Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 15 29

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----

----

TRẦN THỊ LAN NHI
Mã sinh viên: 1301299

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN NHI
Mã sinh viên: 1301299

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS. TS. Cao Văn Thu

Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
PGS.TS. Cao Văn Thu người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi từ những ngày đầu
bước vào nghiên cứu khoa học cho tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên
giảng dạy công tác tại bộ môn Vi sinh - Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường
Đại Học Dược Hà Nội; Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc
gia Hà Nội; PGS.TS. Phan Văn Kiệm – Phó chủ tịch Viện Hàn Lâm khoa học và công
nghệ Việt Nam; Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, hướng dẫn và
giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy, cô
giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ tôi trong suốt năm
năm học tại trường để tôi có được những kiến thức và các kỹ năng cần thiết.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình nơi đã sinh ra, nuôi dưỡng và
dạy dỗ để tôi có được thành quả như ngày hôm nay. Cảm ơn những người bạn, người
em đã hỗ trợ và đồng hành trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Do thời gian, phương tiện, kinh phí, kiến thức của bản thân còn hạn chế, chắc
chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp của thầy cô, bạn bè để khóa luận này được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm2017
Sinh viên
TRẦN THỊ LAN NHI

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1.

Đại cương về kháng sinh ................................................................................. 2

1.1.1.

Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ................................................................. 2

1.1.2.

Định nghĩa kháng sinh .............................................................................. 2

1.1.3.

Phân loại kháng sinh ................................................................................. 2

1.1.4.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh: .............................................................. 3

1.1.5.

Ứng dụng của kháng sinh: ........................................................................ 3

1.1.6.

Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh ............................................... 4

1.2.

Đặc điểm xạ khuẩn........................................................................................... 4

1.2.1.

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces ................................ 4

1.2.2.

Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn ..................................................... 5

1.2.3.

Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng ................................................................ 5

1.2.4.

Phân loại xạ khuẩn .................................................................................... 5

1.2.5.

Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces ........................... 6

1.3.

Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh ..................... 6

1.4.

Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn ............................................................. 6

1.4.1.

Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên ............... 6

1.4.2.

Đột biến cải tạo giống ................................................................................ 7

1.5.

Bảo quản giống xạ khuẩn ................................................................................ 7

1.6.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ................................................................ 7

1.6.1.

Khái niệm lên men ..................................................................................... 7

1.6.2.

Các phương pháp lên men ......................................................................... 8

1.6.3.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ..................................... 8

1.7.

Chiết tách, tinh chế kháng sinh ...................................................................... 9


1.7.1.

Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh .......................................... 9

1.7.2.

Phương pháp chiết xuất ............................................................................. 9

1.7.3.

Phương pháp tinh chế ................................................................................ 9

1.8.

Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh ............................................................. 10

1.8.1.

Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................................ 10

1.8.2.

Phổ tử ngoại - khả hiếm (UV - VIS) ....................................................... 10

1.8.3.

Phổ khối (MS) .......................................................................................... 11

1.8.4.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ...................................................... 11

1.9.

Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces ........................................... 11

1.9.1.

Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn

Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học .............. 11
1.9.2.

Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một Streptomycete có sắc tố

khuyếch tán màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam .......................... 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 13
2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị ............................................................................. 13

2.1.1.

Nguyên vật liệu ......................................................................................... 13

2.1.2.

Máy móc, thiết bị, dụng cụ ....................................................................... 15

2.2.

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 15

2.2.1.

Chọn lọc, cải tạo giống ............................................................................ 15

2.2.2.

Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh ............................................... 15

2.2.3.

Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được ....... 15

2.3.

Phương pháp thực nghiệm ............................................................................ 16

2.3.1.

Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn .............................................................. 16

2.3.2.

Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán .......... 16

2.3.3.

Phương pháp cải tạo và chọn giống ........................................................ 17

2.3.4.

Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh................................................ 18


2.3.5.

Các phương pháp chiết tách, tinh chế kháng sinh ................................. 19

2.3.6.

Sơ bộ xác định tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được ................... 21

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN ....... 22
3.1.

Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh............................................. 22

3.1.1.

Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 15.29 ....................... 22

3.1.2.

Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 ................................................. 22

3.1.3.

Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 ................................................. 23

3.1.4.

Kết quả đột biến hoá học cải tạo giống ................................................... 24

3.2.

