Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------

LÊ THỊ HỒNG TRANG

TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi
CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------

LÊ THỊ HỒNG TRANG

TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi
CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60.42.01.21

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, một số kết quả
cộ

. Mọi trích dẫn trong luận văn

đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực, một phần đã đƣợc công bố trên Tạp chí Khoa học-Công nghệ
đồng tác giả, phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hƣớng dẫn, giúp đỡ

tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thu Hiền, Trƣờng Đại học Y-Dƣợ

ững ý kiến quý báu
và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệ

ề tài luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái
Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng – KTV phòng Công nghệ tế bào thực
vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí
nghiệm của đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu K
& Nhân văn miền núi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học
tập và hoàn thành khoá học.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị cùng bạn bè đã động viên,
khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.

-

.
Tác giả

Lê Thị Hồng Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………... i
LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………. ii
MỤC LỤC………………………………………………………………

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ……………...…………………... v
DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………...

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………………

viii

MỞ ĐẦU……………………………………………………………......

1

. 1
.

2
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………... 3
1.1. Cây đậu tƣơng……………………………………………………… 3
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của đậu tƣơng…………… 3
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và trong nƣớc……….. 7
1.2. Bệnh khảm và virus gây bệnh khảm SMV, BYMV………………..

10

1.2.1. Bệnh khảm đậu tƣơng……………………………………………. 10
1.2.2. Virus gây bệnh khảm SMV và BYMV…………………………..

11

1.3. Kỹ thuật RNAi……………………………………………………..

12

1.3.1. Cơ chế ức chế gen của kỹ thuật RNAi…………………………… 12
…....

14

…………..

16

1.4.1. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vào mô đích…………..

16

1.4.2. Chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens ………………… 17
1.4.3. Hệ thống tái sinh và hệ thống chọn lọ
1.4.4.

……….

19

..................... 22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP…………………………..

24

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ…………………………..

24
24

.………………………………………………………….
2.1.3. Thi

25

... 25
..

25

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………….

26

2.2.1. Phƣơng pháp tạo vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp…………….

26

2.2.2. Phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách lá mầm………………………. 27
2.2.3. Phƣơng pháp tái sinh cây đậu tƣơng từ nách lá mầm……………. 28
2.2.4. Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen………. 28
2.2.5. Phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen……………………………..

32

2.2.6. Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen…………………….

34

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

35

3.1. KẾT QUẢ TẠO A. TUMEFACIENS MANG VECTOR CHUYỂN
GEN pK7GW-CPi (SMV-BYMV)……………………………………... 35
3.2.
…… 37
3.3.
TƢƠNG....................................................................................................

41

3.3.1. Tái sinh in vitro và chuyể

41
giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008...........................................................
3.3.2.

0 ..........

46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................ 51
CÔNG

........... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

53
/>

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS

Acetosyringone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-Benzyl Amino Purine

Bp

Base pair (cặp base)

BYMV

Bean yellow mosaic virus

CCM

Cocultivation medium

CP

Coat protein (protein vỏ)

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid
Food and Agriculture Organization of the United Nations

FAO

(Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp liên hợp quốc)

GA3

Gibberellic acid

GM

Môi trƣờng nảy mầm

gus

Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

hpRNA

Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc)

IhpRNA

Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron)

IAA

Indoleacetic acid

IBA

Indole-3butyric acid

Kb

Kilo base

Km

Kanamycin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

LB

Luria and Bertani

MS

Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

PCR

Polymerase chain reaction

RISC

RNA-inducing silencing complex

RM

Môi trƣờng ra rễ

RNA

Ribonucleic acid

RNAi

RNA interference

SIM

Môi trƣờng tạo chồi

SEM

Môi trƣờng kéo dài chồi

siRNA

Short interfering RNA

SMV

Soybean mosaic virus

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Ti- plasmid

Plasmid tạo khối u

T0,T1

Các thế hệ cây đậu tƣơng chuyển gen

T0

Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh chồi

T1

Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

Vir

Virulence Region

v/p

Vòng/phút

YEP

Yeast extract peptone

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới từ năm 2008 đến
2012………………………………………………………….

ậu tƣơng củ

Bảng 1.2.

nƣớc đứng đầu thế giớ

8

ố

2010, 2011, 2012

Bảng 1.3. Sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2007 – 2013…………….

