Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CỒ THỊ OANH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME
QUERCETIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CỒ THỊ OANH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME
QUERCETIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM
VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 60720402

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Vũ Thị Thu Giang

NCS. Nguyễn Hồng Trang

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị
Thu Giang và NCS. Nguyễn Hồng Trang đã hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ và trực tiếp
hƣớng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ và toàn thể
các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, các thầy cô giáo trong
trƣờng, các phòng ban, thƣ viện - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhƣng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng
nhƣ tài liệu tham khảo nên luận văn của tôi không thể tránh khỏi những sai sót,
khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các
thầy cô để luận văn đƣợc hoàn thiện hơn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2017
Học viên

Cồ Thị Oanh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 2
1.1.

Tổng quan về quercetin .................................................................................... 2

1.1.1. Công thức cấu tạo của Quercetin ..................................................................... 2
1.1.2. Tính chất lý hóa ................................................................................................ 2
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý .............................................................................................. 3
1.1.4. Dƣợc động học ................................................................................................. 3
1.1.5. Tác dụng ........................................................................................................... 4
1.1.6. Tác dụng không mong muốn ............................................................................ 4
1.1.7. Liều dùng.......................................................................................................... 4
1.1.8. Một số chế phẩm chứa quercetin trên thị trƣờng ............................................. 4
1.2.

Phytosome ........................................................................................................ 5

1.2.1. Khái niệm phytosome....................................................................................... 5
1.2.2. Thành phần cấu tạo phytosome ........................................................................ 5
1.2.3. Độ ổn định của phytosome ............................................................................... 6
1.2.4. Ƣu nhƣợc điểm ................................................................................................. 7
1.2.5. Phƣơng pháp bào chế phytosome ..................................................................... 7
1.2.6. Đánh giá một số đặc tính của phytosome......................................................... 8
1.3.

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa .................................................................. 12

1.3.1. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH ............................................................. 12
1.3.2. Xác định khả năng ức chế peroxid hóa lipid .................................................. 13
1.4.

Một số nghiên cứu về phytosome .................................................................. 14

1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới ................................................................................. 14
1.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ................................................................................. 15
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 19
2.1.

Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi, thiết bị ................................................ 19

2.1.1. Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi .............................................................. 19
2.1.2. Thiết bị thí nghiệm .......................................................................................... 20
2.2.

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20


2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 20

2.3.1. Bào chế phytosome bằng phƣơng pháp kết tủa trong dung môi ..................... 20
2.3.2. Định lƣợng quercetin ...................................................................................... 21
2.3.3. Xác định hệ số phân bố dầu nƣớc (log P) ....................................................... 21
2.3.4. Đánh giá một số đặc tính của phytosome ....................................................... 22
2.3.5. Đánh giá hiệu suất phytosome hóa ................................................................. 23
2.3.6. Nghiên cứu độ ổn định .................................................................................... 24
2.3.7. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa.................................................................. 24
2.4.

Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 27

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 28

3.1.

Nghiên cứu cải thiện độ ổn định vật lý của hỗn dịch phytosome quercetin .. 28

3.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thông số kỹ thuật bào chế phytosome quercetin đến
đặc tính vật lý của phytosome. .................................................................................. 28
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần công thức đến đặc tính phytosome. ..... 30
3.1.3. Đánh giá phytosome quercetin bào chế ......................................................... 33
3.2.

Nâng qui mô bào chế ...................................................................................... 38

3.3.

Quy trình bào chế ........................................................................................... 42

3.4.

Nghiên cứu độ ổn định của phytosome quercetin .......................................... 44

3.5.

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa .................................................................. 49

3.5.1. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH ............................................................. 49
3.5.2. Khả năng ức chế peroxy hoá lipid .................................................................. 50
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 52
4.1.

Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin .............. 52

4.1.1. Về công thức bào chế ..................................................................................... 52
4.1.2. Về dung môi kết tủa. ...................................................................................... 52
4.1.3. Về quy trình bào chế ...................................................................................... 52
4.2.

Về phƣơng pháp chứng minh phức hợp ......................................................... 52

4.2.1. Phƣơng pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử ............................................ 53
4.2.2. Phƣơng pháp phổ IR....................................................................................... 53
4.2.4. Phƣơng pháp phân tích nhiệt vi sai DSC ....................................................... 53


4.2.5. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR ..................................... 53
4.3.

Về hệ số phân bố dầu nƣớc ............................................................................ 54

4.4.

Về nâng cấp quy mô bào chế ......................................................................... 54

4.5.

Về độ ổn định của hỗn dịch phytosome quercetin ......................................... 54

4.6.