Kết quả lên men chọn môi trường nuôi cấy tốt nhất .................................. 25

3.3.

Kết quả chọn chủng lên men tốt nhất .......................................................... 26

3.4.

Kết quả sắc ký ................................................................................................ 26

3.4.1.

Kết quả chạy sắc ký lần 1 ......................................................................... 26

3.4.2.

Kết quả chạy sắc ký lần 2 ......................................................................... 28

3.4.3.

Kết quả chạy sắc ký lần 3 ......................................................................... 28

3.5.

Kết tinh thu kháng sinh tinh khiết ............................................................... 29

3.6.

Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh ............................................... 30

3.6.1.

Kháng sinh 15.29.KS1 .............................................................................. 30

3.6.2.

Kháng sinh 15.29.KS2 .............................................................................. 31

3.6.3.

Kháng sinh 15.29.KS3 .............................................................................. 36

3.7.

Bàn luận .......................................................................................................... 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 1
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 4


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
13
1

C- NMR

13

H - NMR

1

C Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ 13 carbon)

H Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hydro)

A549

Tế bào ung thư phổi

ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

ATCC
BGC823
CDC

American Type Culture Collection (Chủng vi sinh vật chuẩn của Hoa
Kỳ)
Tế bào ung thư dạ dày
Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát và
phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ)

COSY

Correlation Spectroscopy (Phổ tương quan)

CW I

Cell wall type 1 (Thành tế bào loại 1)
Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn

dd

Dung dịch

DEPT

Distortionless Enhancementby Polarization Transfer

DM

Dung môi

dmhc

Dung môi hữu cơ

ĐBHH

Đột biến hoá học

ĐBUV1

Đột biến UV lần 1

ĐBUV2

Đột biến UV lần 2

Gr(-)/ Gr(+)

Gram âm / Gram dương

HMBC

HSQC
HTKS

Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan đa liên kết
dị nhân)
Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ kết hợp lượng tử đơn
dị nhân)

Hoạt tính kháng sinh


IMI

Innovative Medicine Initiative

IR

Ifrared (Phổ hồng ngoại)

ISP

International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc
tế)

KS

Kháng sinh

L-DAP

L-diaminopimelic acid

MC

Mẫu chứng

MS

Mass Spectrometry (Phổ khối)

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NCIMB

NCTC

The National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (Bộ
sưu tập quốc gia về công nghiệp, thực phẩm và vi khuẩn biển)
The North Centre Texas College (Trường Đại học North Centre
Texas)

NMR

Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

P. mirabilis

Proteus mirabilis BV 108

S. aureus

Staphylococcus aureus ATCC 1228

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

t0nc

Nhiệt độ nóng chảy

UV

Utra Violet (Phổ tử ngoại)

UV - VIS

Ultra Violet - Visible (Phổ tử ngoại - khả hiếm)

V

Thể tích

v/v

Thể tích/ thể tích

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các chủng VK kiểm định .................................................................................. 13
Bảng 2.2. Các môi trường nuôi cấy VK kiểm định ........................................................... 13
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ................................................................... 14
Bảng 3.1. Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên ..................................................... 22
Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 ........................................................ 23
Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2 ........................................................ 24
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS sau đột biến hoá học .......................................................... 25
Bảng 3.5. Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men tối thích..................................... 25
Bảng 3.6. Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men tốt nhất .............................................. 26
Bảng 3.7. Kết quả thử HTKS và SKLM sau chạy sắc ký cột lần 1 ................................... 27
Bảng 3.8. Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2........................... 28
Bảng 3.9. Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3........................... 29
Bảng 3.10. Màu sắc, khối lượng kháng sinh tinh khiết và hiệu suất tinh chế ................... 29
Bảng 3.11. Kết quả phổ IR của 15.29.KS1 ....................................................................... 30
Bảng 3.12. So sánh nhiệt độ nóng chảy, phổ UV của 15.29.KS1 và actinomycin X2 ...... 31
Bảng 3.13. Kết quả phổ IR của 15.29.KS2 ....................................................................... 32
Bảng 3.14. So sánh nhiệt độ nóng chảy, phổ UV của 15.29.KS2 và actinomycin D ....... 32
Bảng 3.15. Các nhóm nguyên tố carbon trong công thức 15.29.KS2. .............................. 33
Bảng 3.16. So sánh phổ NMR của 15.29.KS2 và actinomycin D ..................................... 34
Bảng 3.17. Kết quả phổ IR của 15.29.KS3 ....................................................................... 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình PH.1

Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Hình PH.2

Xạ khuẩn cấy zigzac trên đĩa Petri và khuẩn lạc sau đột biến UV

Hình PH.3

Thử HTKS bằng 3 phương pháp khối thạch, giếng thạch, khoanh giấy
lọc.