8
9

Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro……………… 29
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số…………………………

32

Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.............

33

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR...............................................

33

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm
đến khả năng tạo đa chồi…………………………………….
Bảng 3.2.

-

38

A. tumefaciens

……………………………………………..

43

Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi, kéo dài chồi và khả năng ra rễ của
hai giống ĐT12 và DT2008 trong quá trình chuyển gen........
Bảng 3.4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

44

..... 49

/>

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của SMV………………………………….....

11

Hình 1.2. Cơ chế RNA can thiệp………………………………………..

13

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát.......................................................

26

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tƣơng… 30
Hình 3.1. Kết quả điệ

ản phẩm colony-PCR trực tiếp từ

khuẩn lạc……………………………………………………..
Hình 3.2.

36
37

Hình 3.3. Kết quả gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách lá mầm bằng các
phƣơng thức khác nhau ở hai giống ĐT12 và DT2008……...

39

Hình 3.4. Kết quả tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 và
DT2008.....................................................................................

42

Hình 3.5. Kết quả tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi và đƣa cây ra giá thể… 45
ổng số tách từ

Hình 3.6.

Đ

2008 ...........

46

ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấ

Hình 3.7.

ậu tƣơng chuyể

-

12..................................................................................... 47
ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu

Hình 3.8.
trú
chuyể

ậu tƣơng

-

2008.......................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

48


MỞ ĐẦU

1.
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), đây
là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dƣỡng và kinh tế cao. Ở Việt Nam,
theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng ở 25 tỉnh
trên cả nƣớc, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam. Tuy nhiên, sản
lƣợng đậu tƣơng vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nƣớc khác để đáp
ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [54]. Hạn chế lớn nhất đối
với sự phát triển của đậu tƣơng là dễ bị nhiễm virus, các bệnh do virus gây ra
thƣờng không gây chết cây nhƣng làm giảm năng suất và chất lƣợng của cây
trồng. Bệnh khảm lá đậu tƣơng và khảm vàng đậu tƣơng là hai bệnh hại có
triệu chứng gần giống nhau, xuất hiện phổ biến ở cây đậu tƣơng do soybean
mosaic virus (SMV) và bean yellow mosaic virus (BYMV) gây ra.
virus này thuộc nhóm potyvirus, có vật liệu di truyền là sợi đơn RNA [56].
Chúng lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới, số lƣợng vật chủ trung gian càng
nhiều thì tỷ lệ nhiễm bệnh càng lớn, bệnh xuất hiện càng sớm thì sẽ dẫn đến
thất thu càng nặng. Những biện pháp thƣờng sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng
này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ mà không thể chống
lại triệt để.
Hiện nay, nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, ngƣời ta đã
tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại

bệnh bằng

cách đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gen) của virus vào hệ gen của
thực vật.

hành công

đầu ở cây thuốc lá và cây cà chua kháng lại

virus khảm thuốc lá, đu đủ kháng lại virus bệnh đốm vòng
. Bên cạnh đó, kỹ thuật RNAi (RNA interference)
đƣợc biết đến là một kỹ thuật hiện đại và

chống lại các bệnh do

virus gây ra ở thực vật. Cấu trúc RNAi chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

virus mục tiêu đƣợc sử dụng để chuyển vào cây, nó sẽ đƣợc biểu hiện thành
RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen và
kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Nhiều
giống cây trồng kháng đƣợc các loại bệnh virus khác nhau đã đƣợc tạo ra bằng
RNAi, nhƣ cây đậu tƣơng chuyển gen

kỹ thuật chuyển gen

kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%,
cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus
khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 lo i virus này [5], [13], [26].
Đây là tiền đề quan trọng giúp mở ra khả năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen
RNAi trên các loại cây trồng quan trọng khác [55].
lựa chọn đề tài: “Tạo cây đậu

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi

tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài
SMV và BYMV”.
2. Mục tiêu nghiên cứu

.
3. Nội dung nghiên cứu
cấu trúc RNAi

A. tumefaciens

vi khuẩn tái tổ hợp;

3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm
đạt hiệu quả tạo đa chồi và kéo dài chồi cao nhất;
3.3. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô nách lá mầm và tạo
cây đậu tƣơng chuyển gen;
3.4. Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật
PCR.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full