Về bƣớc đầu đánh giá hiệu quả chống oxy hóa của phytosome quercetin .... 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 55


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT

Ký hiệu

1

HC

Hoạt chất

2

DSC

Phân tích nhiệt quét vi sai

3

1

4

13

H-NMR

Từ/cụm từ

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hydro đồng vị 1H

C-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hydro đồng vị 13C

5

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

6

HSPC

7

PC

8

NaCMC

Natri carboxylmethyl cellulose

9

HPMC

Hydroxy propyl methyl cellulose

10

EE

Hiệu suất phytosome hóa (entrapment efficiency)

11

IR

Phổ hồng ngoại

12

KTTP

13

PDI

Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

14

SEM

Kính hiển vi điện tử quét

15

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua

16

XRD

Phổ nhiễu xạ tia X

17

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

18

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

19

NSX

20

tt

Thể tích

21

kl

Khối lƣợng

Phosphatidylcholin

đậu

nành

hydrogen

(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin)
Phosphatidyl cholin

Kích thƣớc tiểu phân

Nhà sản xuất

hóa

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
STT
Bảng 2.1
Bảng 3.1

Bảng 3.2

Bảng 3.3

Bảng 3.4

Bảng 3.5

Bảng 3.6

Tên bảng
Nguyên liệu
Đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tỉ lệ
thể tích pha ethanol/pha nƣớc khác nhau..
Đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với
phƣơng pháp phối hợp pha ethanol vào pha nƣớc khác nhau.

Trang
19
28

29

Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tốc độ
khuấy trộn pha nƣớc khác nhau

Hiệu suất phytosome hóa và đặc tính của hỗn dịch phytosome
quercetin bào chế với các tỉ lệ mol CH/HSPC khác nhau

30
31

Độ ổn định của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với
các tỉ lệ mol CH/HSPC khác nhau

31

Đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với một
số chất ổn định khác nhau

32

Bảng 3.7

Đặc tính hỗn dịch và hiệu suất phytosome hóa

34

Bảng 3.8

Log P của quercetin với thời gian khuấy trộn 2 pha khác nhau

34

Bảng 3.9

Log P của quercetin và phytosome quercetin

35

Bảng 3.10
Bảng 3.11
Bảng 3.12

Bảng 3.13

Bảng 3.14

Bảng 3.15

Số sóng nhóm -OH trong quercetin, cholesterol; nhóm
(RO)2PO2-N+(CH3)3 trong HSPC.
Đặc tính hỗn dịch và hiệu suất phytosome hóa.
Đánh giá ảnh hƣởng của thể tích môi trƣờng kết tủa đến đặc
tính của hỗn dịch phytosome quercetin.
Đánh giá ảnh hƣởng của tốc độ khuấy trộn đến đặc tính của
hỗn dịch phytosome quercetin.
Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với thời gian
siêu âm khác nhau.
Hiệu suất phytosome hóa và đặc tính hỗn dịch phytosome
quercetin bào chế theo quy trình 3.9.

36
39
39

41

42

44


Bảng 3.16

Hiệu suất phytosome hóa và đặc tính của hỗn dịch phytosome
quercetin.

45

Bảng 3.17

Khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH

49

Bảng 3.18

Khả năng ức chế peroxy hóa lipid

50


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

STT

Trang

Hình 1.1

Công thức hóa học của Quercetin

2

Hình 1.2

Cấu trúc phytosome

5

Hình 1.3

Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

6

Hình 1.4

Hình 1.5

Hình 1.6

Phổ IR. (A) phospholipid, (B) Quercetin, (C) Quercetinphospolipid
Phổ DSC. a) phospholipid, b)silybin, c)phức hợp silybin-PC, c)

hỗn hợp silybin-PC
Phổ nhiễu xạ tia X: A) Quercetin, B)phức hợp quercetinphospholipid, C) phospolipid

9

11

12

Hình 2.1

Công thức cấu tạo các dạng chuyển hóa của DPPH

25

Hình 2.2

Cơ chế tạo màu của MDA

26

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình ảnh chụp SEM của quercetin và phytosome quercetin kết
tủa trong dung dịch NaCMC.
Kết quả phổ IR của quercetin, HSPC, hỗn hợp vật lý và
phytosome.

33

36

Hình 3.3

Phổ 1H-NMR đoạn từ 8–13ppm của quercetin và phức hợp.

37

Hình 3.4

Phổ nhiễu xạ tia X của quercetin và phytosome quercetin.

37

Hình 3.5

Hình 3.6

Phổ phân tích nhiệt quét vi sai của quercetin, HSPC, cholesterol,
phytosome.
Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tốc độ khuấy trộn lên đặc tính
hỗn dịch phytosome quercetin.

38

40

Hình 3.7

Hình 3.8

Hình 3.9

Hình 3.10

Hình 3.11

Hình 3.12

Hình 3.13

Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thể tích môi trƣờng phân tán lên
đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin.
Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian siêu âm lên đặc tính
hỗn dịch phytosome quercetin
Quy trình bào chế hỗn dịch phytosome quercetin bằng phƣơng
pháp kết tủa trong môi.
Hình ảnh các mẫu hỗn dịch phytosome quercetin bào chế đƣợc
bảo quản ở các điều kiện khác nhau ban đầu và sau 1 tháng.
Hình ảnh SEM mẫu hỗn dịch phytosome quercetin bào chế ban
đầu
Hình ảnh SEM mẫu hỗn dịch phytosome quercetin bào chế sau
1 tháng điều kiện lão hóa.
Hình ảnh SEM mẫu hỗn dịch phytosome quercetin bào chế sau
2 tháng điều kiện lão hóa.