Hình PH.4

Bình chứa dịch lên men: MT1dt, MT2dt, MT5dt.

Hình PH.5

Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và dãy các phân đoạn kháng sinh.

Hình PH.6

Hiện hình bằng S. aureus

Hình PH.7

Đo t0nc của hai KS

Hình PH.8

Kháng sinh thô tinh khiết

Hình PH.9

Phổ tử ngoại của kháng sinh 15.29.KS1

Hình PH.10

Phổ tử ngoại của kháng sinh 15.29.KS2

Hình PH.11

Phổ tử ngoại của kháng sinh 15.29.KS3

Hình PH.12

Phổ khối của kháng sinh 15.29.KS1

Hình PH.13

Phổ khối của kháng sinh 15.29.KS2

Hình PH.14

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 15.29.KS1

Hình PH.15

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 15.29.KS2

Hình PH.16

Phổ hồng ngoại của kháng sinh 15.29.KS3

Hình PH.17

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của kháng sinh 15.29.KS2


ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát minh ra kháng sinh được coi là một trong những thành tựu khoa học
lớn nhất của con người trong thế kỷ XX, giúp cứu sống hàng triệu người khỏi các căn
bệnh do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên, hiện nay một thực trạng đang nhận được sự quan
tâm cấp thiết trên toàn cầu đó là tình trạng “Đề kháng kháng sinh”. Theo CDC, mỗi
năm tại Hoa Kỳ có ít nhất 2 triệu người bị nhiễm vi khuẩn có khả năng kháng thuốc
kháng sinh và ít nhất 23.000 người tử vong mỗi năm do hậu quả trực tiếp của tình
trạng này [24]. Một nghiên cứu lâm sàng tại Oxford năm 2013 cho biết, tỷ lệ vi khuẩn
Escherichia coli kháng với kháng sinh carbapenem đã đạt mức cao. Trong số 26 nước
báo cáo thì tỷ lệ kháng cao nhất tại Ấn Độ 11%, Việt Nam đứng thứ 2 là 9%, sau đó
đến Bulgaria. Tỷ lệ vi khuẩn này kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 lên đến
hơn 60%. Colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng cho nhiễm trùng đe dọa tính mạng do
Enterobacteriaceae kháng carbapenem nhưng hiện tượng kháng colistin gần đây đã
được phát hiện ở một số nước và khu vực và nó đồng nghĩa với việc bệnh nhân sẽ tử
vong do không có thuốc điều trị [25], [31].
Với tình hình đó, thách thức đặt ra cho các nhà khoa học trong cuộc chiến
chống lại các vi khuẩn kháng thuốc là công cuộc tìm kiếm các loại kháng sinh mới, cải

tạo, nâng cao khả năng kháng khuẩn của kháng sinh.
Chi xạ khuẩn Streptomyces có nhiều loài xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
các kháng sinh đa dạng về cấu trúc và hoạt tính kháng khuẩn cao. Do đó, tại bộ môn
Vi sinh - Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội tôi chọn đề tài: “ Góp phần nghiên
cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29” với những mục tiêu:
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hoạt tính kháng sinh.
- Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh.
- Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được.

1


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Năm 1928, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp Petri nuôi Staphylococcus
bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vô khuẩn xuất
hiện xung quanh khuẩn lạc nấm. Năm 1929, ông sử dụng tên giống nấm Penicillium
để đặt tên cho chủng kháng sinh penicilin này, nhưng chưa thể chiết tách được. Năm
1940, Howard Walter Florey và Ernst Boris Chain đã chiết xuất thành công penicilin.
Năm 1943, penicilin được áp dụng vào điều trị. Sau đó, nhiều kháng sinh đã được tìm
ra. Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men sản xuất kháng
sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con đường tổng hợp và bán tổng hợp cũng dần
phát triển [4], [32].
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh.
Định nghĩa được coi là tương đối hoàn chỉnh: “Kháng sinh là những sản phẩm
nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao có

tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định
(vi khuẩn, nấm,…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp” [9].
1.1.3. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh, cách phân loại thường dùng nhất: Dựa vào
cấu trúc hóa học, chia kháng sinh thành các nhóm chính sau:
- Nhóm β-lactam:
+ Penicilin: benzylpenicilin, oxacilin, ampicilin,…
+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor,…
+ Các β-lactam khác: carbapenem, chất ức chế β-lactamase,…
- Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin,…
- Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin,…
- Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin,…
2


- Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol,…
- Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin,…
- Nhóm peptid:
+ Glucopeptid: vancomycin,…
+ Polypeptid: polymicin, bacitracin,…
- Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, lovofloxacin,...
- Nhóm Sulfonamid: sulfamethoxazol - trimethoprim [3].
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh:
- Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: β-lactam, vancomycin,...
- Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: cloramphenicol,
macrolid, tetracyclin,...
- Ức chế tổng hợp acid nhân: quinolon, rifampicin.
- Ức chế chuyển hóa: sulfamethoxazol- trimethoprim.
- Thay đổi tính thấm của màng tế bào: polymycin, amphotericin [3].
1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh:

Thuốc kháng sinh đặc biệt quan trọng như các chất kháng khuẩn cho hóa trị.
Một số lượng lớn các bệnh do vi khuẩn đã được kiểm soát bằng cách sử dụng thuốc
kháng sinh. Chúng bao gồm viêm phổi, dịch tả, bệnh lao và bệnh phong,...
Griseofulvin kháng sinh kháng nấm đã kiểm soát các bệnh nấm da gây suy nhược như
sâu vòng. Một số loại kháng sinh được sử dụng để kiểm soát sự phát triển của các tế
bào ung thư, ví dụ: actinomycin D, mitomycin C,... Ngoài việc dùng làm thuốc kháng
sinh, còn có một số ứng dụng kháng sinh khác.

• Kháng sinh bảo quản thực phẩm:
Một số thuốc kháng sinh được sử dụng trong ngành công nghiệp đóng hộp (ví
dụ: chlortetracycline) để bảo quản cá, thịt và gia cầm (ví dụ: Pimancin nisin).

• Thuốc kháng sinh dùng trong thức ăn chăn nuôi và thuốc thú y:
Thời gian trước, thuốc kháng sinh (tetracycline,...) được sử dụng rộng rãi trong
chế biến thức ăn chăn nuôi. Việc sử dụng bừa bãi này dẫn đến sự gia tăng tình trạng
kháng kháng sinh ở động vật và người. Hiện nay, các kháng sinh mới đã được phát
triển để sử dụng cụ riêng trong thức ăn chăn nuôi (ví dụ: enduracidin, tylosin) hay
trong thú y (ví dụ: hygromycin B, thiostrepton, salinomycin).
3


• Kháng sinh để kiểm soát bệnh cây trồng:
Trong những năm gần đây, một số kháng sinh chỉ sử dụng để kiểm soát các
bệnh cho cây trồng, ví dụ: blasticidin, tetranactin, polyoxin.

• Kháng sinh là công cụ trong sinh học phân tử:
Một số thuốc kháng sinh có thể ức chế chọn lọc một số phản ứng sinh học nhất
định ở cấp độ phân tử. Những loại thuốc kháng sinh này thực tế đóng vai trò là công
cụ để khám phá kiến thức về khoa học đời sống. Do đó, một số kháng sinh đã được sử
dụng để thu thập một số thông tin quan trọng về sao chép ADN, phiên mã và dịch mã

[9], [17].
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Được giới thiệu ở hình PH.1 phần phụ lục [14], [17].
1.2.

