KHẢO sát mức độ THUỶ PHÂN PHOSPHORUS của DỊCH CHIẾT ENZYME TIÊU HOÁ cá TRA kết hợp với ENZYME PHYTASE lên THỨC ăn NUÔI cá TRA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
------------o0o------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ THUỶ PHÂN
PHOSPHORUS CỦA DỊCH CHIẾT ENZYME
TIÊU HOÁ CÁ TRA KẾT HỢP VỚI ENZYME
PHYTASE LÊN THỨC ĂN NUÔI CÁ TRA.

GVHD : Ths. Nguyễn Văn Nguyện
CN. Phạm Duy Hải
SVTH : Võ Thị Tố Nga
MSSV : 104110130

Tp.HCM, tháng 10 năm 2008
i
i


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn hoàn chỉnh như hôm nay em vô cùng biết ơn và gửi lời cảm ơn
chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh
cùng thầy cô khoa công nghệ thực phẩm trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ
Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt luận văn của mình.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn ThS. Nguyễn Văn Nguyện và
CN.Phạm Duy Hải đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn và cung cấp kiến thức để em có thể hoàn thành
luận văn của mình như thời gian đã quy định.
Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong Trung tâm công nghệ sau thu

hoạch của Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em
được thực tập. Các anh chị đã hướng dẫn tận tình để em có thể hoàn thành luận văn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô và anh chị trong trung tâm
công nghệ sau thu hoạch đã quan tâm giúp đỡ em trong thời gian làm luận văn. Em xin kính chúc
quý thầy cô và và toàn thể trung tâm công nghệ sau thu hoạch dồi dào sức khoẻ, công tác tốt để
tiếp tục dìu dắt các thế hệ trẻ sau này.
Dù em đã có nhiều cố gắng nhưng trong quá trình hoàn thành luận văn vẫn còn nhiều hạn
chế nhất định, mong quý thầy cô và các bạn thông cảm.

ii


TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN

- Tìm hiểu dịch chiết enzyme tiêu hóa của cá Tra.
-

Khảo sát mức độ thuỷ phân Phosphorus của dịch chiết enzyme lên nguyên liệu (bột cá
55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24%
protein thô, 32% protein thô).

-

Đánh giá mức độ thuỷ phân Phosphorus của enzyme phytase thương mại với các nồng độ
0,015U, 0,03U, 0,06U, 0,09U, 0,12U lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu
nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein
thô).

-

Đánh giá mức độ thuỷ phân Phosphorus của enzyme phytase thương mại kết hợp với dịch
chiết enzyme lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn
nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).

-

Đánh giá hiệu quả quá trình thuỷ phân phosphorus của dịch chiết enzyme kết hợp với
enzyme phytase thương mại.

-

Xác định nồng độ enzyme phytase thương mại để bổ sung vào thức ăn nuôi cá tra.

iii


MỤC LỤC
Đề mục

Trang

Trang bìa ............................................................................................................................ i
Nhiệm vụ đồ án....................................................................................................................
Lời cảm ơn......................................................................................................................... ii
Tóm tắt nội dung đồ án ..................................................................................................... iii
Mục lục............................................................................................................................. iv
Danh sách hình vẽ.............................................................................................................. v
Danh sách bảng biểu ......................................................................................................... vi
Dach sách các thừ viết tắt................................................................................................. vii

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU.............................................................................................. 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
2.1. Vai trò của enzyme khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi .......................................... 2
2.1.1. Cơ chế tác động của enzyme............................................................................ 2
2.1.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của lợn, cá, gia cầm ........................... 2
2.1.2.1. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của gia cầm.................................. 2
2.1.2.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của lợn......................................... 3
2.1.2.3. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của cá .......................................... 4
2.1.3. Giảm mùi hôi và cải thiện môi trường chăn nuôi.............................................. 4
2.2. Sơ lược về axit phytic và enzyme phytase.............................................................. 5
2.2.1. Sơ lược về axit phytic ...................................................................................... 5
2.2.1.1. Định nghĩa ................................................................................................. 5
2.2.1.2. Cấu trúc hoá học của axit phytic ................................................................ 5
2.2.1.3. Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên............................. 6
2.2.1.4. Chức năng sinh lý của axit phytic............................................................... 6
2.2.1.5. Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic ............................................... 7
2.2.2. Sơ lược về enzyme phytase.............................................................................. 8
2.2.2.1. Định nghĩa ................................................................................................. 8
2.2.2.2. Đặc điểm cấu tạo của phytase .................................................................... 9
2.2.2.3. Sự phân bố của phytase trong tự nhiên ..................................................... 11
iv-1


2.2.2.4. Các hoạt tính ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase .................................. 14
2.2.2.5. Tính đặc hiệu cơ chất và các thông số động học ....................................... 18
2.2.2.6. Trung tâm hoạt động và cơ chế tác dụng .................................................. 19
2.2.2.7. Động học và sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân của axit phytic 20
2.2.2.8. Ứng dụng của enzyme phytase................................................................. 23
2.3. Sơ lược về cá Tra ................................................................................................ 24
2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiêu hoá ................................................. 24

2.3.2. Nhu cầu phosphorus trong khẩu phần thức ăn của cá ..................................... 25
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 27
3.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 27
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................ 27
3.1.2. Thiết bị nghiên cứu........................................................................................ 28
3.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28
3.2.1. Cơ chế phản ứng của enzyme phytase............................................................ 28
3.2.2. Qui trình nghiên cứu khả năng thuỷ phân của enzyme phytase....................... 29
3.2.3. Cách tiến hành............................................................................................... 29
3.2.4. Bố trí thí nghiệm............................................................................................ 30
3.2.5. Phương pháp định lượng phosphorus tổng ..................................................... 32
3.2.6. Phương pháp định lượng phosphorus vô cơ.................................................... 33
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................................... 36
4.1. Khi bổ sung dịch chiết enzyme thô trong nội tạng cá với giai đoạn cá
50gr, 300gr, 600gr .................................................................................................. 36
4.2. Khi bổ sung enzyme phytase thương mại............................................................. 38
4.3. Kết hợp giữa enzyme phytase thương mại và dịch chiết enzyme thô.................... 41
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 45
Tài liệu tham khảo .............................................................................................................. I
Phụ lục ..............................................................................................................................II

