Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời polydatin, resveratrol và emodin trong cốt khí củ (reynoutria japonica houtt) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỒNG VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN,
RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ
CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT) ẰNG
SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỒNG VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN,
RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ
CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT) ẰNG

SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Nơi thực hiện đề tài: Viện Dƣợc liệu
Thời gian thực hiện: từ 08/2017 đến 04/2018

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Viện Dƣợc Liệu với
sự hƣớng dẫn của TS. Lê Đình Chi và PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng
Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Đình Chi đã định hƣớng nghiên cứu
và góp ý giúp em hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng đã hƣớng
dẫn và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dƣợc Liệu và các cán
bộ Khoa Hóa phân t ch và tiêu chu n đã tạo điều kiện giúp em hoàn thành
luận văn này.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
bên em, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ em trong thời gian em thực
hiện luận văn
Do thời gian thực hiện luận văn có hạn nên không tránh những thiếu
sót. Em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 04 năm 2018
Học viên

Đồng Văn Thành


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chƣơng 1: Tổng quan............................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về Cốt kh củ (Reynoutria japonica Houtt.) ............................ 3
1.1.1. Tên khoa học ....................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 3
1.1.3. Bộ phận dùng....................................................................................... 4
1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................ 4
1.1.5. Tác dụng theo Y học cổ truyền ........................................................... 7
1.1.6. Tác dụng dƣợc lý ................................................................................. 8
1.2. Tổng quan về polydatin, resveratrol, emodin ............................................ 8
1.2.1. T nh chất vật lý và hóa học ................................................................. 8
1.2.2. Tác dụng dƣợc lý ............................................................................... 10
1.3. Phƣơng pháp xác định POL, RES và EM ................................................ 15
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................... 15
1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ............................................................... 16
1.3.3. Tiêu chu n về dƣợc liệu Cốt kh củ trong một số Dƣợc điển ........... 17
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 20


2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 20
2.2. Chất chu n, hóa chất và thiết bị ............................................................... 20

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 21
2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời POL, RES, EM b ng
HPLC ........................................................................................................... 21
2.3.2. Th m định phƣơng pháp ................................................................... 22
2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ .... 22
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22
2.4.1. Chu n bị dung dịch chu n ................................................................. 22
2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 23
2.4.3. Quy trình xử lý mẫu .......................................................................... 23
2.4.3. Đánh giá phƣơng pháp phân t ch ...................................................... 24
2.4.4. Áp dụng trên một số mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ ................................ 27
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................. 28
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU/THỰC NGHIỆM .................................. 29
3.1. Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện sắc ký ................................................... 29
3.1.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại của chất nghiên cứu ................ 29
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 30
3.1.2.1 Lựa chọn pha tĩnh ............................................................................ 30
3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động ....................................................... 30
3.1.2.3. Khảo sát thể t ch tiêm mẫu ............................................................. 35


3.2. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu .............................................................. 36
3.2.1. Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu ...................................................... 36
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết .................................................................... 37
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ chiết ...................................................................... 38
3.2.4. Khảo sát thời gian chiết ..................................................................... 39
3.2.5. Khảo sát số lần chiết.......................................................................... 40
3.3. Th m định phƣơng pháp định lƣợng b ng HPLC.................................... 43
3.3.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................... 43
3.3.2. Độ th ch hợp hệ thống ....................................................................... 43

3.3.3. Đƣờng chu n và khoảng tuyến t nh .................................................. 45
3.3.4. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ) ................ 46
3.3.5. Độ lặp lại ........................................................................................... 48
3.3.6. Độ đúng ............................................................................................. 49
3.4. Áp dụng phƣơng pháp định lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu Cốt kh
củ ..................................................................................................................... 50
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 52
Kết luận và đề xuất .............................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 1


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

EM

Emodin

POL

Polydatin

RES

Resveratrol

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxid

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography

cao

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography photodiode array

cao gh p nối detector

detetion

mảng iod

LC-

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng gh p khối

MS/MS

mass spectrometry

phổ 2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD(%)