Đặc điểm xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố

rộng trong tự nhiên (đất, nước, bùn…). Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ
khuẩn.
Đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh,
thuộc nhóm VK Gr (+), có tỷ lệ G + C > 55% [18].
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phát triển thành dạng sợi phân nhánh.
Hệ sợi của xạ khuẩn Streptomyces chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí
sinh. Khuẩn ty của xạ khuẩn thường không có vách ngăn, không tự đứt đoạn, đường
kính 0,3 –2,0 µm, màu sắc rất phong phú: da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng,
xám,...[13], [18].
- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm
nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng.
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì
dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh. Sau một thời gian phát triển,
trên đỉnh của khuẩn ty khí sinh xuất hiện chuỗi bào tử.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình tròn, bầu dục, hình que,
hình trụ,… Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có gai hoặc có tóc.
4


Khuẩn lạc xạ khuẩn: tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành
khuẩn lạc xạ khuẩn. Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp, dạng

phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc đường tròn
đồng tâm,… [6], [18].
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn
Thành tế bào xạ khuẩn: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20 nm. Thành tế
bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I chứa L-ADP (L-diaminopimelic acid)
và glycin.
Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5- 10,0 nm. Thành phần chính là protein và
phospholipid. Chức năng: là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan trong nước, là nơi
mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp.
Tế bào chất: chứa mesosom và các vật thể ẩn nhập bên trong như hạt phosphat,
hạt polysaccharid [18].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng
Streptomyces thuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tốt nhất 22 320C, pH tốt nhất 6,5 - 7,5.
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển chúng phân
giải các hydratcarbon làm nguồn dinh dưỡng, đồng thời thủy phân các hợp chất như
gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit [13], [18].
1.2.4. Phân loại xạ khuẩn
Nhiều khoá phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học trên thế giới xây
dựng: Waksman, Krassilnhikov, Gauze,…
Phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces theo khoá phân loại ISP của
E.B.Shirling & Gottlieb được sử dụng rộng rãi, khoá phân loại dựa vào các đặc trưng:
- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí
sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả
năng sử dụng các nguồn đường [5], [18].

5


Ngày nay, người ta cũng thường sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S

rADN để phân loại Streptomyces. Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin cậy
[6], [18].
1.2.5. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều kháng
sinh có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau. Bảng PB.1 giới thiệu một
số chất kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces [6], [13], [21], [30].
1.3.

Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh
Đề phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh ra chất kháng sinh, người ta phải lấy

mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng
gia cầm, gia súc, bùn, nước ở sông hồ,... Sau đó, đem các mẫu trên đi phân lập thuần
khiết những vi sinh vật sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng các phương pháp đặc
trưng và trên các môi trường chọn lọc.
Các phương pháp phân lập: Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch;
phương pháp cấy trực tiếp đất lên bề thạch chứa sẵn VSV kiểm định; phương pháp
thêm kháng sinh vào môi trường phân lập; phương pháp phân lập VSV sinh kháng
sinh chống ung thư [9].
1.4.

Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn
Mục đích:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt hơn, rút

ngắn thời gian lên men,…
- VSV chỉ tạo 1 sản phẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho tách chiết và tinh chế.
- Tạo ra biến chủng ít tích tụ các sản phẩm không mong muốn.
- Sinh tổng hợp các chất mới với tác dụng mới [4], [9].

1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV luôn có các biến dị tự nhiên với tần số khoảng 10-10 - 10-5 trong ống
giống thuần khiết, có các cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 10 - 20% cá thể khác.
Cần phải chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [9].

6


1.4.2. Đột biến cải tạo giống
Chọn lọc tự nhiên chưa đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp, cần thiết phải
dùng đến các phương pháp đột biến nhân tạo.
Các tác nhân đột biến bao gồm:
- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hoá khác. Khả

năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào bước sóng, cường độ, khoảng cách
và thời gian chiếu ánh sáng UV.
- Tác nhân hoá học: Nitrozoguanidin, HNO2, ethylenimin,…
- Tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động.

Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, phải tiến
hành đột biến bậc thang kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp
cận hữu tính, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.
Sau khi đột biến bằng các tác nhân trên với liều lượng và thời gian thích hơp
hầu hết các VSV sẽ chết. Trong số các biến chủng sống sót sẽ có sự đột biến gene, làm
thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm
tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương
tính) [9], [22].
1.5.

Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị

biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ.
Các phương pháp bảo quản: bảo quản lạnh, bảo quản lạnh sâu, phương pháp
đông khô, phương pháp cấy truyền giữ giống, làm khô [9], [16].
1.6.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.6.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm tích
luỹ các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần tế bào.
Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh trưởng
của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng [6], [9], [17], [18].