iv-2


DANH SÁCH HÌNH VẼ

Đề mục

Trang

Hình 2.1. Mô hình cấu trúc axit phytic...................................................................................6
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của phytate................................................................................6
Hình 2.3. Cấu trúc toàn bộ của phytase từ vi khuẩn B. amyloliquefaciencl...........................9
Hình 2.4. Các con đường thuỷ phân axit phytic bởi phytase................................................22
Hình 3.1. Cơ chế phản ứng của enzyme phytase..................................................................28
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu khả năng thuỷ phân của enzyme phytase.................29
Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn mức độ thuỷ phân phosphorus của dịch chiết enzyme thô lên
nguyên liệu (bột cá 55%, bột mì, bã đậu nành, cám gạo)....................................................37
Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mức độ thuỷ phân phosphorus của enzyme thương mại lên
nguyên liệu (bột cá 55%, bột mì, bã đậu nành, cám gạo).....................................................40
Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn mức độ thuỷ phân phosphorus của enzyme thương mại lên thức
ăn (Cargill 2mm, Lam Sơn 2mm, TTCN 2mm)...................................................................40
Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn mức độ thuỷ phân phosphorus của enzyme phytase thương mại
kết hợp với dịch chiết enzyme thô của cá Tra lên nguyên liệu (bột cá 55%, bột mì, bã đậu
nành, cám gạo).....................................................................................................................43
Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mức độ thuỷ phân phosphorus của enzyme phytase thương mại
kết hợp với dịch chiết enzyme thô của cá Tra lên thức ăn (Cargill 10mm, Lam Sơn 10mm,
TTCN 10mm). ......................................................................................................................43

v


DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Đề mục

Trang

Bảng 2.1. Tóm tắt các phytase thu được từ một số nguồn khác nhau. .................................13
Bảng 2.2. Các đặc tính sinh lý, sinh hoá của phytase từ các phytase từ các nguồn khác

nhau. ....................................................................................................................................16
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá mức độ thuỷ phân phosphorus khi bổ sung dịch
chiết enzyme thô lên nguyên liệu và thức ăn........................................................................30
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá mức độ thuỷ phân phosphorus khi bổ sung enzyme
phytase thương mại lên nguyên liệu và thức ăn ...................................................................31
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá mức độ thuỷ phân phosphorus khi bổ sung enzyme
phytase kết hợp với dịch chiết enzyme thô lên nguyên liệu và thức ăn ...............................32
Bảng 3.4. Dựng đường chuẩn để xác định phosphorus tổng ...............................................33
Bảng 3.5. Dựng đường chuẩn để xác định phosphorus vô cơ ..............................................34
Bảng 4.1. Bảng kết quả mức độ thuỷ phân phosphorus của dịch chiết enzyme thô trong nội
tạng cá Tra với giai đoạn cá 50gr, 300gr, 600gr lên nguyên liệu và thức ăn ......................36
Bảng 4.2. Bảng kết quả mức độ thuỷ phân phosphorus của enzyme phytase thương mại
lên nguyên liệu và thức ăn....................................................................................................39
Bảng 4.3. Bảng kết quả mức độ thuỷ phân phosphorus của enzyme phytase thương mại kết
hợp với dịch chiết enzyme thô lên nguyên liệu và thức ăn. .................................................42

vi


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
-

LS: Thức ăn của công ty Lam Sơn.

-

Pi: Hàm lượng phosphorus vô cơ.

-

NSP (Non – starch polysaccharide): Polysaccharide không phải tinh bột.

-

TA: Thức ăn.

-

TTCN: Thức ăn của Trung tâm công nghệ sau thu hoạch.

VII


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

Phosphorus là khoáng chất đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng thức ăn vật nuôi.
Phosphorus và cũng như các nguyên tố khoáng cần thiết khác được cung cấp chủ yếu qua con
đường thức ăn. Đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc
và các loại hạt đều có chứa sẵn Phosphorus. Tuy nhiên, Phosphorus có chứa trong nguyên liệu
hạt này có tới 80% nằm dưới dạng phân tử phytate hoặc axit phytic. Phosphorus tồn tại ở
dạng này rất khó tiêu hoá đối với các loài động vật có dạ dày đơn như gia cầm, lợn, cá …
Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như Fe3+, Mg2+, Ca2+, Zn2+… sẽ ngăn cản
khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu
hoá thức ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng.
Ngoài ra do không hấp thu được lượng Phosphorus có sẵn trong axit phytic nên thức
ăn cho động vật dạ dày đơn (ví dụ: cá, gia cầm, heo…) thường phải bổ sung thêm Phosphorus

dẫn đến lượng Phosphorus thừa không được tiêu hoá bị thải ra ngoài theo phân của chúng đã
làm ô nhiễm môi trường gây nên hiện tượng tảo nở hoa bùng phát, ảnh hưởng đến sự phát
triển của các loài thuỷ sản…
Chính vì vậy, để tận dụng nguồn Phosphorus có sẵn trong thành phần của các nguyên
liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoài
môi trường thì việc các hợp chất Phosphorus ở dạng khó phân giải thành này thành các chất
đơn giản và dễ phân giải hơn là rất quan trọng. Để đạt được điều này, người ta đã sử dụng
phytase để thuỷ phân axit phytic.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ thuỷ phân của dịch
chiết enzyme tiêu hoá cá tra kết hợp với enzyme phytase trên thức ăn nuôi cá tra để nâng cao
hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra. Bằng cách ứng dựng phương pháp nghiên cứu in vitro –
là phương pháp phân tích hiện nay đang được quan tâm đề xuất đánh giá khả năng tiêu hoá
của thức ăn thủy sản là kỹ thuật enzym tiêu hoá in vitro bởi vì kỹ thuật đưa ra ý nghĩa làm
giảm yêu cầu về chi phí và thời gian nhằm đánh giá khả năng tiêu hoá của thức ăn.

SVTH: Võ Thị Tố Nga

1


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1.

Vai trò của enzym khi bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi [3, 30]

2.1.1. Cơ chế tác động của enzyme

Enzyme được sử dụng như là thức ăn bổ sung được gọi là enzyme ngoại sinh để phân
biệt với enzyme nội sinh - là những enzyme sinh ra trong cơ thể. Enzyme ngoại sinh làm tăng
tỷ lệ tiêu hoá thức ăn theo hai cơ chế:
- Một là, kết hợp với enzyme nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất có kích
thước đủ nhỏ để hấp thụ. Như vậy việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ
cho enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là cần thiết.
- Hai là, enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá thức
ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá cản trở sự hấp thu thức ăn. Một vài hợp
chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột.
Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non – starch
polysaccharides – NSP) gây ra hiện tượng này. Động vật mới sinh ra, đặc biệt là gia cầm rất
nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt vốn được sinh ra trong quá trình tiêu hoá.
Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng
những chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng β –
glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được
protein chứa trong tế bào chất, vì vậy để phân giải protein trong lớp tế bào chất này phải cần
thêm cả enzyme cellulase và pentosanase.
2.1.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của lợn, cá, gia cầm
2.1.2.1. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của gia cầm [30]
Gà broiler nhạy cảm đối với các chất kháng dinh dưỡng, do vậy để đáp ứng tốt đối với
việc bổ sung enzyme phù hợp vào khẩu phần (β – glucanase đối với khẩu phần lúa mạch,
pentosanase đối với khẩu phần lúa mì, phytase đối với phytate). Bổ sung đa enzyme có lợi
hơn bổ sung enzyme đơn.
Hàm lượng enzyme bổ sung tuỳ thuộc vào tuổi và thành phần khẩu phần. Theo
Schoner et al., (1993), gà broiler 44 ngày tuổi yêu cầu 570 U phytase để giải phóng 1g
Phosphorus; gà 70 ngày tuổi số lượng enzym yêu cầu là 850 U.
SVTH: Võ Thị Tố Nga