41

42

43

47

48

48

49


ĐẶT VẤN ĐỀ
Mặc dù đƣợc chứng minh có thể mang lại những tác dụng quí nhƣng nhiều hoạt
chất nhóm polyphenol có nguồn gốc từ dƣợc liệu chƣa đƣợc ứng dụng trong điều trị
do độ tan và tính thấm kém, chuyển hóa nhiều qua gan. Trong số đó, quercetin là
một flavonoid tự nhiên đƣợc chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm,
chống ung thƣ, bảo vệ tim mạch… Quercetin đã đƣợc nghiên cứu xây dựng quy
trình tách chiết phân lập hoàn chỉnh, và đến nay chƣa có bất kì một tài liệu nào cho
thấy độc tính liên quan đến việc sử dụng quercetin thậm chí là ở liều cao. Vì vậy,
tăng sinh khả dụng thông qua cải thiện khả năng hấp thu, hạn chế chuyển hóa qua
gan quercetin nói riêng và flavonoid nói chung đang là một vấn đề đƣợc nhiều nhà
khoa học quan tâm.
Phytosome đƣợc xem là một hƣớng nghiên cứu hiệu quả ứng dụng các hoạt chất
thiên nhiên nhóm polyphenol vào điều trị lâm sàng. Các hoạt chất đƣợc liên kết với
phospholipid tạo thành cấu trúc tiểu phân hình cầu có tính lƣỡng cực, nhờ đó cải
thiện độ tan vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Năm 2015,
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã bƣớc đầu thực hiện nghiên cứu bào chế

phytosome quercetin theo hai phƣơng pháp khác nhau [12],[13]. Để ứng dụng
những thành quả thu đƣợc và tiếp tục phát triển hƣớng nghiên cứu. Chúng tôi quyết
định thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin” với hai mục tiêu
sau:
1. Xây dựng được công thức và qui trình bào chế phytosome quercetin theo
phương pháp kết tủa trong dung môi.
2. Bước đầu đánh giá hiệu quả chống oxy hóa của phytosome quercetin.

1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về quercetin

1.1.1. Công thức cấu tạo của Quercetin

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Quercetin
-

Công thức phân tử: C15H10O7

-

Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-l-benzopyran-4one.

-

Khối lƣợng phân tử: 302,23 g/mol [39].

1.1.2. Tính chất lý hóa
 Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng-xanh, hình kim.
- Độ tan: Tan trong acid acetic băng và các dung dịch kiềm, không tan trong nƣớc .
1 gam quercetin hòa tan trong 290 ml ethanol ở nhiệt độ thƣờng [39].
- Nhiệt độ nóng chảy: 316oC [46].
- Cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 258 nm và 370 nm trong methanol [40].
 Hóa tính:
- Tính oxy hóa: Trong môi trƣờng pH=2, quercetin bị oxy hóa bởi H2O2 tạo ra
quinon [19].
- Tính acid yếu: Quercetin trong dung dịch ammonic có màu vàng sáng [3].
- Phản ứng thế: Các flavonoid dễ tham gia phản ứng thế hơn so với benzen.
- Phản ứng diazo hóa và azo hóa: thƣờng sử dụng để phát hiện flavonoid trên sắc
ký đồ. Thuốc thử là các amin thơm: acid sulfanilic, benzidin, p-nitroanilin [35].

2


- Phản ứng Shinoda: Phản ứng đặc trƣng cho flavonoid có nhóm carbonyl vị trí C4
và nối đôi của hai carbon vị trí 2 và 3. Trong môi trƣờng acid hydrocloric, quercetin
bị khử bởi kim loại magnesi tạo thành dẫn chất màu cyanidin chlorid [4].
- Phản ứng chống oxy hóa: Các flavonoid có khả năng trung hòa gốc tự do
hydroxyl và peroxy, tạo phức chelat với kim loại chuyển tiếp dẫn đến giảm vai trò
của tác nhân Fenton [22].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Quercetin là một trong những flavonoid có hoạt tính mạnh nhất trong việc

-

bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do. Cơ chế chống oxy hóa của quercetin có thể là
chống lại các dạng oxy hoạt động (O2-˙, oxy đơn phân tử, gốc tự do OH˙), ức chế sự
khởi đầu của chuỗi phản ứng oxy hóa hoặc ngăn chặn những phản ứng dây chuyền
xảy ra nhƣ ngăn cản quá trình peroxid lipid, tạo phức chelat với ion kim loại chuyển
tiếp [30].
Quercetin có khả năng chống xơ vữa động mạch do giảm quá trình oxy hóa

-

LDL cholesterol [45].
Quercetin bảo vệ cơ thể khỏi tác dụng oxy hóa quang học của tia UVB, UVA

-

theo cơ chế làm giảm enzym chống oxy hóa do phơi nhiễm UVB, UVA gây ra [32],
[35].
Chống viêm do quercetin ức chế quá trình sản xuất leukotrien và

-

prostaglandin, ức chế tế bào lympho, đại thực bào [15].
Quercetin có thể hỗ trợ trong điều trị ung thƣ do giảm sự phát triển của khối

u [15].
-

Ức chế quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin trên da do quercetin ức chế

hoạt động của enzym tyrosinase, enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh
tổng hợp chất màu melanin. Do đó, hoạt chất này đƣợc sử dụng khá phổ biến trong

mỹ phẩm và dƣợc phẩm để điều trị các bệnh về da và làm đẹp da [13].
1.1.4. Dược động học
Hấp thu: Quercetin có sinh khả dụng đƣờng uống rất thấp, khoảng xấp xỉ 17%
trên chuột và chƣa đến 1% trên ngƣời [29].