7


1.6.2. Các phương pháp lên men
1.6.2.1.

Lên men bề mặt

VSV được nuôi cấy trên bề mặt dịch thể hoặc bề mặt bán rắn, hấp thu các chất
dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp.
Yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng và không quá sâu (5 – 10
cm).
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện; trang thiết bị đơn giản; dễ xử lý cục bộ.
Nhược điểm: Hiệu suất sử dụng trường không gian thấp; khó giữ vô trùng; khó

cơ giới hoá, tự động hoá; tốn diện tích, tốn nhân công [4], [9], [16].
1.6.2.2.

Lên men chìm

Là phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men bình phản ứng sinh
học, trong điều kiện sinh lý tốt nhất, VSV phát triển cả 3 chiều.
Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ
cần chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường.
Các phương pháp lên men chìm: lên men mẻ, lên men bán liên tục, lên men liên
tục, lên men có bổ sung [4], [9], [16].
1.6.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
PH môi trường: Ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp của VSV
thông qua tác dụng trực tiếp của ion H+ hay OH– đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực
của enzym hoặc tác dụng gián tiếp.
Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng, kiểu sinh sản, hình thái,
trao đổi chất, nhu cầu dinh dưỡng của VSV. Nhiệt độ thấp VSV không phát triển, nhiệt
độ cao VSV bị chết do biến tính protein và ADN. Vì vậy, thiết bị lên men cần có bộ
phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất cho VSV.
Độ hoà tan oxy và thông khí: Thiếu oxy sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào,
phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hoà tan oxy đáp ứng được với tốc độ sử dụng oxy
của VSV.

8


Như vậy, trong sản xuất cần nghiên cứu kỹ các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình
lên men để tối hoá các điều kiện tạo thuận lợi cho sinh tổng hợp các chất mong muốn

[4], [9], [16].
1.7.

Chiết tách, tinh chế kháng sinh

1.7.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đóng vai trò rất quan trọng vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường
kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp. Để thu được
kháng sinh có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp [9],
[14].
1.7.2. Phương pháp chiết xuất
Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình chuyển
chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha lỏng không
đồng tan (1 pha là nước, 1 pha là DMHC).
Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau.
Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng chiết lỏng - lỏng
theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng. Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế bào nên
tiến hành chiết lỏng rắn [16].
1.7.3. Phương pháp tinh chế
Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng chất.
Phương pháp bao gồm: Chiết, thẩm thấu, sắc ký [2], [15].
Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động
chạy qua pha tĩnh, phát hiện vết cần tách.
Nguyên lý tách: Mẫu phân tích hòa tan trong pha động (thường là dòng chảy
dung môi), pha động được di chuyển qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn
với nó, các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ tùy thuộc sự tương
tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan nên các thành phần sẽ được tách riêng biệt thành
dải trên sắc ký đồ nhờ tốc độ di chuyển khác nhau.
Một số phương pháp sắc ký thường dùng:

• Sắc ký lớp mỏng:
+

Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp
9


phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ).
+

Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf:
Rf =

𝑑𝑣
𝑑𝑑𝑚

Trong đó: dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
ddm: Khoảng cách dung môi chạy.
Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của
dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
• Sắc ký cột:
Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các
chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng
trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi
thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm
liên tục một lượng mới của pha động [2], [6], [9], [15].
1.8.

Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh

1.8.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại (IR) là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ
bức xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau [2], [29].
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ bức xạ hồng ngoại làm
tăng các dao động sẵn có của nhóm nguyên tử đó sẽ tạo nên một dải hấp thụ trên phổ
IR với các pic đặc trưng, được sử dụng để nhận dạng các nhóm chức đặc biệt trong
phân tử và định tính bằng cách so sánh với phổ chuẩn [2], [34].
1.8.2. Phổ tử ngoại - khả hiếm (UV - VIS)
Phổ UV - VIS là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào
bước sóng hay số sóng. Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại làm thay đổi mức năng
lượng của các electron từ trạng thái cơ bản E0 lên trạng thái kích E1, E2,…
Phổ UV - VIS được sử dụng để định tính bằng cách so sánh với phổ của chất
chuẩn đã có sẵn (về vị trí cực đại, cực tiểu và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng
đó), tuy nhiên phổ UV - VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu trúc nên vẫn thường sử
dụng phổ IR để xác định cấu trúc [2], [34].