2

Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Gà mái đẻ có nhu cầu bổ sung phytase kém hơn gà broiler tuy nhiên cũng có những
tác dụng như tăng sản lượng trứng và hiệu quả chuyển hoá thức ăn thì cũng thấy rõ ở gà mái
đẻ [3].
2.1.2.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn lợn
So với gia cầm, hiệu quả của enzyme thức ăn trong khẩu phần lợn giữa các nghiên cứu
không thống nhất [3].
Một tổng kết tập hợp kết quả 23 thí nghiệm bổ sung enzyme cho lợn tiến hành từ 1978
đến 1993 đã thấy rằng chỉ có 4 thí nghiệm trên lợn con là có kết quả rõ rệt (Officer, 1995);
còn đối với lợn sinh trưởng- vỗ béo thì kết quả không rõ rệt (Chu et al., 1998). NSP hoà tan
không làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của lợn như ở gia cầm. Thacker et al. (1998) cho
biết rằng sự chuyển hoá thức ăn và tăng trọng của lợn 20 kg ăn khẩu phần đại mạch giàu
glucan không có sự khác nhau đáng kể nào khi bổ sung - glucanase vào khẩu phần thức ăn.
Không giống như gia cầm, pentosanase không làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn con.
Bổ sung pentosanase vào khẩu phần lúa mạch không cải thiện được sự tăng trưởng của lợn
20-25kg (Thacker et al. 1991). Bổ sung -glucanase cho lợn 80kg làm tăng tỷ lệ tiêu hoá chất
khô và protein nhưng sự cải thiện này quá nhỏ để nâng cao hiệu quả chuyển hoá thức ăn và
tăng trọng.
Tuy nhiên, đối với lợn việc bổ sung phytase thì có hiệu quả rõ rệt, phytase đã làm tăng
tích luỹ khoáng và khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, giảm được chi phí thức ăn.
Cần chú ý rằng không có mức tiêu chuẩn bổ sung phytase cho tất cả các khẩu phần,
mức phytase bổ sung phụ thuộc vào loài lợn và loại khẩu phần. Yi et al. (1996) cho thấy rằng
số lượng phytase để giải phóng 1g Phosphorus khác nhau từ 785 U (đối với khẩu phần ngô-đỗ
tương) đến 1146 U (đối với khẩu phần đỗ tương tinh chế). Mặt khác đối với Hoppe et al.
(1993) cũng cho rằng với khẩu phần ngô- lúa mạch-đỗ tương cho lợn con thì để giải phóng 1g
Phosphorus chỉ cần 380U. Ngoài ra các nguồn phytase khác nhau thì hoạt tính enzyme cũng

khác nhau (hoạt tính enzyme phytase vi sinh vật lớn hơn phytase lúa mì và làm tăng khả năng
hấp thụ Phosphorus, sự tích luỹ Canxi, Nitơ và giảm Phosphorus thải tiết ở phân). Hiệu quả
của phytase còn chịu sự chi phối của khẩu phần, số bữa ăn, lượng thức ăn cho ăn cũng như
chức năng sinh lý của lợn (bổ sung cùng một lượng phytase vào một khẩu phần thì hiệu quả
nhất là đối với lợn nái tiết sữa sau đến lợn sinh trưởng-vỗ béo, lợn con và thấp nhất là lợn
chửa giữa kỳ) [3].
SVTH: Võ Thị Tố Nga

3


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

2.1.2.3. Bổ sung enzyme vào thức ăn của cá
Trong những năm gần đây nguồn protein động vật như bột cá ngày càng đắt đỏ cho
nên protein thực vật đã được bổ sung vào trong các khẩu phần của cá. Tuy nhiên các nguồn
protein thực vật thì nhiều xơ và chất kháng dinh dưỡng như axit phytic, chất ức chế trypsin,
lecitins... Vì vậy vai trò của enzyme ngoại sinh trong khẩu phần các loài thuỷ sản nuôi ngày
càng quan trọng.
Tuy nhiên nhu cầu bổ sung enzyme của cá khác nhau thì khác nhau. Nghiên cứu của
Carter et al. 1992 với α-amylase trên cá hồi Atlantic (Salmon salar) không thấy có ảnh hưởng
đến hiệu quả chuyển hoá thức ăn. Tương tự Renitz (1983) cũng thấy rằng bổ sung enzyme
phân giải protein trong khẩu phần cá hồi rainbow trout không cải thiện được sự tăng trưởng
và hiệu quả chuyển hoá thức ăn. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu trên cá hồi của
Gorskova và Yu- Dvinen (1984) và của Carter et al. (1994) thì lại thấy có những cải thiện về
khả năng tiêu hoá thức ăn của cá khi bổ sung enzyme. Nghiên cứu của Ye et al: bổ sung vào
khẩu phần cá chép một hỗn hợp đa enzyme với liều 5 - 10g/kg đã làm cho tốc độ tăng trưởng
của cá tăng hơn 12,3 - 27,5% so với đối chứng.

Đối với cá cũng như các loài động vật dạ dày đơn, phytate là một chất kháng dinh
dưỡng. Enzyme phytase có tác dụng giải phóng Phosphorus, cải thiện tỷ lệ tiêu hoá của
Phosphorus (1000 U phytase/kg thức ăn của cá hồi rainbow trout làm tăng tỷ lệ tiêu hoá
Phosphorus từ 58,6 lên 68,1% Lunari et al. 1998). Nhu cầu bổ sung phytase cũng phụ thuộc
vào loài cá, khối lượng cá và khẩu phần.
2.1.3. Giảm mùi hôi và cải thiện môi trường chăn nuôi [29]
Chất thải chăn nuôi có khả năng gây ô nhiễm môi trường không khí, đất, nước và đặc
biệt là tầng mặt nước. Ở nước ta, tình trạng này có phần nghiêm trọng do nơi chăn nuôi
thường nằm gần hoặc trong khu dân cư, đặc biệt là khi phần lớn các giếng cung cấp nước sinh
hoạt lại khai thác nước ở tầng nước mặt bị ô nhiễm.
Phosphorus thải ra trong phân của vật nuôi là chất gây ô nhiễm đất và nước ngầm.
Phytase có khả năng làm giảm 30 – 50% lượng phosphorus thải ra môi trường do nó giúp làm
giảm lượng Phosphorus bổ sung và hấp thu tối đa lượng Phosphorus sẵn có trong nguyên liệu.
Phytase cũng giúp giải phóng đạm và axit amin, khiến chúng được tiêu hoá và hấp thu tốt
hơn, qua đó làm giảm lượng thải nitơ và lưu huỳnh nên làm giảm mùi hôi và ô nhiễm nguồn
nước.
SVTH: Võ Thị Tố Nga

4


Luận văn tốt nghiệp

2.2.