3


Phân bố: Quercetin gắn mạnh với albumin trong huyết tƣơng (98%), phân bố
tới các mô trong cơ thể [35].
Chuyển hóa và thải trừ: Quercetin bị chuyển hóa qua gan. Chất chuyển hóa
mất hoạt tính (quercetin 7-O-β-D-glucuronid) hoặc giảm hoạt tính (3-O-methyl
quercetin và 4-O-methyl quercetin có hoạt tính ức chế quá trình peroxid yếu hơn
quercetin) [24]. T1/2= 25 giờ. Thải trừ quercetin bị chậm lại khi dùng cùng với chế
độ ăn giàu chất béo [35].
1.1.5. Tác dụng
Quercetin đƣợc chứng minh có những tác dụng phòng và điều trị trong các
bệnh dị ứng, hen suyễn, sốt mùa hè và phát ban, viêm khớp, bệnh tim mạch, biến
chứng bệnh tiểu đƣờng, thoái hóa thần kinh, loãng xƣơng, loét dạ dày tá tràng, viêm
tuyến tiền liệt, nhiễm virus, ung thƣ, gout [35].
1.1.6. Tác dụng không mong muốn
Tác dụng không mong muốn của quercetin dùng theo đƣờng uống bao gồm
các dấu hiệu nhƣ buồn nôn, rất hiếm gặp đau đầu và ngứa nhẹ tại các chi. Quercetin
dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch gây ra tác dụng phụ buồn nôn, nôn, toát mồ hôi, nóng
bừng và khó thở [35].
1.1.7. Liều dùng
-

Chế độ ăn hàng ngày cung cấp 15 đến 40 mg quercetin.

-

Liều lƣợng của quercetin khác nhau tùy thuộc vào tình trạng, sức khỏe bệnh

nhân. Đối với bệnh dị ứng, 250-600 mg mỗi ngày và bệnh phát ban mãn tính, 200400 mg quercetin/ngày chia 3 lần [35].
1.1.8. Một số chế phẩm chứa quercetin trên thị trường
-

Viên nén: Quercetin (GNC) 500 mg

-

Viên nang: Quercetin (Jarrow Formular) 500 mg, Quercetin Phytosome
(Research Thorne) 250 mg.

-

Hỗn dịch uống: Quercetin Nutra DropsTM 1 mg/ml

Từ cấu trúc hóa học của quercetin có thể thấy quercetin là phân tử lớn, nhiều
vòng nên khó đƣợc hấp thu từ ruột vào máu bằng cách khuếch tán thông thƣờng
đồng thời với đặc tính tan kém trong nƣớc nên quercetin khó đƣợc hấp thu qua
4


màng ruột, ít thấm qua màng tế bào và bị chuyển hóa qua gan. Điều này lý giải tại
sao các chế phẩm lƣu hành trên thị trƣờng phải sử dụng một lƣợng lớn hoạt chất
quercetin (500 mg). Với mục đích tăng khả năng hấp thu dẫn đến tăng sinh khả
dụng của quercetin, trong những năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực
hiện theo nhiều hƣớng khác nhau, tập trung vào những dạng bào chế nhƣ liposome,

phytosome, phức hợp cyclodextrin,… nhằm giảm liều sử dụng quercetin mà vẫn đạt
hiệu quả điều trị mong muốn. Công nghệ bào chế hiện đại này đã và đang tạo ra
một dòng sản phẩm từ dƣợc liệu có hiệu quả điều trị cao, giảm tác dụng phụ và tăng
giá trị của thuốc thảo dƣợc. Trên thực tế đã có nhiều chế phẩm chứa phytosome
quercetin lƣu hành với hàm lƣợng hoạt chất giảm tới 1/2 liều dùng so với dạng
quercetin tự do. Đây cũng là một lĩnh vực nghiên cứu cơ bản dựa vào nguồn tài
nguyên phong phú của Việt Nam và có khả năng ứng dụng vào thực tiễn.
1.2. Phytosome
1.2.1. Khái niệm phytosome
Phytosome là phức hợp của hoạt chất có nguồn gốc từ dƣợc liệu chuẩn hóa
gắn với phospholipid ở mức độ phân tử [48].
1.2.2. Thành phần cấu tạo phytosome
Cấu trúc của phytosome gồm 2 phần: hoạt chất và phospholipid.