Relative standard deviation

Độ lệch chu n tƣơng đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chu n

HPLC

HPLCPDA

Tiếng Việt


DANH MỤC CÁC ẢNG
Bảng 1.1

Một số nghiên cứu ngoài nƣớc về định lƣợng POL,
RES, EM trong Cốt kh củ

Tr. 15

Bảng 3.1

Khảo sát pha động ACN – nƣớc

Tr. 31

Bảng 3.2

Khảo sát pha động MeOH – nƣớc

Tr. 33

Bảng 3.3

Các thông số sắc ký ứng với chƣơng trình gradient 4

Tr. 35

Bảng 3.4

Kết quả đánh giá độ th ch hợp hệ thống của phƣơng pháp

Tr. 44

Bảng 3.5

Quan hệ tuyến t nh giữa nồng độ và diện t ch p c của
POL, RES và EM

Tr. 45

Bảng 3.6

Kết quả xác định LOD và LOQ của phƣơng pháp

Tr. 48

Bảng 3.7

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp

Tr. 49

Bảng 3.8

Kết quả th m định độ đúng của phƣơng pháp

Tr. 50

Bảng 3.9

Kết quả hàm lƣợng POL, RES và EM trên các mẫu Cốt
kh củ

Tr. 51


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1

Hình 1.2

Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ

Tr.4

Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong

rễ Cốt kh củ

Tr.5

Hình 1.3

Công thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt kh củ

Tr.7

Hình 1.4

Công thức cấu tạo của polydatin

Tr.8

Hình 1.5

Công thức cấu tạo của resveratrol

Tr.9

Hình 1.6

Công thức cấu tạo của emodin

Tr.9

Hình 2.1

Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ lƣu trữ tại Viện Dƣợc
liệu

Tr.20

Hình 3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của POL, RES và EM

Tr.29

Hình 3.2

Chƣơng trình gradient 1

Tr.32

Hình 3.3

Chƣơng trình gradient 2

Tr.32

Hình 3.4

Chƣơng trình gradient 3

Tr.34

Hình 3.5

Chƣơng trình gradient 4

Tr.34

Hình 3.6

Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu

Tr.36

Hình 3.7

Kết quả khảo sát dung môi chiết

Tr.37

Hình 3.8

Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết

Tr.38


Hình 3.9

Kết quả khảo sát thời gian chiết

Tr.39

Hình 3.10

Kết quả khảo sát số lần chiết

Tr.40

Hình 3.11

Sắc ký đồ đánh giá t nh chọn lọc của phƣơng pháp

Tr.43

Hình 3.12

Sắc ký đồ khảo sát t nh phù hợp hệ thống của phƣơng
pháp

Tr.44

Hình 3.13

Đƣờng chu n của POL, RES và EM

Tr.46

Hình 3.14

Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ

Tr.47

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cốt kh củ là một vị thuốc cổ truyền đƣợc sử dụng phổ biến tại các nƣớc
châu Á nhƣ Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản…[1], [4] Theo y học cổ truyền cốt
kh củ có công dụng để chữa tê thấp, tổn thƣơng đau đớn do bị ngã, bị thƣơng, là
một vị thuốc thu liễm cầm máu [1], [4]. Kết quả nghên cứu hiện đại cho thấy tác
dụng dƣợc lý của cốt kh củ c ng nhƣ các hoạt chất có trong cốt kh củ rất phong
phú, một số tác dụng đầy tiềm năng đã đƣợc chứng minh nhƣ tác dụng kháng
khu n [32], [51], [52]; tác dụng chống viêm [21], [33]; tác dụng chống oxi hóa
[25]; tác dụng hạ lipid [49]; tác dụng kháng u, chống ung thƣ [66] và tiềm năng
điều trị đái tháo đƣờng [64]…
Hiện nay, nhu cầu sử dụng các vị thuốc cổ truyền trong nhân dân ngày càng
lớn. Nguồn nguyên liệu cốt kh củ một phần đƣợc trồng tại Việt Nam, phần lớn
đƣợc nhập từ Trung Quốc với chất lƣợng chƣa đƣợc kiểm soát. Do đó xuất hiện
tình trạng dƣợc liệu cốt kh củ lƣu thông trên thị trƣờng thƣờng bị giả mạo hoặc
không đạt yêu cầu về chất lƣợng, thực trạng này đã đặt ra một yêu cầu cấp thiết
trong việc kiểm soát chất lƣợng dƣợc liệu. Tuy nhiên, trong chuyên luận Cốt kh
củ DĐVN V , chƣa có quy định về ch tiêu định lƣợng hoạt chất ch nh, hiện nay
mới ch có ch tiêu định t nh b ng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, so sánh với
dƣợc liệu đối chiếu. Ch tiêu định lƣợng chất chiết đƣợc b ng phƣơng pháp cân
với độ ch nh xác không cao. Vì vậy, chuyên luận cốt kh củ DĐVN V chƣa
đánh giá ch nh xác đƣợc chất lƣợng dƣợc liệu cốt kh củ ở Việt Nam. Emodin,
resveratrol, polydatin là những hoạt chất ch nh của Cốt kh củ, đã đƣợc chứng
minh về tác dụng dƣợc lý. Mặt khác, trong Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển
Hồng kông đã đƣa các ch tiêu định lƣợng các hoạt chất này nh m đảm bảo chất
lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ nhƣng chƣa thực hiện định lƣợng đồng thời chúng