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Sơ lược về axit phytic và enzym phytase

2.2.1. Sơ lược về axit phytic

2.2.1.1.

Định nghĩa

Axit phytic là axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc phosphate, tồn tại chủ yếu
trong hạt của các hạt ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Người ta đã xác định được rằng axit phytic
giữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loại
hạt trên.
Axit phytic công thức phân tử C6H18O24P6 và phân tử lượng là 660,04. Danh pháp
quốc tế của axit phytic được gọi là myo – inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen phosphate.
Thực tế, axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại có hoá trị I, II (thường là
K, Mg, Ca). Các muối kim loại này gọi là phytate và chúng được xem như là kho dự trữ
Phosphorus lớn trong các hạt thực vật.
2.2.1.2.

Cấu trúc hoá học của axit phytic

Có nhiều nghiên cứu về mô hình cấu trúc phân tử của axit phytic nhưng các nghiên
cứu này lại đưa đến những kết luận rất khác nhau. Trong số các nghiên cứu đó có hai nghiên
cứu tiêu biểu của hai nhóm chuyên gia khác nhau được biết đến nhiều hơn cả. Đó là nhóm
của Johnson & đtg nghiên cứu cấu trúc axit phytic bằng phương pháp cộng hưởng điện từ từ
hạt nhân 31P (31P – NMR) và nhóm của Blank nghiên cứu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X.
Tuy nhiên hai nhóm nghiên cứu này lại đưa ra hai kết luận trái ngược nhau. Theo Jonhson thì
trong cấu trúc của phân tử axit phytic có một gốc phosphate ở vị trí số 2 (gốc phosphate gắn
với nguyên tử C số 2 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn các gốc phosphate ở vị trí khác thì
có hướng nghiêng một góc so với phương thẳng đứng). Ngược lại, kết luận của tác giả Blank
lại cho rằng các gốc phosphate 1,3,4,5 và 6 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn gốc
phosphate nằm ở vị trí số 2 lại nghiêng theo gốc 1/4. Tuy nhiên, kết luận về cấu trúc phân tử
của axit phytic theo phương pháp Johnson được sự tán đồng hơn.

SVTH: Võ Thị Tố Nga

5


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Hình 2.1: Mô hình cấu trúc axit phytic.

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của phytate

2.2.1.3. Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên
Axit phytic thường tồn tại ở dạng muối của các ion kim loại có hoá trị một hay nhiều
hoặc có thể là hỗn hợp của chúng. Chẳng hạn như hỗn hợp muối Kali – Magiê trong gạo, hỗn
hợp Canxi – Magiê – Kali trong các hạt đậu tương. Các muối này thường tập trung ở một số
vùng nhất định trong các hạt thực vật như ngũ cốc, đậu đỗ. Axít phytic được tích luỹ dần
trong hạt từ khi hạt còn non đến khi hạt trưởng thành, trong suốt quá trình chín cùng với các
chất dự trữ khác trong hạt như tinh bột, lipid… Tuy nhiên, mức độ tập trung của axit phytic ở
các hạt thực vật khác nhau là không giống nhau. Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axit
phytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic được tích
luỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng. Nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm như
lúa, lúa mì… thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytate mà lượng
phytate lại được tìm thấy chủ yếu ở phôi và lớp tế bào hạt phấn. Ngược lại, như Ferguson đã
chứng minh ở cây hai lá mầm thì lượng phytate chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũ
chiếm 99% và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi hay mầm của hạt. Hàm lượng phytate cao
nhất ở hạt ngũ cốc được tìm thấy ở ngô (0,83-2,22%) và các hạt đậu là (5,92-9,1%).
2.2.1.4. Chức năng sinh lý của axit phytic
Phosphorus là một thành phần cấu tạo nên phân tử axit phytic chính vì vậy axit phytic

và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ Phosphorus khá dồi dào có
thể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể. Ngoài ra axit phytic còn là một nguồn
dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào).
Đối với các hạt thực vật, axit phytic cũng có những ảnh hưởng nhất định đến đặc tính sinh lý
của hạt. Nó tác động đến trạng thái ngủ nghỉ của hạt do nó chống lại sự oxy hoá tự nhiên

SVTH: Võ Thị Tố Nga

6


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

(chống lại sự hô hấp) trong quá trình ngủ nghỉ của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm sự phát
triển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này.
Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp của
inositol phosphate trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò của
inositol-triphosphate. Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớn
đến sự biến đổi chức năng của tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật. Bên cạnh những
tác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể có những chức năng
chưa biết khác
2.2.1.5. Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic
Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứng
kháng dinh dưỡng. Hiệu ứng này tạo nên do cấu trúc bất thường của axit phytic. Khi phân tử
axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích
âm 12. Vì vậy, chúng có nhiều khả năng thích hợp với các ion dương hoá trị I, II, III hoặc
hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, rất khó tiêu hoá. Sự hình
thành các hợp chất vô cơ không tan trong đường ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất

của cơ thể động vật. Bởi vì axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như: Fe3+, Mg2+,
Ca2+, Zn2+… sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không
no làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật. Như vậy, yếu tố này làm giảm lượng
khoáng cần thiết được đưa vào cơ thể động vật qua con đường thức ăn mà lẽ ra cơ thể động
vật có thể hấp thu được, do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của nguồn thức ăn.
Chính vì những nguyên nhân trên mà axit phytic được coi là yếu tố kháng dinh dưỡng
ở động vật, đặc biệt là các động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn, và cá. Với một số
nguyên tố vi lượng, ví dụ như Zn thì giá trị dinh dưỡng của nó chịu ảnh hưởng rất lớn bởi
axit phytic. Một vài thí nghiệm đã cho thấy việc bổ sung dần dần axit phytic vào trong khẩu
phần thức ăn của vật nuôi đã gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ Zn2+ của cơ thể (cơ thể không
hấp thụ Zn2+) và tốc độ tăng trưởng trọng lượng của động vật thí nghiệm một cách rõ rệt.
Axit phytic có khả năng kết hợp với protein tạo thành phức chất phytate – protein
trong một khoảng pH rất rộng. Ở pH rất thấp, axit phytic mang điện tích âm lớn do sự phân
ly của toàn bộ các gốc phosphate trong phân tử. Trong điều kiện này, axit phytic có thể làm
hạn chế khả năng hoà tan của các protein bởi vì có sự liên kết ion giữa các gốc phosphate cơ
bản với các gốc tự do của amino axit (lysine, histidine, arginine). Trong môi trường có tính
SVTH: Võ Thị Tố Nga

