cột sắc ký.



Lựa chọn pha động.



Lựa chọn chế độ gradient pha động.



Lựa chọn tốc độ dòng.



Lựa chọn bước sóng.

2.2.1.2. Thẩm định phương pháp sắc ký theo tiêu chuẩn của FDA


Độ phù hợp hệ thống.



Tính đặc hiệu, chọn lọc.



Tính tuyến tính.



Độ chính xác.



Độ đúng.



Giới hạn định lượng dưới.



Độ ổn định của mẫu trong huyết tương.

2.2.2. Đối tượng nghiên cứu


Mẫu dùng trong nghiên cứu là mẫu tự tạo của imipenem và meropenem trong
huyết tương trắng.



Huyết tương bệnh nhân ở bệnh viện Bỏng sử dụng kháng sinh imipenem và bệnh
viện đa khoa tỉnh Phú Thọ sử dụng kháng sinh meropenem.

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu


Tổng quan tài liệu xác định phương pháp xử lý mẫu và điều kiện sắc ký ban đầu.



Điều kiện sắc ký: lựa chọn thành phần và pH pha động, chương trình gradient
dung môi, tốc độ dòng, bước sóng cho kết quả tách tốt nhất hai carbapenem trên
sắc ký đồ.
14




Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng theo hướng dẫn của FDA trên
các tiêu chí tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp, tính
tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, độ ổn định (độ ổn định qua ba chu kỳ đông

rã, độ ổn định trong ngày, độ ổn định dài ngày), xác định giới hạn định lượng
dưới (LLOQ).



Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.

2.2.4. Cách tiến hành thẩm định các tiêu chí
2.2.4.1. Độ chọn lọc, đặc hiệu
Là khả năng phương pháp phân tích nhận diện và phân biệt được chất phân tích
và các thành phần có trong mẫu. Phân tích trên các mẫu huyết tương trắng có nguồn
gốc khác nhau, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn, chuẩn nội và hỗn hợp, so sánh
các sắc ký đồ thu được. Tại vị trí các pic chuẩn, chuẩn nội không được xuất hiện các
pic tạp của nền mẫu trắng.
2.2.4.2. Giới hạn định lượng dưới
Tiến hành phân tích trên 6 mẫu huyết tương trắng và 6 mẫu tự tạo có chứa chất
phân tích và chất chuẩn nội ở nồng độ LLOQ dự kiến.
Nồng độ thấp nhất của đường chuẩn được chấp nhận là giới hạn định lượng dưới
nếu thỏa mãn các tiêu chí sau:
 Đáp ứng của chất phân tích ở LLOQ phải lớn hơn ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu
trắng.
 Pic của chất phân tích phải được nhận diện rõ ràng, không bị ảnh hưởng bởi các
thành phần khác và lặp lại với độ chính xác 20% và độ đúng trong khoảng 80 –
120%.
2.2.4.3. Đường chuẩn
Các điều kiện đường chuẩn xây dựng cần đáp ứng:
Đường chuẩn xây dựng bao gồm từ 6 đến 8 mẫu chuẩn bao phủ khoảng nồng
độ làm việc dự kiến, bao gồm LLOQ và phải đáp ứng các điều kiện sau:


Độ lệch so với nồng độ định danh phải nhỏ hơn 20% ở LLOQ và nhỏ hơn 15% ở
các nồng độ khác.
15




Ít nhất 4 trên 6 điểm chuẩn phải thỏa mãn tiêu chí trên, bao gồm điểm thấp nhất
và cao nhất của đường chuẩn.

2.2.4.4. Độ đúng, độ chính xác và tỉ lệ thu hồi


Độ đúng là giá trị phản ánh độ gần sát của nồng độ chất phân tích định lượng

được so với giá trị thực. độ đúng được xác định trên tối thiểu 3 mức nồng độ trong
khoảng nồng độ làm việc dự kiến, mỗi nồng độ tối thiểu 5 mẫu. Độ đúng phải nằm
trong khoảng 85 – 115% so với giá trị thực, riêng với LLOQ yêu cầu trong khoảng
80 – 120%.


Độ chính xác là giá trị phản ánh độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại

quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biệu thị bằng
giá trị hệ số biến thiên CV (%). Yêu cầu giá trị CV ≤ 15%, riêng với LLOQ yêu cầu
CV ≤ 20%.
Độ chính xác có thể có thể đánh giá trên độ chính xác trong ngày, độ chính xác
khác ngày và độ tái lặp.


Tỉ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá

trình xử lý mẫu. Tỉ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh đáp ứng các mẫu chuẩn
thêm vào nền mẫu và xử lý mẫu với nồng độ thực của chất chuẩn tinh khiết không
qua xử lý mẫu. Tiến hành trên 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ 3 mẫu
riêng biệt.
Tỉ lệ thu hồi không nhất thiết phải đạt 100% nhưng phải chính xác, ổn định và
lặp lại.
2.2.4.5. Độ ổn định
 Độ ổn định qua ba chu kỳ đông rã
Được tiến hành ở các nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ ít nhất ba mẫu.
Các mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ dự kiến bảo quản mẫu trong 24 giờ và để tự rã đông
ở nhiệt độ phòng. Khi hoàn toàn rã đông, các mẫu được tái đông ở cùng điều kiện
trong 12 – 24 giờ. Các mẫu được xử lý và phân tích ở chu kỳ đông rã thứ ba.
 Độ ổn định ngắn hạn
16


Được xác định ở 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ 3 mẫu được rã
đông hoàn toàn và giữ ở nhiệt độ này từ 4 đến 24 giờ (tùy thuộc thời gian dự kiến duy
trì ở nhiệt độ phòng) và phân tích.
 Độ ổn định dài hạn
Thời gian đánh giá độ ổn định dài hạn nằm ngoài khoảng thời gian từ này thu
thập mẫu đầu tiên đến ngày phân tích mẫu cuối cùng. Ít nhất ba mẫu của mỗi nồng
độ LQC, MQC, HQC phải được đánh giá. Độ ổn định dài ngày so sánh với nồng độ
mẫu chuẩn phân tích ngày đầu tiên.

17