2

[10], [13]. Xuất phát từ thực tiễn đó, nhóm nghiên cứu đề xuất đề tài “Nghiên
cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời polydatin, resveratrol và
emodin trong Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt)

ằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao” với mục tiêu:
1. Xây dựng và th m định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời polydatin,
resveratrol và emodin trong dƣợc liệu Cốt kh củ b ng phƣơng pháp HPLC.
2. Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đƣợc trên các mẫu dƣợc liệu Cốt
kh củ thu mua trên địa bàn Hà Nội.


3

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.)
1.1.1. Tên khoa học
Cốt kh củ có tên khoa học là Reynoutria japonica Houtt., thuộc họ Rau
răm Polygonaceae và có tên khoa học đồng nghĩa khác là Reynoutria Mak.,
Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc, Reynoutria elata Nak. Ở Việt Nam, Cốt
kh củ còn đƣợc gọi là điền thất, hổ trƣợng căn, phù linh, nam hoàng cầm, co hớ
hƣờn Thái , mèng kẻng (Tày , hồng lìu Dao [1], [4].
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân ố
Cốt kh củ là loại cây nhỏ, sống lâu năm. Rễ phình thành củ cứng, mọc bò
nghiêng dƣới đất, vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu vàng. Thân hình trụ, nhẵn,
mọc thẳng đứng, cao 0,5-1 m, thƣờng có những đốm màu t a hồng. Lá mọc so le,

cuống ngắn, hình trứng, đầu tù, hơi nhọn, m p nguyên, dài 5-12 cm, rộng 3,5-8
cm, mặt trên màu lục sẫm, có khi nâu đen; bẹ chìa ngắn. Cụm hoa ngắn hơn lá,
mọc thành chùm ở kẽ lá; hoa nhỏ màu trắng, hoa đực và hoa cái riêng; bao hoa
có 5 phiến; hoa đực có 8 nhị; hoa cái có bầu 3 góc. Quả 3 cạnh màu nâu đỏ, mùa
hoa quả vào tháng 10-11 [1], [4].
Cốt kh củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng cận
nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam,
Lào và một vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ
1000 -1600 m và đƣợc trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng
b ng Bắc Bộ [1], [4].
Cốt kh củ ƣa sáng, ƣa m, nhƣng ráo nƣớc úng ngập dễ làm thối củ
thƣờng mọc thành khóm trong các thung l ng, nơi gần nguồn nƣớc. Cây rụng lá


4

vào mùa đông, ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng mọc chồi từ thân rễ. Cây
sinh trƣởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9
trở đi, nên thu hoạch vào những ngày nắng ráo trong mùa đông, khi phần thân lá
bắt đầu h o hoặc c ng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trƣớc khi cây tái sinh
[1], [4].
1.1.3. Bộ phận dùng
Thân rễ - (Rhizoma Renoutriae japanicae, gọi tên là Hổ Trƣợng hoặc
Radix Polygoni cuspidati) là rễ phơi hay sấy khô của cây cốt kh củ, rễ cốt kh củ
thu hái quanh năm, tốt nhất vào thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, thái
thành miếng nhỏ dày chừng 1-2 cm, phơi hoặc sấy khô. Dƣợc liệu có mặt ngoài
nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và gióng, mặt cắt
ngang màu vàng b n, lõi gần nhƣ rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm. Chất
nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng ƣ