7


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng điện (pI) của các
protein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 – 5, khoảng pH= 6 – 8 cả axit phytic và
protein thực vật đều mang điện tích âm. Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thành
phức chất giữa axit phytic và protein. Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axit
phytic với proton của các nhóm cuối cùng α – NH2 và ε – NH2 của gốc lysine tự do hoặc liên

kết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị. Cũng bởi liên kết với protein thực vật nên
axit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làm
giảm giá trị dinh dưỡng của chúng.
Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác động
đến các enzyme như trypsine, pepsine, α – amylase, β – galactosidase và kết quả là làm giảm
hoạt tính của các enzyme tiêu hoá quan trọng này.
2.2.2. Sơ lược về enzyme phytase [24, 25, 26]
2.2.2.1. Định nghĩa
Phytase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo – inositol
hexakisphosphate) thành các myo – inositol phosphate phân tử thấp và các monophosphate vô
cơ. Khi phản ứng thuỷ phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc phosphate trong
phân tử axit phytic và tạo thành các myo – inositol tự do.
Phytase có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo – inositol hexakisphosphat
phosphohydrolase. Uỷ ban danh pháp enzyme thuộc Hội hoá sinh Quốc tế đã chia phytase
thành hai loại là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26). Các định tên này dựa trên
cơ sở nhóm phosphat đầu tiên được giải phóng khi axit phytic (hay hợp chất phytate) bị tấn
công bởi enzyme.

SVTH: Võ Thị Tố Nga

8


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

2.2.2.2. Đặc điểm cấu tạo của phytase [26]

Hình 2.3: Cấu trúc toàn bộ của phytase từ vi khuẩn B.amyloliquefacience.

Phytase cũng giống như mọi enzyme khác có bản chất là protein. Chúng là những phân
tử có khối lượng 20kDa đến 100kDa. Kích thước phân tử protein của enzyme phytase sản
sinh từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau.
Ba ion Canxi Ca1, Ca2 và Ca3 quyết định tính bền nhiệt của enzyme có màu sáng. Ba
ion Caxi Ca4, Ca5 và Ca6 nằm ở phía trên của phân tử có màu đậm. Thêm một ion Canxi Ca7
cò màu đen nằm cạnh Ca4 và Ca6 không có mặt khi vắng mặt ion phosphat.
Các nghiên cứu đã cho thấy rằng hầu hết các phytase thu được từ các chủng nấm mốc và
vi khuẩn như E.coli, K.terrigena, B.subtilis (natto) cho đến nay đều là các enzyme được cấu
tạo chỉ gồm một phần tử. Nhưng phytase ở một số động vật và thực vật thì protein của chúng
lại được cấu tạo bởi nhiều phần nhỏ, các phần đó được gọi là các tiểu đơn vị. Ví dụ phytase
tích luỹ trong các hạt ngô đang nảy mầm là enzyme mà phân tử protein của chúng bao gồm 2
tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử bằng nhau là 38 kDa. Còn phytase được tách chiết từ ruột
của một loài chuột lại được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị là 2 băng protein có khối lượng được xác
định bằng phương pháp điện ly trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) ước tính khoảng 70 và
90 kDa. Tuy nhiên người ta đã xác định được rằng chỉ có tiểu đơn vị có kích thước 90 kDa là
có khả năng thuỷ phân axit phytic vì 2 băng protein này biểu hiện cho 2 loại enzyme khác
nhau tương ứng là phosphatase kiềm và phytase.
Theo tác giả Tambe, có một trường hợp đặc biệt đó là phytase thu được từ chủng vi
khuẩn K.aerogenes lại gồm 2 dạng khác nhau. Dạng thứ nhất có thể coi là dạng enzyme gốc,
có kích thước lớn một cách khác thường (700 kDa). Dạng thứ 2 có thể là một phân tử nhỏ của
SVTH: Võ Thị Tố Nga

9


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

enzyme gốc, có khối lượng phân tử rất thấp chỉ khoảng 10 – 13 kDa nhưng nó lại mang đầy
đủ hoạt tính của enzyme.
Phytase của vi khuẩn nhìn chung có kích thước nhỏ hơn so với phytase của nấm mốc.
Phân tử lượng của phytase từ nấm theo dự đoán khoảng 50 kDa và theo kết quả thí nghiệm
xác định được là 65 – 70 kDa, điều này cho thấy có sự glycosyl hoá rất mạnh mẽ. Phytase
được sinh ra từ chủng nấm mốc A.niger NRRL 3135 có 27% hàm lượng glycosyl, chúng bao
gồm một tỷ lệ nhất định giữa đầu N của chuỗi manose và galactose. Các nghiên cứu đều cho
thấy rằng sự glycosyl hoá của phytase tái tổ hợp rất cao. Ngược với sự glycosyl hoá một
lượng vừa phải trong nấm mốc A.niger, chúng lại xảy ra rất đa dạng và với một lượng rất lớn
trong nấm men Hansenula polymorpha và Saccharomyces cerevisiae. Điều đáng ngạc nhiên
là hàm lượng glycosyl khác nhau không chỉ giữa các hệ được biểu hiện khác nhau mà còn
giữa các nhóm phytase trong cùng một hệ biểu hiện. Khi phân tích mô hình glycosyl của
phytase từ nấm mốc A.niger thì thấy rằng tính không đồng nhất của chúng đã dẫn đến sự thiếu
hụt 2 trong 10 vị trí N-glycosyl.
Nhìn chung hàm lượng glycosyl có thể có một vài tác động đến tính chất của enzyme.
Thứ nhất, nó có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác hoặc tác động đến tính bền của
enzyme.Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến tính đẳng điện (pI) của protein enzyme. Thứ ba, sự
tổng hợp năng lượng trao đổi chất có thể thấp hơn mức biểu hiện của protein. Nhưng theo
Wyss & đtg, có một điều đáng ngạc nhiên là glycosyl ở các mức độ khác nhau không ảnh
hưởng đến hoạt tính xúc tác, khả năng chịu nhiệt hay khả năng phục hồi của phytase ở loài
A.niger. Từ sự glycosyl hoá cấu trúc và chức năng của phytase đã dẫn đến câu hỏi liệu chỉ có
2 vị trí N-glycosyl hoá là bảo thủ ở phytase của nấm mốc hay còn ở vị trí nào khác. Han & đtg
đã nghiên cứu vai trò của glycosyl trong việc biểu hiện phytase chức năng của nấm mốc
A.niger trong nấm men Pichia pastoris. Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy sự giống
nhau trong việc thuỷ phân axit phytic và khả năng chịu nhiệt được cải thiện nhưng không
đáng kể ở enzyme được glycosyl khi biểu hiện trong nấm men P. pastoris so với cùng với
enzyme đó nhưng biểu hiện trong nấm mốc A.niger. Việc khử glycosyl của phytase có thể làm
giảm 34 % khả năng chịu nhiệt của enzyme. Sự khử glycosyl bằng tunicamycin trong quá
trình biểu hiện đã dẫn tới kết quả làm giảm đáng kể sự sản sinh phytase, điều này cho thấy
rằng sự glycosyl hoá rất cần cho quá trình sinh tổng hợp của PhyA tái tổ hợp trong nấm P.