Hình 1.2. Cấu trúc phytosome [26]


Hoạt chất
Hoạt chất trong phytosome là các hoạt chất đƣợc chiết xuất từ thực vật chủ

yếu là các flavonoid: quercetin, kaemferol, quercretin-3, rhamnoglucosid,
quercetin-3 rhamnosid, …. [46].
5




Phospholipid
Phospholipid có cấu trúc hai phần: một đầu phân cực cholin, và một phần

không phân cực phosphatidyl. Trong phức hợp phytosome, đầu cholin liên kết với
hoạt chất bằng liên kết hydro giữa nhóm phosphat của phospholipid với nhóm
hydroxyl của hoạt chất. Trong khi đó, phần không phân cực phosphatidyl bao bọc
dƣợc chất tạo nên các tiểu phân hình cầu. Với cấu trúc này sẽ giúp hoạt chất tránh
những tác động bất lợi bên ngoài trong quá trình bảo quản và những tác động bên
trong cơ thể [45].
Hai loại phospholipid hay đƣợc sử dụng: lecithin, phosphatidylcholin đậu
nành hydrogen hóa (HSPC). Mỗi loại phospholipid có những ƣu điểm và nhƣợc
điểm riêng. Nguyên liệu lecithin là một hỗn hợp gồm các phospholipid và thành
phần khác do đó có thể ảnh hƣởng tới độ ổn định của phức hợp tạo thành nhƣng giá
thành rẻ là ƣu điểm lớn nhất của phospholipid này. Trong khi đó HSPC có ƣu điểm
là độ tinh khiết cao và tƣơng đối ổn định về mặt hóa học do hạn chế đƣợc các quá
trình peroxyd hóa gốc acid béo chƣa no, từ đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn
chế hiện tƣợng hỏng màng.

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa
1.2.3. Độ ổn định của phytosome
Trong quá trình bảo quản, độ ổn định của phytosome bị ảnh hƣởng bởi các
yếu tố nhƣ môi trƣờng, pH, nhiệt độ,… [8], [42].
-

Về hóa học: Do bao gồm các phospholipid, phức hợp phytosome dễ bị oxy

hóa và thủy phân trong quá trình bảo quản. Quá trình oxy hóa tăng nhanh do sự tác
động của các yếu tố nhƣ pH môi trƣờng, nhiệt độ, ion kim loại, sự tích điện của lớp
phospholipid kép. Sự oxy hóa xảy ra mạnh hơn khi thành phần phytosome có
phospholipid không no. Bảo quản ở nhiệt độ thấp, bảo vệ tránh ánh sáng và oxy

6

môi trƣờng đƣợc cho là làm chậm quá trình oxy hóa, từ đó tăng độ ổn định của
phytosome.
-

Về vật lý: Ổn định vật lý đƣợc đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số

PDI, sự tích điện bề mặt. Trong quá trình bảo quản thƣờng xảy ra sự kết tụ của các
tiểu phân phytosome. Vì vậy để tăng độ ổn định của phức hợp, kéo dài tuổi thọ của
sản phẩm thì phải bảo quản phytosome ở nhiệt độ thấp và thƣờng xuyên kiểm tra
thế Zeta.
1.2.4. Ưu nhược điểm


Ưu điểm [37], [43], [46]

-

Phytosome dễ tan trong cả dung môi thân dầu và thân nƣớc. Do đó tăng khả

năng hấp thu, tăng sinh khả dụng của hoạt chất qua đƣờng uống và qua da.
-

Giảm liều dùng do hoạt chất đƣợc hấp thu tối đa.

-

Hiệu quả nạp thuốc cao.

-

Phosphatidylcholin không chỉ là chất mang thuốc mà còn có khả năng bảo

vệ gan và giá trị dinh dƣỡng.
-

Hoạt chất liên kết với phospholipid bằng liên kết hóa học nên phytosome có

độ ổn định tốt hơn các dạng bào chế khác nhƣ liposome,…
-

Hƣớng các hoạt chất tới mô đích hiệu quả hơn.

-

Bảo vệ dƣợc chất không bị phá hủy bởi dịch tiêu hóa và vi khuẩn đƣờng ruột



Nhược điểm
Các phƣơng pháp bào chế phytosome thƣờng sử dụng dung môi hữu cơ độc

hại nhƣ: methanol, dicloromethan …ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và môi
trƣờng [16], [31], [45], [46].
1.2.5. Phương pháp bào chế phytosome
Phytosome là phức hợp hình thành do sự tƣơng tác giữa phospholipid tự
nhiên hoặc tổng hợp với hoạt chất chiết xuất từ dƣợc liệu trong dung môi kém phân
cực, thƣờng sử dụng các dung môi aprotic nhƣ dioxan, aceton, dicloromethan,
tetrahydrofuran…Tỷ lệ phối hợp hoạt chất với phospholipid tùy thuộc cấu trúc hóa
học của hoạt chất và bản chất của phospholipid sử dụng. Sau khi tạo thành