Hình 1.1: Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ
1.1.4. Thành phần hóa học
Từ đầu những năm 1950, đã có rất nhiều hợp chất hóa học đƣợc phân lập
từ loài Cốt kh củ Reynoutria japonica Houtt.) tại Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn


5

Quốc và nhiều nƣớc khác trên thế giới. Hầu hết các nghiên cứu tập trung xác
định thành phần hóa học từ rễ Cốt kh củ, bộ phận đƣợc sử dụng ch nh trong các
bài thuốc y học cổ truyền. Trong thành phần hóa học nổi bật của rễ Cốt kh củ,
hai nhóm chất ch nh chiếm hàm lƣợng lớn là các quinon chủ yếu là
anthraquinon) và các stilben. Đây là các thành phần hóa học quyết định cho
nhiều hoạt t nh của Cốt kh củ nhƣ kháng khu n, kháng u, kháng ung thƣ, chống
oxy hóa, phòng ngừa bệnh tim mạch… Ngoài ra còn có nhiều nhóm hợp chất
khác nhƣ flavonoid, coumarin, lignan…với nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý,
bổ trợ với hai nhóm hợp chất ch nh làm cho Cốt kh củ có hoạt t nh sinh dƣợc
học cao.
1.1.4.1. Nhóm chất quinon
Kể từ những nghiên cứu đầu tiên về Cốt kh củ vào những năm 1950, các
quinon và các dẫn xuất của nó đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học.
Trong rễ Cốt kh củ, các quinon bao gồm các nhóm anthraquinon chiếm
hàm lƣợng lớn và naphthoquinon [30], [34], [45], [47], [54], [66]. Các
anthraquinon có cấu trúc khung emodin nhƣ: emodin, physcion, fallacinol,
questin, anthraglycoside A–B, chrysophanol, citreorosein, questinol, rhein,
anthraquinones polyganin A – B. Ba naphthoquinon là 2-methoxy-6-acetyl-7methyljuglone, cuspidatumin A và 7-acetyl-2-methoxy-6-methyl-8-hydroxyl-4naphthoquinone c ng đã đƣợc phân lập từ rễ Cốt kh củ.
H3COC

O
OCH2CH3

O

Emodin

Physcion

Cuspidatumin A


6

Hình 1.2. Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong rễ Cốt kh củ
1.1.4.2. Nhóm chất stilben
Stilben là là một nhóm chất có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2C6. Stilben thuộc nhóm các hợp chất phenylpropanoids. Một số stilbenoid đã
đƣợc tìm thấy trong thực vật và khẳng định về hoạt t nh đặc trƣng của chúng nhƣ
p ceatannolin có trong rễ của cây vân sam Na Uy. Hay pinosylvin là một độc tố
nấm bảo vệ gỗ khỏi bị nhiễm nấm, đƣợc tìm thấy trong cây họ thông.
Pterostilben có trong hạnh nhân, cây thông và quả mọng [11].
Trong rễ cây Cốt kh củ, nhiều nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới đã
nghiên cứu và xác định sự có mặt của nhóm stilben. Trong đó hai stilben ch nh là
resveratrol và dẫn xuất của nó là polydatin đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc
vào năm 1963 [47]. Đến năm 2004, hai stilben khác là resveratrol 4-O-D- 2′galloyl)- glucopyranoside và resveratrol 4-O-D- 6′ galloyl -glucopyranoside đã
đƣợc xác định từ dịch chiết methanol 70 % của rễ Cốt kh củ [23]. Ngoài ra,
thêm 10 stilbenoid sulfat đƣợc xác định từ dịch chiết aceton bao gồm Na, K
trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-6″-sulfat; Na, K trans-resveratrol-3O-β-D-glucopyranoside-4″-sulfat;

Na,

K

trans-resveratrol-3-O-β-D-

glucopyranoside-2″-sulfat; Na, K trans -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside4′-sulfat; Na, K trans -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-5-sulfat; Na, K cisresveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-6″-sulfat, Na, K cis-resveratrol-3-O-β-Dglucopyranoside-4″-sulfat, Na, K cis-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-3″sulfat; Na, K cis-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-2″-sulfat, Na, K cisresveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-5-sulfat [58].