pastoris. Tuy nhiên tunicamycin cũng có thể làm hỏng quá trình sản xuất vì chúng không tích
luỹ phytase nội bào. Mặt khác những nghiên cứu của Wyss đã chỉ ra rằng sự glycosyl hoá
SVTH: Võ Thị Tố Nga

10


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

không tác động hoặc chỉ có một tác động nhỏ đến pI của phytase từ nấm mốc được kiểm tra.
Ngoại trừ một trường hợp là phytase được biểu hiện trong nấm men H. polymorpha có sự
thay đổi giá trị pI axit rất rõ rệt. Tất cả các phytase của nấm mốc, vi khuẩn và thực vật đã
được nghiên cứu cho đến nay đều có giá trị pI axit, trừ phytase của nấm A. fumigatus có pI là
bazơ. Phytase của vi khuẩn dường như có tính axít yếu hơn phytase từ nấm mốc, pI của chúng
thường lớn hơn 6 trong khi đó phytase của nấm mốc lại có giá trị pI dưới 5,5.
Phytase của các loại nấm mốc A. fumigatus, emericella. Nidulans, A. terrus, và
Mycelicophthora thermophila có xu hướng bị giảm hoạt tính khi được biểu hiện trong A.
niger và được bảo quản ở 40C dưới dạng dịch nuôi cấy. Theo Powar & đtg hoạt tính của
phytase từ B. subtilis không bị ảnh hưởng bởi các protease như trypsin, papain và elastase
điều đó chứng tỏ sự kháng lại các protease của phytase từ vi khuẩn mạnh hơn các phytase
được sinh ra từ nấm mốc.
2.2.2.3. Sự phân bố của phytase trong tự nhiên [24, 25]
2.3.1. Phytase từ nguồn thực vật
Phytase có mặt phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt chúng có thể tách chiết và tinh
chế từ các loại ngũ cốc như lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum), ngô (Zea mays) và
các loại đậu xanh, đậu tương, đậu trắng California. Ngoài ra hoạt tính phytase cũng tìm thấy
trong cây mù tạc trắng, khoai tây, củ cải, rau diếp, phấn hoa loa kèn.
2.3.2. Phytase từ nguồn động vật

Phytase được phát hiện ở một số loại chủng vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai
lại. Schwanniomyces castellii, một chủng nấm men có khả năng thuỷ phân từ 90% đến 95%
phytate trong cám mì và bột hạt bông.
Yanke & đtg đã quan sát hoạt tính phytase của một số chủng vi sinh vật trong dạ cỏ
như là Selenomonas ruminantium, Megasphaera elsdenii, Prevotella ruminicola, Mitsuokella
multiaccidus, và Treponema spp. Trong đó chủng Selenomonas ruminantium có hoạt tính cao
nhất. Yanke cũng thông báo hoạt tính phytase tăng lên khi lượng thức ăn hạt của bò đực non
tăng. Hầu hết vi sinh vật dạ cỏ sản xuất phytase ở dạng ngoại bào.
Đối với các động vật có dạ dày đơn ngăn như lợn và gia cầm, phytase đã được tìm
thấy trong ruột và dạ dày của chúng. Tuy nhiên theo Williams & đtg, các phytase này gần như
không có ý nghĩa gì đối với việc phân giải phytate có trong thức ăn được đưa vào dạ dày của
động vật.
SVTH: Võ Thị Tố Nga

11


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Năm 1997, Craxton đã tách dòng và biểu hiện inositol polyphosphat phosphatase
(MIPP) từ gan chuột thấy có hoạt tính phytase. Dạng ARN thông tin của MIPP có mặt trong
tất cả các mô của các con chuột đem làm thí nghiệm nhưng chủ yếu tập trung nhiều ở thận và
gan của loài động vật này. Một loại enzyme giống phytase cũng được tìm thấy ở loài động vật
nguyên sinh Paramecium.
2.3.3. Phytase từ nguồn vi sinh vật
Chúng ta đã biết rằng enzyme nói chung và phytase nói riêng đều có mặt trong tất cả
các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật. Nguồn vi sinh vật
lại vô cùng phong phú và đa dạng nên phytase cũng như các loại enzyme khác có thể được

sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau.
Những nghiên cứu gần đây của một số tác giả đã chỉ ra rằng phytase của vi sinh vật rất
hứa hẹn cho ứng dụng trong công nghệ sinh học. Shich & đtg đã phân lập được trên 2000 loài
vi sinh vật từ đất có khả năng sinh tổng hợp phytase. Người ta đã phát hiện và tách được
phytase ở một số loài vi khuẩn khác nhau như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp,
Bacillus subtilis. Escherichia coli, Citrobacter braakii, Enterobacter sp 4, Raoultella sp., vi
khuẩn dạ cỏ kị khí Mitsuokella jalaludinii ...
Các vi khuẩn lactic cũng có khả năng sinh phytase, nhưng hầu hết trong chúng đều có
hoạt tính thấp. Ngoại trừ một chủng Lactobacillus sanfranciscensis phân lập từ bột ủ chua
được xem như chủng có khả năng sản xuất phytase tốt nhất.
Phytase của vi khuẩn hầu hết được tổng hợp nội bào, ngoại trừ B. subtilis,
Lactobacillus amylovorus và Enterobacter sp 4 là những vi khuẩn sinh tổng hợp phytase
ngoại bào. Hầu hết các chủng sản sinh phytase ngoại bào thuộc nấm sợi. Trong 28 chủng
thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào phân lập được có 21
chủng thuộc loài Aspergillus niger. Các nghiên cứu khác của các tác giả Howson và Volfova
còn khẳng định rằng chủng A. niger là nguồn thu phytase ngoại bào tốt nhất. Còn với nấm
men, các chủng là Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida … cũng
có khả năng sinh phytase. Phytase ngoại bào được tìm thấy ở các chủng Schwanniomyces
castellii và Aexula adeninivorans. Nakamura & đtg đã sàng lọc được một số loài nấm men có
hoạt tính phytase ngoại bào.