10


1.8.3. Phổ khối (MS)
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion được thể
hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp lại thành phổ khối (MS)
[2], [34].
1.8.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân được xem là một phương pháp ưu việt áp dụng vào
việc nghiên cứu, biện giải và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Có rất nhiều hạt
nhân được nghiên cứu nhưng Hydro và Carbon là phổ biến nhất [2], [34].

Phối hợp các phương pháp trên để biện giải cấu trúc kháng sinh.
1.9.

Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces

1.9.1. Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn Streptomyces:
phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học
Tunicamycin là một kháng sinh nucleotid được phân lập từ dịch lên men chủng
Streptomyces T - 4. Theo đặc điểm hình thái học, sinh lý, sinh hoá và phân tích chuỗi
16S rADN chủng T - 4 được xác định là Streptomyces torulosus. Trong các thử
nghiệm in vitro, nó chống lại một số vi sinh vật gây bệnh như: Staphylococcus aureus
NCTC 7447; Micrococcus lutea ATCC 9341; Bacillus subtilis NCTC 10400; Bacillus
pumilus NCTC; Klebsiella pneumonia NCIMB 9111; Escherichia coli NCTC 10416;
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145; Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763;
Candida albicans IMRU 3669; Aspergillus flavus IMI 111023; Aspergillus niger IMI
31276; Aspergillus fumigatus ATCC 16424.
Phương tiện sản xuất được tối ưu hóa để cho sản lượng tối đa của chất chuyển
hóa thứ cấp. Điều kiện lên men: Thời gian nuôi cấy 5 ngày, ở pH 7,0, nhiệt độ 350C,
glucose là nguồn carbon chính, KNO3 là nguồn nitơ chính. Vi sinh vật kiểm định đại
diện cho vi khuẩn Gr(+), Gr(-) và nấm. Các chất chuyển hóa được chiết xuất bằng nbutanol (1:1, v/v) ở pH 7,0 sau đó bốc hơi dưới áp suất giảm và cất quay thu được tinh
thể màu vàng. Sau đó, tách riêng các thành phần bằng SKLM với hệ DM chloroform 11


methanol (24 - 1, v/v) và sắc ký cột với chất nhồi cột là sillicagel, DM chạy cột là hệ
chloroform - methanol (10 - 2, v/v). Xác định được một chất có Rf = 0,55. Tiến hành
phân tích tiếp xác định được nhiệt độ nóng chảy và phân tử khối của kháng sinh là
2350C và 865 đvC, phổ UV cho đỉnh hấp thụ cực đại tại 260 nm, phổ IR có 26 đỉnh.
Công thức được xác định là C38H62N4O16 và được xác nhận rằng hợp chất được sản
xuất bởi Streptomyces torulosus, T - 4 là kháng sinh Tunicamycin [28].
1.9.2. Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một Streptomycete có sắc tố khuyếch tán

màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam
Một xạ khuẩn được đặt tên là GIMV4.0001, được phân lập từ mẫu đất rừng tại
Việt Nam. Chúng tạo ra các sợi khuẩn ty khí sinh có màu trắng và sắc tố khuếch tán
màu xanh tím trên môi trường thạch tổng hợp của Gauze. Màu sợi nấm bề mặt không
nhạy cảm với pH. Quan sát chuỗi bào tử chủng GIMV4.0001 dưới kính hiển vi thấy
chuỗi bào tử thẳng, dài, hình trụ, và thông tin về hoá định dạng khẳng định rằng chủng
này thuộc các chi Streptomyces. Chủng có sinh sắc tố melanoid nhưng không có hoạt
tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis,
Candida albicans hoặc Penicillium citrinum. Phân tích trình tự gen 16S rADN của
chủng GIMV4.0001 cho thấy chủng có sự tương đồng cao nhất (99,4%) là
Streptomyces bikiniensis ATCC 11062. Tuy nhiên, sự liên quan DNA - DNA giữa
chủng GIMV4.0001 và S. bikiniensis ATCC 11062 được tìm thấy chỉ là 50,3%.
Chủng GIMV4.0001 cũng có thể được phân biệt với S. bikiniensis ATCC 11062 (T) và
các loài Streptomyces có trình tự gen 16S rADN giống nhau cao (98 – 99%) dựa trên
đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá. Trên cơ sở tính chất sinh lý và phân tử của nó,
rõ ràng là chủng GIMV4.0001 đại diện cho một loài mới thuộc chi Streptomyces, mà
tên Streptomyces vietnamensis sp. Nov được đề xuất. Loại chủng là GIMV4.0001 (=
CCTCC M 205.143 = IAM 15.340) [33].