7

Polydatin

Resveratrol

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt kh củ
1.1.4.3. Các nhóm chất khác
Trong rễ Cốt kh củ có chứa các flavonoid thuộc nhóm flavonol nhƣ:
quercetin, dẫn xuất của quercetin và dạng glycosid, catechin và dạng glycosid
của nó [27], [37], [58].
Ngoài ra trong rễ Cốt kh củ còn chứa các hợp chất thuộc nhóm coumarin
nhƣ 7-hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin…, [65] các lignan nhƣ natri (-)lyoniresinol-2a-sulfat và natri (+)-isolaricireinol-2a-sulfat [59]và các hợp chất
khác nhƣ acid gallic, tryptophan, β-sitosterol……
1.1.5. Tác dụng theo Y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, rễ cốt kh củ có vị đắng, t nh ấm. Quy kinh can, tâm
bào với công năng hoạt huyết thông kinh, ch thống, trừ phong thấp, thanh thấp
nhiệt, tiêu viêm, sát khu n. Ở Việt Nam rễ cốt kh củ thƣờng đƣợc dùng để chữa
tê thấp, tổn thƣơng đau đớn do bị ngã, bị thƣơng, là một vị thuốc thu liễm cầm
máu.
Trong bộ Bản thảo cƣơng mục của Lý Thời Trân Trung Quốc - thế kỷ 16 ,
vị thuốc này có tác dụng lợi tiểu, thông kinh, giảm đau, giảm độc, dùng cho
những ngƣời bị kinh nguyệt bế tắc, kinh nguyệt khó khăn đau đớn, đẻ xong
huyết ứ, bụng trƣớng, tiểu tiện khó khăn [1].

8

Trong y học cổ truyền Trung Quốc cốt kh củ đƣợc gọi là Zhang Hu, đƣợc
sử dụng để điều trị các tổn thƣơng viêm, viêm gan, các khối u, tiêu chảy, hạ sốt,
giảm đau, lợi tiểu, tiêu đờm và đƣợc liệt kê ch nh thức trong Dƣợc điển Trung
Hoa (1995) [9]. Sử dụng trong các phƣơng pháp điều trị đau khớp, viêm phế
quản mãn t nh, vàng da, vô kinh và huyết áp cao [15].
1.1.6. Tác dụng dƣợc lý
Sự phong phú về thành phần hoá học và các nhóm chất có hoạt t nh sinh
học cao làm cho cốt kh củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá. Trên thế giới có
rất nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của cốt kh củ với các định hƣớng sinh
học khác nhau nhƣ: tác dụng kháng khu n [32], [51], [52]; tác dụng chống viêm
[21], [33]; tác dụng chống oxi hóa [25]; tác dụng hạ lipid [49]; tác dụng kháng u,
chống ung thƣ [66] và tiềm năng điều trị đái tháo đƣờng [64].
1.2. Tổng quan về polydatin, resveratrol, emodin
1.2.1. Tính chất vật lý và hóa học
1.2.1.1. Polydatin (POL)

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của polydatin
- Tên đầy đủ: 2-[3-hydroxy-5-[(E)-2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]phenoxy]-6(hydorxymethyl)oxane-3,4,5-triol.
- Công thức phân tử: C20H22O8
- Khối lƣợng phân tử: 390,384 g/mol.


9

- Ở điều kiện nhiệt độ phòng, POL có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ
nóng chảy 236 C, tan tốt trong DMSO và nƣớc, methanol.