SVTH: Võ Thị Tố Nga

12


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Bảng 2.1: Tóm tắt các phytase thu được từ một số nguồn khác nhau

Nguồn gốc

Nấm mốc

Tên chủng

Vị trí

Aspergillus niger NRRL 3135

Ngoại bào

Aspergillus flavus

Ngoại bào

Aspergillus terrus

Ngoại bào

Aspergillus carneus

Ngoại bào

Aspergillus oryzae

Ngoại bào

Aspergillus fumigatus

Ngoại bào

Mucor sp.

Ngoại bào

Penicillum sp.

Ngoại bào

Penicillium caseoicolum

Ngoại bào

Rhizopus oligosporus

Nấm men

Vi khuẩn

Thực vật

Động vật
SVTH: Võ Thị Tố Nga

Ngoại bào và nội bào

Saccharomyces cerevisiae

Ngoại bào

Schwanniomyces castelii

Ngoại bào

Khyveromyces fragilis

Ngoại bào

Candida tropicalis

Ngoại bào

Torulopsis candida

Ngoại bào

Debaryomyces castelii

Ngoại bào

Bacillus subtilis

Ngoại bào

B. subtilis (natto)

Ngoại bào

B. amyloliquefaciens

Ngoại bào

Echerichia coli

Bào quản

Klebsiella aerogenes

Nội bào

K. terrigenes

Nội bào

K. oxytoca

Nội bào

Pseudomonas sp.

Ngoại bào

Enterobacter sp.

Ngoại bào

Citrobacter freundii

Nội bào

Mầm ngô

Nội bào

Hạt đậu tương và các loại đậu

Nội bào

Typha latifolia pollen

Nội bào

Ruột của chuột

Nội bào

Gan chuột
13

M ạng lưới nội chất


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

2.2.2.4. Các tính chất ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [22,24,25,26]

2.2.2.4.1. Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của phytase
Khi thuỷ phân axit phytic, phytase có tác dụng cắt đứt các liên kết trong phân tử axit
phytic. Quá trình cắt đứt này xảy ra nhanh hay chậm và hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ phản ứng, pH phản ứng, lượng cơ chất và lượng enzyme.
Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưng
chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định, mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và chưa bị
biến tính. Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối rộng.
Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt độ enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và nhiệt độ
đó gọi là nhiệt độ tối ưu của enzyme. Nhiệt độ tối ưu của phytase thu được từ các nguồn khác
nhau thì cũng rất khác nhau, dải nhiệt độ này rất rộng, từ 45 – 77 0C. Tuy nhiên nhiệt độ tối
ưu của một enzyme thường không cố định mà thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời
gian phản ứng … Khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng thích nghi, enzyme có thể bị vô hoạt tạm
thời hoặc vô hoạt hoàn toàn. Nhiệt độ mà ở đó enzyme bị mất hoạt tính xúc tác hoàn toàn gọi
là nhiệt độ tới hạn. Nhiệt độ này thường vào khoảng trên 700C. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị
biến tính, ít có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C, hoạt độ của
enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường.
Tính chịu nhiệt của các phytase khác nhau thường khác nhau. Phytase của một số vi
khuẩn như là B. subtilis, E. coli, K.aerogenes, Enterobacter sp.4, K. oxytoca MO-3 và S.
ruminantium hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 50 – 600C, trong khi phytase của Aerobacter
aerogenes có nhiệt độ tối ưu chỉ là 250C. Bên cạnh đó vẫn có những phytase có tính chịu nhiệt
cao như là phytase của chủng S. castellii hoạt động tối ưu ở 770C, nó có thể ổn định hoạt tính
trong 1 giờ ở 740C và phytase của chủng A. adeninivoans có hoạt tính phytase tối ưu ở 750C.
Theo tác giả Nakamura, phytase của nấm men P. spartinae có tính chịu nhiệt cao từ 75
– 800C, ngược lại phytase của chủng P. rhodanensis chỉ chịu nhiệt từ 70 – 750C. Phytase của
P. anomala có nhiệt độ tối ưu là 600C. Enzyme này có tính chịu nhiệt và bền với axit. Trong
số các nấm chịu nhiệt, phytase của nấm mốc Thermomycess lanuginosus có hoạt tính tối ưu ở
650C. Ngoài ra người ta còn phân lập được phytase từ chủng nấm mốc Rhizopus oligosporus,
enzyme này có khả năng chịu được nhiệt độ 650C và duy trì được 20% hoạt tính sau khi để ở
800C trong 5 phút.

SVTH: Võ Thị Tố Nga

14


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Năm 1998, Wyss & đtg đã nghiên cứu về tính bền nhiệt của phytase bằng phương pháp
quang phổ huỳnh quang và thiết bị xác định hoạt tính của enzyme, họ đã kết luận rằng phytase
từ nấm mốc A. niger không có tính bền nhiệt và cũng không có khả năng phục hồi hoạt tính
trở lại. Khi nhiệt độ mới chỉ ở 50 – 550C, enzyme đã bị biến tính và chúng không phục hồi lại
được cấu hình, do đó enzyme bị mất tới 70 – 80% hoạt tính. Phytase từ nấm mốc A. fumigatus
tuy cũng không có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng chúng lại có khả năng phục hồi
hoàn toàn hoạt tính khi đưa trở lại nhiệt độ tối ưu. Chúng có thể phục hồi hoàn toàn hoạt tính
sau 20 phút biến tính ở 900C. Còn phytase của nấm A. niger van Teighem lại hoạt động tốt ở
nhiệt độ 500C, và chúng có thể duy trì 90% hoạt tính sau 24 giờ ở 550C . Như vậy, khi cấu
hình của phytase bị thay đổi dưới tác dụng của nhiệt độ cao hay bất kỳ một tác nhân biến tính
mạnh nào thì đều có thể bị vô hoạt hoàn toàn.
Độ bền nhiệt của mỗi enzyme thường tăng lên khi cơ chất, coenzyme, Ca2+ … Qua
nghiên cứu, người ta thấy phytase từ B. subtilis DS11 có nhiệt độ tối ưu là 700C, cao hơn
nhiệt độ tối ưu của các phytase khác. Chúng có khả năng chịu nhiệt rất tốt khi môi trường có
mặt CaCl2 (ion Ca2+), 100% hoạt tính của enzyme vẫn được bảo toàn sau 10 phút để ở 700C.
Khi không có mặt ion Ca2+ hoạt tính enzyme bị giảm đi ở nhiệt độ 500C, ngược lại ở nhiệt độ
900C khi có mặt ion Ca2+ trong 10 phút, hoạt tính phytase vẫn còn khoảng 50% so với hoạt
tính ban đầu. Điều này chứng tỏ ion Ca2+ có tác dụng bảo vệ enzyme, chống lại sự biến tính
do tác nhân nhiệt độ và làm tăng tính bền của enzyme.
Ngoài ra, muối cũng đã được sử dụng để làm tăng tính chịu nhiệt của enzyme. Rượu làm
từ lúa miến khi bổ sung vào tinh bột cũng làm tăng khả năng chịu nhiệt của phytase. Ứng