phytosome, tiến hành phân lập bằng dung môi n-hexan hoặc hydrocarbon béo hoặc
7


phân lập bằng phƣơng pháp đông khô, phun sấy [41], [43], [47]. Hai phƣơng pháp
bào chế phytosome rất hay đƣợc dùng trong nghiên cứu tại phòng thí nghiệm là:
bốc hơi dung môi và kết tủa trong dung môi.
 Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi.
Tiến hành: Phối hợp phospholipid (tổng hợp hoặc tự nhiên) và hoạt chất
polyphenol có nguồn gốc từ dƣợc liệu đƣợc chuẩn hóa với tỷ lệ dao động từ 0,5-2,0
trong môi trƣờng phản ứng là dung môi aprotic nhƣ: dioxan, methylen chlorid,
aceton…Khuấy từ hồi lƣu trong một thời gian thích hợp. Sau khi tạo thành
phytosome, tiến hành phân lập phức hợp bào chế đƣợc bằng cách kết tủa do thay
đổi dung môi khác không hòa tan phức hợp hoặc áp dụng phƣơng pháp phun sấy
[15].
 Phương pháp bốc hơi dung môi:
Tiến hành: Phospholipid, hoạt chất và các thành phần khác đƣợc hòa tan trong
hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp sau đó đƣa vào bình đáy tròn của máy cất quay,
tiến hành khuấy trộn trong một khoảng thời gian thích hợp để hình thành liên kết
trong phức hợp. Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ đƣợc loại khỏi dung dịch
bằng cách bốc hơi, và thu đƣợc lớp màng phytosome. Từ lớp màng phytosome này
có thể hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Bangham
tạo hỗn dịch phytosome thô, hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dƣới
dạng bột khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay [31].
1.2.6. Đánh giá một số đặc tính của phytosome
- Kích thƣớc và phân bố kích thƣớc: Xác định kích thƣớc bởi phƣơng pháp tán
xạ ánh sáng động học (DLS) và phổ tƣơng quan photon (PCS) [46].
- Độ bền vững của phytosome: Đánh giá bằng cách xem xét kích thƣớc, phân bố
kích thƣớc, thế Zeta và cấu trúc của phytosome sau thời gian bảo quản.
- Đánh giá hiệu suất phytosome hoá để xác định tỉ lệ quercetin đã liên kết với

phospholipid tạo thành phức hợp [46].
- Xác định cấu trúc: Dùng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), kính hiển vi
điện tử quét (SEM) [46].
- Quercetin trong phytosome đƣợc định lƣợng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) hoặc quang phổ UV.

8


- Phƣơng pháp đánh giá tƣơng tác giữa hoạt chất và phospholipid trong
phytosome.
Trong các nghiên cứu về phức hợp phytosome, nhiều tác giả đã sử dụng các
phƣơng pháp để đánh giá sự hình thành phức hợp giữa phospholipid và hoạt chất
nhƣ: phƣơng pháp phân tích phổ hồng ngoại (IR), phƣơng pháp nhiệt quét vi sai
(DSC), phƣơng pháp nhiễu xạ tia X, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân.
 Phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Mục đích: Việc phân tích sự thay đổi trên phổ đồ của phytosome, hoạt chất,
phospholipid sẽ xác định đƣợc liên kết mới từ đó chứng minh hình thành liên kết
giữa hoạt chất và phospholipid khi tạo phức hợp [1].
Hạn chế của phƣơng pháp: Không xác định đƣợc vị trí tƣơng đối của các
nhóm chức khác nhau trên một phân tử.
Sau khi bào chế đƣợc phytosome quercetin, Singh D và cộng sự (2012) đã
tiến hành quét phổ IR để đánh giá sự hình thành phức hợp. Dựa trên sự thay đổi
peak hấp thụ của quercetin, phospholipid và phức hợp cho thấy xảy ra tƣơng tác
giữa nhóm hydroxyl và nhóm ceton của quercetin với nhóm phân cực của
phosphatidylcholin đậu tƣơng [16]. Nhƣng trong quercetin cũng nhƣ các flavonoid
có nhiều nhóm OH. Phổ IR chỉ xác định đƣợc có liên kết hydro của nhóm hydroxyl
không xác định đƣợc chính xác nhóm nào trong công thức cấu tạo dƣợc chất tham
gia tạo liên kết vì vậy muốn xác định vị trí nhóm OH cần phải tiến hành quét phổ
cộng hƣởng từ hạt nhân.

A
B

C

Hình 1.4. Phổ IR. (A) phospholipid, (B) Quercetin, (C) Quercetin-phospolipid [16]

9




Phổ cộng hưởng từ hạt nhân [40]
Mục đích: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân có ý nghĩa quan trọng trong việc xác

định cấu tạo các phân tử phức tạp nhƣ các hợp chất thiên nhiên. Phƣơng pháp phổ
biến đƣợc sử dụng là 1H-NMR và phổ 13C-NMR
Phƣơng pháp này hỗ trợ cho phƣơng pháp phổ IR trong xác định vị trí của
nhóm chức liên kết.


Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)
Mục đích: Từ những phân tích về sự thay đổi trên phổ DSC, ta có thể chứng

minh đƣợc sau khi tạo thành phức hợp, có sự thay đổi về nhiệt chuyển pha của
phytosome, về mức độ tinh thể của hoạt chất cũng nhƣ trạng thái tồn tại của phức
hợp [18].
Hạn chế của phƣơng pháp: DSC dựa trên nguyên lý do sự thay đổi nhiệt
độ và nhiệt lƣợng tỏa ra từ mẫu khi bị đốt nóng và so sánh với thông tin từ mẫu
chuẩn. Nếu liên kết mới trong mẫu thử không tạo ra sự thay đổi nhiệt nhiều so với

mẫu chuẩn thì phổ các mẫu giống nhau.
Trên đồ thị DSC, Yunmei Song và cộng sự (2007) đã chỉ ra khi tạo thành
phức hợp silybin - phospholipid các peak thu nhiệt của sylibin (136,5oC) và PC
(229,6oC) đã biến mất, thay vào đó là một peak thu nhiệt mới (28,80C). Chứng tỏ có
sự tƣơng tác giữa dƣợc chất và phospholipid làm giảm mức độ tinh thể của silybin
trong phức hợp so với silybin tự do. Trong hỗn hợp vật lý PC-silybin có hai đỉnh
thu nhiệt là 28,80C và 136,50C. Đỉnh 28,80C xuất hiện trong hỗn hợp vật lý tƣơng
ứng peak thu nhiệt trong phức hợp là do hình thành một phần phức hợp trong quá
trình nóng chảy khi đun nóng [52].

10


Hình 1.5. Phổ DSC. a) phospholipid, b)silybin, c)phức hợp silybin-PC, c) hỗn hợp
silybin-PC
 Phương pháp nhiễu xạ tia X
Mục đích: Phổ nhiễu xạ tia X đƣợc sử dụng để phân tích sự thay đổi về cấu
trúc tinh thể của phytosome quercetin khi so sánh với giản đồ tia X của hoạt chất
ban đầu quercetin. Đối với giản đồ tia X của một chất ở dạng tinh thể có nhiều pic
hẹp, còn với dạng vô định hình có pic rộng [51].
Hạn chế của phƣơng pháp: Phổ nhiễu xạ tia X thể hiện những biến đổi về
cách sắp xếp của những nguyên tử trong không gian. Tuy nhiên nếu khung nguyên
tử mà không biến đổi nhiều chỉ khác đi một vài liên kết thì phổ đồ thu đƣợc giống
nhau.
Singh D và cộng sự (2012) sau khi bào chế phức hợp quercetin:
phosphatidylcholin đậu tƣơng theo tỉ lệ mol 1:1 đã chứng minh sự tạo thành phức
hợp bằng đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu quercetin, phosphatidylcholin đậu tƣơng
và phức hợp. Trên giản đồ nhiễu xạ, quercetin tự do có nhiều đỉnh nhiễu xạ do tồn
tại dạng tinh thể, trong mẫu phức hợp các đỉnh nhiễu xạ của quercetin đã biến mất
điều đó chứng tỏ quercetin đã chuyển từ dạng kết tinh sang dạng vô định hình. Đây

là cơ sở để chứng minh khả năng cải thiện độ tan quercetin của phức hợp, từ đó
tăng khả năng hấp thu và sinh khả dụng [16].

11


A

B

C

Hình 1.6. Phổ nhiễu xạ tia X: A) Quercetin, B)phức hợp quercetin-phospholipid, C)
phospolipid
1.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa
Phytosome quercetin đƣợc hình thành do tạo liên kết hóa học giữa hoạt chất
và phospholipid. Đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin có bị thay đổi do quá
trình hình thành liên kết là cần thiết. Một trong những hoạt tính sinh học quan trọng
của quercetin là hoạt tính chống oxy hóa. Để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của
phytosome quercetin có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau: đo khả năng
hấp thu gốc oxy (oxygen radical absorbance capacity: ORAC), hoạt tính trung hòa
gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) hoặc xác định khả năng peroxid
hóa lipid …
1.3.1. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH
DPPH là gốc tự do bền vững trong dung dịch methanol bão hòa, hợp chất
này đƣợc sử dụng nhiều trong thử nghiệm trung hòa gốc tự do của các hợp chất
chống oxy hóa. Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch DPPH trong methanol,
nếu các chất có khả năng chống các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cƣờng độ
hấp thụ ánh sáng của gốc tự do DPPH. Khả năng chống oxy hóa đƣợc đánh giá
thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với chất đối chứng,

khi đo ở bƣớc sóng 517 nm [37].