1.2.1.2. Resveratrol (RES)

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của resveratrol
- Tên đầy đủ: 5-[(1E)-2-(4-Hydroxyphenyl)ethenyl]-1,3-benzenediol
- Công thức phân tử: C14H12O3
- Khối lƣợng phân tử: 228,24 g/mol
- Ở điều kiện nhiệt độ phòng, RES có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ
nóng chảy 236 C, tan tốt trong DMSO và nƣớc, methanol.
1.2.1.3. Emodin (EM)

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của emodin
- Tên đầy đủ: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dione
- Công thức phân tử: C15H10O5
- Khối lƣợng phân tử: 270,24 g/ mol
- Ở điều kiện nhiệt độ phòng, EM tồn tại ở trạng thái bột kết tinh hoặc tinh thể
hình kim màu vàng cam. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 256-257 oC. EM tan tốt


10

trong dung môi hữu cơ nhƣ ether, ether dầu hỏa, cloroform, methanol… ,
không tan trong nƣớc.
1.2.2. Tác dụng dƣợc lý
1.2.2.1. Tác dụng dược lý của POL
a. Tác dụng tr n t bào c tim
Trong một nghiên cứu tiến hành trên chuột, Zhao SK và cộng sự đã chứng
minh đƣợc tác dụng bảo vệ cơ tim của POL trên chuột nhắt trƣởng thành với tổn
thƣơng cơ tim đƣợc gây ra bởi adriamicin adr . Những con chuột dùng POL +
adr tế bào cơ tim gần nhƣ giữ cấu trúc bình thƣờng, trong khi con chuột ch dùng
adr có hoại tử từng phần [69].

Polydatin c ng đƣợc Zhao SK và cộng sự chứng minh có tác dụng gây tăng
Ca huyết và tăng cƣờng co bóp cơ tim [28]. Với liều POL 20 mg/kg có tác
dụng giảm đáng kể creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase từ cơ tim
bị hƣ hỏng do k ch hoạt protein kinase C-ATP nhạy cảm phụ thuộc kênh K [43],
[44].
b. Tác dụng b o v gan
Năm 1999, Huang và cộng sự thử nghiệm và chứng minh đƣợc POL ở nồng
độ 10-7 mol/l -10-4 mol/l có tác dụng bảo vệ tế bào gan đƣợc nuôi cấy của chuột
chống lại thƣơng tổn do CCl4 gây ra [26]. Năm 2012 Zhang và cộng sự tiến hành
th nghiệm: gây tổn thƣơng gan chuột b ng cách tiêm trong lồng ngực chuột
CCl4 và dùng POL trong 5 ngày liên tiếp cho kết quả POL làm giảm đáng kể sự
tăng các yếu tố gây hoại tử gan AST, ALT, MDA, IL-1β, đồng thời tăng hàm
lƣợng của GSH và GST [65].
Thử nghiệm trên chuột, POL có tác dụng giảm nồng độ TC, TG huyết
tƣơng và lipid gan b ng cơ chế giảm yếu tố hoại tử khối u gan TNF-

và biểu


11

hiện gen SREBP-1c, tác dụng này cho thấy POL có khả năng làm giảm gan
nhiễm mỡ ở chuột [67].
c. Tác dụng ch ng o y hóa
POL có đặc t nh chống oxy hóa đáng kể do cấu trúc phân tử chứa hệ nối đôi
liên hợp, nó liên quan chặt chẽ tới các tác dụng dƣợc lý nhƣ bảo vệ chống lại
thƣơng t ch, cải thiện học tập và tr nhớ, giảm lipid và k o dài tuổi thọ… POL
kháng lại quá trình oxy hóa enzyme hơn resveratrol do sự thay đổi cấu trúc phân
tử [16].
d. Tác dụng ch ng vi m

Nhiều nghiên cứu báo cáo r ng POL điều ch nh sự sản sinh các cytokin
viêm và các phân tử kết d nh tế bào trong các thử nghiệm invitro và invivo. POL
làm giảm sản xuất IL-17 trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi hoạt t nh của
con ngƣời thông qua sự điều ch nh làm giảm biểu hiện mRNA IL-17 trong tế bào
[38].
POL giảm hoạt động và biểu hiện NF-kB p65, ngăn chặn sự sản sinh của
TNF-a, IL-6 và IL-1b ở mRNA và protein, làm giảm hoạt động của MPO và
giảm bớt các tổn thƣơng viêm đại tràng ở chuột bị viêm đại tràng [60].
e. Các tác dụng khác
POL đã đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng khác nhƣ tác dụng bảo vệ hệ
thần kinh [28], [39], tác dụng chống sốc [50], tác dụng chống khối u [36]…
1.2.2.2. Tác dụng dược lý của RES
a. Tác dụng ch ng ung thư
RES liều 2,5 và 10 mg/ kg, tiêm màng bụng trên chuột trong 5 ngày
làm giảm đáng kể thể t ch 42% và khối lƣợng 44 % , ngăn cản sự phát triển
và di căn của khối u do ức chế tổng hợp DNA của tế bào khối u, c ng nhƣ ngăn