dụng kỹ thuật protein để làm tăng tính chịu nhiệt của phytase như là thay thế axit amin prolin
và tạo cầu disulfit. Phytate cũng được báo cáo là tác nhân nâng cao hoạt tính của phytase từ
nấm A. adeninivorans. Sự cố định phytase của E. coli và sự đường hoá của phytase của nấm
A. niger biểu hiện trong nấm men S. cerevisiae đã giúp nâng cao tính chịu nhiệt của sản phẩm
enzyme.
2.2.2.4.2. pH tối ưu cho sự hoạt động của phytase
pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ
ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các enzyme bền trong giới hạn
pH từ 5 – 9. Độ bền cả enzyme đối với pH môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất,
coenzyme và Ca2+ … pH tối ưu cho hoạt động của phytase thu được từ các nguồn khác nhau
rất khác nhau. pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 2,2 đến 8. Hầu hết
SVTH: Võ Thị Tố Nga

15


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

các phytase từ vi sinh vật, đặc biệt của nấm mốc thường có pH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,5
đến 5,6. Tuy nhiên trái ngược với phytase từ nấm mốc, phytase của nấm A. fumigatus lại có
khoảng pH tối ưu rộng đạt 80% hoạt tính khi ở pH giữa 4 và 7,3. Phytase của một vài vi
khuẩn, đặc biệt của Bacillus có pH tối ưu ở 6,5 đến 7,5, pH tối ưu của phytase từ hạt thực vật
ở phạm vi từ 4,0 đến 7,5 và hầu hết trong số chúng có pH tối ưu giữa 4,0 và 5,6.
Bảng 2.2: Các đặc tính sinh lý, sinh hoá của phytase từ các phytase từ các nguồn khác nhau

Vi sinh v t

Nhi t

t i

pH

Km (mM)

Tr ng
l
ng phân
t

u
Vi khu n
Bacillus sp. DS11

70

7,0

0,55

45

Bacillus subtilis

55

7,0

0,04

36,5

Enterobacter sp. 4

50

7-7,5

Escherichia coli

55

4,5

0,13

42

Klebsiella aerogenes

60

4,5-5,2

0,11

700

Lactobacillus amylovorus

45

4,4

Pseudomonas sp.

40

5,5

50-55

4-5,5

Aspergillus carneus

40

5,6

A. carbonarius

53

4,7

A. niger NRRL 3135

58

2,2

A. terreus

70

4,5

Rhizopus oligosporus

55

4,5

0,15

75-80

4,5

0,25

C. tropicalis

65

4,5

Pichia anomala

60

4

0,20

P. rhodanensis

70-75

4,0-4,5

0,25

P. spartinae

75-80

4,5-5,5

0,33

Selenomonas ruminantium

0,016
46

N mm c

0,04

85-100
214

N m men
Arxula adeninivorans

SVTH: Võ Thị Tố Nga

16

64


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

Thường thì giá trị pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc nhiều
vào nhiều yếu tố khác nhau như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ… Qua các nghiên
cứu cho thấy, trong cùng một điều kiện nhất định thì pH tối ưu của phytase ở các chủng được
tìm thấy hầu như chỉ ở một giá trị nhất định, riêng có 2 loại phytase từ A. niger NRRL 3135
và Citrobacter freundii khác với các phytase khác ở điểm là chúng có hai giá trị pH tối ưu
khác nhau. Phytase từ một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có pH tối ưu vào khoảng pH trung
tính (6,5 – 7,5). Còn phytase thu được từ thực vật như hạt đậu và phấn hoa (Hoa Huệ tây) lại
có pH tối ưu cao hơn thường khoảng 8,0.
2.2.2.4.3. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [24,25]
Các ion kim loại được coi là các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase. Tuy nhiên

rất khó để xác định được liệu khả năng ức chế của các kim loại này do bám trực tiếp vào
enzyme hay là các ion kim loại tạo phức ít hoà tan với axit phytic và điều này đã làm giảm
nồng độ cơ chất hoạt động. Phytase từ Enterobacter sp.4 bị ức chế bởi các ion kim loại Zn2+,
Cd2+, Ba2+, Cu2+ và Al3+. Tương tự như vậy phytase của B. subtilis (natto) N-77 cũng bị ức
chế mạnh bởi các ion kim loại như là Zn2+, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+ và Al3+. Cả hai enzyme này
cũng như 2 phytase từ Bacillus đều bị ức chế bởi EDTA và ion Canxi rất cần cho hoạt tính
của chúng.
Wyss & đtg cho rằng ion Cu2+ đã làm giảm hoạt tính enzyme của phytase từ nấm E.
nidulans và A. terrus và một vài ion loại khác đã ức chế phytase của nấm A.fumigatus.
Hoạt tính phytase của nấm A. fumigatus được tăng lên đến 50% bởi EDTA, và EDTA
không có ảnh hưởng gì đến hoạt tính enzyme của các loại nấm E. nidulans, A. niger và A.
terrus đã được thử nghiệm. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của ion kim loại và ADTA đến hoạt
tính phytase đã chỉ ra rằng phytase của nấm mốc không bị ảnh hưởng bởi các chất này. Kết
luận này đã được chứng minh là do trong cấu trúc tinh thể của phytase từ nấm A. niger thiếu
ion kim loại. Điều này khác biệt rõ ràng với sự phụ thuộc vào ion Ca2+ và dễ bị ức chế bởi
EDTA của phytase từ Bacillus.
Trong trung tâm hoạt động của phytase C từ Bacillus có 6 ion Canxi, 3 ion Canxi cần
cho sự ổn định của enzyme và 3 ion Canxi tác động đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Enzyme này bị kìm hãm bởi EDTA hoặc các nhân tố kìm hãm khác nhưng có khả năng phục
hồi bởi 42% hoạt tính khi có mặt của ion Canxi. Đặc biệt khả năng chịu nhiệt của phytase phụ
thuộc rất lớn vào sự có mặt của ion Canxi. Phytase C vẫn còn trên 90% hoạt tính khi ủ ở 600C
SVTH: Võ Thị Tố Nga

17