12


Singh D và cộng sự (2012) sau khi bào chế phức hợp quercetin:
phosphatidylcholin đậu tƣơng theo tỉ lệ mol 1:1 đã chứng minh rằng không có sự
khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa phức hợp quercetin và quercetin tự do trong
thử nghiệm in vitro chống oxy hóa (hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH). Sự hình
thành phức hợp không làm thay đổi hoạt tính sinh học của hoạt chất [16]
Dƣơng Thị Hảo (2016) [6], thực hiện nghiên cứu về thực vật, thành phần
hóa học và tác dụng chống oxy hóa của Thạch châu (Pyrenaria sp.), họ Chè
(Theaceae). Đề tài đã đánh giá đƣợc tác dụng chống oxy hóa trên test in vitro và
mô hình in vivo của các phân đoạn cao chiết dƣợc liệu cũng nhƣ các hợp chất phân
lập đƣợc. Nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp trung hòa gốc tự do DPPH, chỉ số IC50
(nồng độ trung hòa đƣợc 50% gốc tự do của DPPH) đƣợc sử dụng để so sánh hoạt
tính chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu với quercetin.
P. Yuvaraj và cộng sự (2013) [53] nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các
acid phenolic chiết xuất từ vỏ cây Tra lâm bồ (Thespesia populnea). Kết quả nghiên
cứu khả năng chống oxy hóa in vitro cho thấy ở nồng độ thấp 2-10 µg/ml, các acid
phenolic có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH với giá trị IC50=16,53 ± 0,12
µg/ml; chất đối chứng acid ascorbic IC50=18,59 ± 0,72 µg/ml.
I.M.C. Brighente và cộng sự (2007) nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và
hàm lƣợng phenolic toàn phần của một số loài thực vật ở Brazil. Nghiên cứu thực
hiện trên sáu loài thực vật. Hoạt tính chống oxy hóa đƣợc đánh giá dựa trên khả
năng trung hòa gốc tự do DPPH. Dịch chiết các phân có khả năng trung hòa gốc tự
do DPPH một các đáng kể với chỉ số (IC50 < 10,0 µg/ml), chất đối chứng là acid
ascorbic (IC50 = 8,4 µg/ml) và acid gallic (IC50 = 2,6 µg/ml). Hoạt chất có hoạt tính
oxy hóa mạnh là taxifolin, quercetin và luteolin [30].
1.3.2. Xác định khả năng ức chế peroxid hóa lipid

Quá trình peroxid hóa lipid là sự phân hủy oxy của lipid có một nối đôi trong
phân tử. Sản phẩm của quá trình trên là malonyl dialdehyd (MDA), 4hydroxynonenal (4-HNE),...Bằng việc xác định hàm lƣợng các sản phẩm này cho
biết khả năng ức chế peroxid hóa lipid của một chất. Phƣơng pháp hay sử dụng là
định lƣợng MDA, ƣu điểm của phƣơng pháp này là cho kết quả nhanh [21], [49].
13


P. Yuvaraj và cộng sự (2013) [53] nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của acid
phenolic chiết xuất từ vỏ cây Tra lâm bồ (Thespesia populnea). Kết quả thử nghiệm
khả năng ức chế peroxid hóa lipid thông qua đo hàm lƣợng MDA. Các acid
phenolic ức chế đáng kể quá trình peroxid hóa lipid và có giá trị IC50 =150,27 ±
12,56 mg/ml; IC50 catechin là 180,34 ± 13,42 mg/ml.
Trƣơng Thị Mỹ Chi và cộng sự (2010) tiến hành nghiên cứu tác dụng chống
oxy hóa in vitro và in vivo của một số loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và
nấm Vân chi (Trametes versicolor). Trong thử nghiệm xác định khả năng ức chế
peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát (10;
50; 100; 500; 1000; 1500; 2000 µg/ml) đƣợc cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng
thể não và thêm đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC
trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy
dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ
100oC. Làm lạnh và tiến hành đo quang ở bƣớc sóng λ=532 nm. Trolox
(Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu.
Dựa vào IC50 trong thử nghiệm DPPH và thử nghiệm MDA, sơ bộ kết luận hoạt
tính chống oxy hóa in vitro của nấm Linh chi mạnh hơn nấm Vân chi [5].
1.4. Một số nghiên cứu về phytosome
1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới
Malay K Das, Bhupen Kalita nghiên cứu bào chế phytosome rutin với
phospholipid với các tỷ lệ (0,5:1; 0,75:1; 1:1; 1:0,75; 1:0,5) bằng phƣơng pháp bốc
hơi dung môi, dung môi đƣợc sử dụng là methanol và dichloromethan. Tất cả các
phức hợp có độ tan tốt hơn Rutin tinh khiết. Hệ số phân bố dầu nƣớc của

phytosome tỉ lệ (1:1) là 3,11± 0,08. Kết quả chụp TEM quan sát thấy dạng túi rời
rạc. Phổ FT-IR, DSC, và XRD cho thấy hình thành liên kết trong phức hợp phytophospholipid. Nghiên cứu XRD chứng minh việc hình thành phức hợp làm giảm
dạng kết tinh, phức hợp tỉ lệ (1:1) lƣợng kết tinh ít nhất. Nghiên cứu tính thấm qua
da ex vivo cho thấy khả năng thấm qua da của các phức hợp (33 ± 1,33%) cao hơn
rutin tinh khiết (13 ± 0,87%). Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra phức hợp phytosome
làm tăng hấp thu qua da dẫn đến tăng sinh khả dụng và tăng hiệu quả điều trị [31].
14