12

cản sự hình thành vi mạch do khối u gây ra trên chuột có tế bào u phổi Lewis
có nguy cơ di căn cao [35]. Trong một th nghiệm khác trên chuột có u thần
kinh đệm trong não, RES liều 40 mg/kg/ngày, tiêm màng bụng trong khoảng
150 ngày làm giảm sự phát triển của tế bào khối u, tăng thời gian và tỷ lệ sống
sót của chuột thử nghiệm [53]. Cơ chế này có liên quan đến tác dụng gây độc tế
bào, tăng sự chết rụng và ức chế sự hình thành mạch máu của tế bào khối u.
RES c ng có tác dụng gây độc tế bào đối với tế bào MCF-7 và các tế bào MCF7 kháng adriamycin với giá trị IC50 lần lƣợt là 58,4 và 56,7 μg / mL [17]. RES
c ng có tác dụng chống ung thƣ buồng trứng Guo và cộng sự, 2010 , ung thƣ
bạch huyết [62], khối u không điển hình / rhabdoid không điển hình [31], ung
thƣ gan [24], khối u ác t nh ở mắt và khối u thần kinh ở ngƣời [55]….

b. Tác dụng kháng virus
Trong các th nghiệm nuôi cấy tế bào, RES đã ngăn chặn quá trình tái tạo
virus cúm, đạt hiệu quả lớn nhất 3 giờ sau khi phơi nhiễm cúm. RES đạt hiệu
quả nhỏ hơn nhƣng vẫn đáng kể khi điều trị đƣợc tiến hành bắt đầu 6 giờ sau
khi nhiễm, tuy nhiên tại thời điểm 9 giờ sau khi bị nhiễm, RES không có tác
dụng [48].
c. Tác dụng kháng nấm
RES có tác dụng kháng nấm mạnh, chống lại các loại nấm gây bệnh ở
ngƣời trong khoảng nồng độ 10-20 µg/ml. Sự tiêu diệt các tế bào nấm
C.albicans bởi RES đã đƣợc xác định b ng phƣơng pháp qu t k nh hiển vi điện
tử. Các kết quả này đƣa ra giả thuyết r ng RES có thể đƣợc sử dụng nhƣ là chất
điều trị nấm ở ngƣời [57].
d. Tác dụng kháng vi m


13

Nghiên cứu ch ra r ng cả RES và quercetin đã ức chế quá trình sao ch p
phụ thuộc NF-kappaB-, AP-1- và CREB đến một mức lớn hơn
glucocorticosteroid, dexamathasone [8].
Abeer H. Harb và cộng sự đã thử nghiệm hiệu quả chống viêm của RES
trên chuột và nhận thấy: quá trình giảm viêm phụ thuộc liều; sự ức chế này có ý
nghĩa thống kê sau 3h và 1h với liều 13,40 mg/kg tƣơng ứng. Hiệu quả chống
viêm của RES đƣợc tìm thấy một cách độc lập ở tuyến thƣợng thận nhƣng có
thể liên quan tới việc ức chế các nhân tố gây viêm và gốc tự do. Một vài ý kiến
cho r ng hiệu quả chống viêm của RES là do ức chế hoạt t nh cyclooygenase,
làm giảm tạo prostagladin E2 (PGE2 ; đồng thời ức chế con đƣờng phát sinh
NO, làm giảm quá trình tổng hợp NO trên các đại thực bào và các tế bào nuôi
cấy có hoạt t nh [22].
e. Các tác dụng khác

RES đã đƣợc chứng minh có tác dụng giảm sự oxy hóa và tăng trƣởng
trong các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc ngƣời, chống lại các rối loạn tim
mạch do oxy hóa, ….[7], [18].
1.2.2.3. Tác dụng dược lý của EM
a. Tác dụng ch ng ung thư
Jia và cộng sự lần đầu tiên chứng minh r ng EM có khả năng ức chế sự
di căn của tế bào ung thƣ vú b ng cách ức chế sự hồi phục của các đại thực bào
M2 trong phổi [29]. Trong một nghiên cứu khác, điều trị kết hợp của EM (10,
20, 40 và 80 μM và curcumin 10 μM đã ức chế sự gia tăng và xâm lấn các tế
bào ung thƣ vú b ng cách tăng sự hiện diện của miR-34a [20].