12


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Nguyên vật liệu

❖ Chủng xạ khuẩn: Giống xạ khuẩn Streptomyces 15.29 có HTKS mạnh nhất
được lưu sau đề tài nghiên cứu năm 2014, do bộ môn Vi sinh - Sinh học trường Đại
học Dược Hà Nội cung cấp [23].
❖ Giống VK kiểm định: Các chủng VK kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh
học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được giới thiệu ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chủng VK kiểm định
Vi khuẩn Gr(+)

Vi khuẩn Gr(-)

Staphylococcus aureus ATCC 1228

Proteus mirabilis BV 108

❖ Môi trường nuôi cấy:
- Các môi trường nuôi cấy VK kiểm định giới thiệu ở bảng 2.2.

Bảng 2.2.Các môi trường nuôi cấy VK kiểm định
Thành phần
MT
Canh thang
Thạch
thường

NaCl
(g)
0,5
0,5

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước

(g)

(g)

(g)

(ml)

0,3

0,5

0

100 (vđ)

0,3

0,5

1,6 - 1,8

100 (vđ)

- Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn giới thiệu ở bảng 2.3.

13

pH

7,0 - 7,4


Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần (g)
Tinh bột

MT1

MT2

2

2

MT5
2,4

Glucose

1

Bột đậu tương

1,5

Cao thịt

0,3

Pepton

0,5

KNO3

0,1

KCl

0,05

NaNO3

0,2

CaCO3

0,4

K2HPO4

0,05

0,1

MgSO4.7H2O

0,05

0,05

NaCl

0,05

Thạch

1,8

2

2

Nước vđ (ml)

100

100

100

pH

5

- Các môi trường dịch thể (MTdt): Thành phần tương ứng như MT nuôi cấy xạ

khuẩn nhưng không có thạch.
• Chú ý: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, nuôi cấy VK kiểm định, môi
trường lên men được tiệt trùng ở 118 – 1200C trong 30 phút.
❖ Dung môi: Các dung môi đã được sử dụng được giới thiệu trong bảng PB.2
phần phụ lục.
❖ Hoá chất: Các hoá chất đã sử dụng được giới thiệu ở bảng PB.3 phần phụ
lục.
❖ Vật liệu chạy sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
- Dung môi chạy sắc ký: các dung môi bảng PB.2 phần phụ lục, được pha

thành hỗn hợp DM.
14


- Bình chạy sắc ký, buret 50 ml, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,040 -

0,063 mm.
2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ
- Đèn UV (λ = 254 nm), nguồn phát Toshiba 15 W, điện thế 220 V.
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030, nồi hấp vô trùng ALP KT-

2346.
- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121S.
- Tủ ấm Menmert, Binder. Tủ lạnh Deawoo, Sanyo. Tủ cấy vô trùng Aura VF

48, tủ sấy SL Shellab, tủ cấy Sanyo MCV- 711ATS (T).
- Máy lắc Taitec Bio - Shaker BR 300Lf.
- Máy đo UV - VIS Hitachi U - 1900, máy đo phổ MS - Xevo TQMS, máy đo

phổ IR Impact 410 - NicoLet.
- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm.
- Đĩa Petri, buret, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, cốc có mỏ, que

cấy, đèn cồn, đũa thuỷ tinh, kim mũi mác, ống đục thạch, que chang, giấy lọc, giấy thử
PH, bông,...
2.2.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống
- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất.
- Đột biến bằng ánh sáng UV, tác nhân hoá học HNO2 để nâng cao HTKS của

Streptomyces 15.29.
2.2.2. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh
- Từ các biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng có khả năng lên men tạo

kháng sinh mạnh nhất tiến hành lên men sinh tổng hợp kháng sinh.
- Tách kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ.
- Chạy SKLM, sắc ký cột để tinh chế kháng sinh.

2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được
- Xác định một số đặc điểm vật lý: màu sắc, hình dạng bột kháng sinh.
- Xác định: Nhiệt độ nóng chảy, đo phổ IR, phổ UV, phổ MS, phổ NMR.

- Biện giải các phổ thu được.

15