14

Way và cộng sự đã chứng minh r ng EM ức chế đáng kể sự di chuyển và
xâm lấn của tế bào TWIST1 b ng cách ức chế các con đƣờng tổng hợp βcatenin và Akt [56].
b. Tác dụng ch ng vi m
Nhiều nghiên cứu ch ra r ng EM có tác dụng chống viêm trên chuột bị
viêm hoại tử b ng cách tăng sản sinh tế bào mCD14 và ức chế TNF- , IL-6 và
IL-1β trong huyết thanh [46], [63].
Yếu tố nhân-κB tham gia vào việc sao ch p các gen viêm da khác nhau
liên quan đến sự tiến triển của bệnh. Tác dụng kháng viêm của EM có liên quan
đến sự ức chế yếu tố phiên mã viêm nƣớu NF-κB. Gao và cộng sự Làm sáng tỏ
các thành phần hoạt t nh kháng viêm của thuốc bôi sẹo trị liệu Jiashitang, bao
gồm saffiomin, emodin, salvianolic acid, tanshinone và các dẫn chất saponin
triterpenoid. Trong số các hoạt chất này, emodin đƣợc dự đoán sẽ gây tác dụng
ức chế NF-κB thông qua các con đƣờng tổng hợp MAPK, PI3K / AKT và
NIK-IKK [19].
c. Tác dụng kháng khuẩn
EM có tác dụng kháng khu n đáng kể trên các vi khu n Gram dƣơng

đƣợc thử nghiệm, đặc biệt là Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus. Giá trị
nồng độ kháng sinh ức chế vi khu n tối thiểu MIC của emodin là 28,9 và 14,4
μM [12]. Tuy nhiên, EM không có tác dụng trên hai vi khu n Gram âm
(Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli ở nồng độ cao nhất 1851,9 μM
đã đƣợc thử nghiệm. Các nghiên cứu tƣơng tự cho thấy, EM đã đƣợc báo cáo
có hoạt t nh kháng khu n phổ rộng, đặc biệt đối với M. tuberculosis (MIC = 0,9
μM và vi khu n Gram dƣơng MIC <14,8 μM [14].
d. Các tác dụng khác


15

Ngoài ra, EM còn đƣợc báo có tác dụng giảm đau, kháng virus, ức chế
miễn dịch, tác dụng bảo vệ thần kinh, chống tiểu đƣờng, bảo vệ tế bào
gan….[40], [41], [42], [61].
1.3. Phƣơng pháp xác định POL, RES và EM
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc
ảng 1.1: Một số nghiên cứu ngoài nƣớc về định lƣợng POL, RES, EM trong
Cốt kh củ
Kỹ
TLTK

thuật
sử dụng

Đối tƣợng
phân tích

Điều kiện phân tích
- Dung môi chiết: methanol

- Phƣơng pháp chiết: Siêu âm

[6]

HPLCDAD

- POL, RES,

- Điều kiện sắc ký

EM trong 5

+ Pha tĩnh: C18 4,6 × 250 mm; 5 µm )

loài

+ Pha động: Kênh A: acetonitril; Kênh

Polygonum

B: nƣớc. Chế độ gradient
+ Bƣớc sóng phát hiện: 320 nm với
POL, RES và 280 nm với EM

- POL, RES,
anthraglycosd
[68]

HPLC

B,

EM

và

physcion
trong rễ Cốt
kh củ

- Dung môi chiết: methanol
- Phƣơng pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký
+ Pha tĩnh: Agilent Zorbax SB-C18 (4,6
× 250 mm; 5 µm )
+ Pha động: Kênh A: acetonitril; Kênh
B: acid fomic 0,1%. Chế độ gradient