Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu quy trình nhân dòng vô tính dã yên thảo rủ tím đỏ mắt đen (petunia purple black eye) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.34 MB, 47 trang )
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
---------------------
NGUYỄN THỊ HỒNG LUẬN
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN DỊNG
VƠ TÍNH DÃ YÊN THẢO RỦ TÍM ĐỎ MẮT ĐEN
(PETUNIA PURPLE BLACK EYE) BẰNG KĨ
THUẬT NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
HÀ NỘI – 2018
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
---------------------
NGUYỄN THỊ HỒNG LUẬN
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN DỊNG
VƠ TÍNH DÃ YÊN THẢO RỦ TÍM ĐỎ MẮT ĐEN
(PETUNIA PURPLE BLACK EYE) BẰNG KĨ
THUẬT NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: ThS. PHẠM PHƢƠNG THU
HÀ NỘI – 2018
LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Ths. Phạm Phƣơng Thu - Khoa
Sinh - KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của thầy TS. La Việt Hồng - Khoa Sinh KTNN, cô Mai Thị Hồng - Phịng
thí nghiệm Sinh lý thực vật, đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề
tài khóa luận, nhân đây tơi cũng xin chân thành cảm ơn.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo
mọi điều kiện để tôi hồn thành khóa luận này.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phịng thí nghiệm Sinh lí
thực vật, Phịng thí nghiệm Thực vật - Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, phương tiện để tơi hồn thành khóa luận
này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã ln động viên, góp ý kiến cho tơi trong
q trình hồn thành đề tài.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Hồng Luận
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa ai công bố.
Hà Nội, ngày
tháng năm 2018
Sinh viên
NGUYỄN THỊ HỒNG LUẬN
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn............................................................... 2
NỘI DUNG............................................................................................................ 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3
1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrid).............................................. 3
1.1.1. Vị trí, phân loại ........................................................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 3
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố ................................................................................. 4
1.1.4. Các loại Dã yên thảo ................................................................................ 4
1.1.5. Kĩ thuật trồng và chăm sóc cây Dã yên thảo ........................................... 7
1.1.5.1. Chuẩn bị nhà che .............................................................................. 7
1.1.5.2. Chuẩn bị đất ...................................................................................... 7
1.1.5.3. Phân bón ........................................................................................... 7
1.1.5.4. Nước tưới .......................................................................................... 8
1.1.5.5. Chăm sóc ........................................................................................... 8
1.1.5.6. Các bệnh thường gặp của Dã yên thảo ............................................ 8
1.1.6. Những thuận lợi, khó khăn khi trồng Dã yên thảo ở nước ta .................. 9
1.1.6.1. Thuận lợi ........................................................................................... 9
1.1.6.2. Khó khăn ........................................................................................... 9
1.2. Sơ lược về nhân giống vơ tính in vitro.......................................................... 10
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vơ tính in vitro .............. 10
1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính ......................... 10
1.2.2.1. Ưu điểm ........................................................................................... 10
1.2.2.2. Nhược điểm ..................................................................................... 11
1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới................... 11
1.3.1. Trên thế giới ........................................................................................... 11
1.3.2. Trong nước ............................................................................................. 12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 13
2.1. Đối tượng, hóa chất, thiết bị .......................................................................... 13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 13
2.1.2. Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 13
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................. 13
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .......................................................... 13
2.3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 13
2.3.1.1. Thí nghiệm 1. Tạo vật liệu in vitro từ chồi cây hoa Dã yên thảo ... 13
2.3.1.2. Thí nghiệm 2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo
cụm chồi in vitro................................................................................................... 14
2.3.1.3. Thí nghiệm 3. Tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro ............................... 16
2.3.1.4. Thí nghiệm 4. Rèn luyện cây Dã n thảo in vitro ngồi mơi trường
tự nhiên ................................................................................................................. 16
2.3.2. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................... 17
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 18
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ chồi cây Dã yên thảo hoa rủ tím đỏ mắt đen
.............................................................................................................................. 18
3.2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in vitro ....... 20
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên thảo ... 21
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây
Dã yên thảo........................................................................................................... 22
3.3. Tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro ..................................................................... 25
3.4. Rèn luyện cây Dã n thảo in vitro ngồi mơi trường tự nhiên.................... 30
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 35
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 36
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BAP
:
6-Benzylaminopurine
NAA
:
1-naphthaleneacetic acid
MS
:
Murashige & Skoog
KH & CN
:
Khoa học và công nghệ
Nxb
:
Nhà xuất bản
ĐC
:
Đối chứng
CT
:
Công thức
TDZ
:
1-phenyl-3
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các cơng thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng ....... 14
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên
thảo ....................................................................................................................... 15
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi
cây Dã yên thảo. ................................................................................................... 15
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nồng độ α - NAA và nước dừa đến sự tạo rễ và chiều
cao chồi cây Dã yên thảo in vitro ......................................................................... 16
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng đối với chồi cây hoa Dã yên thảo ........................ 19
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Dã yên thảo.. 21
Bảng 3.3.. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi
cây Dã yên thảo .................................................................................................... 22
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của α - NAA và nước dừa đến sự hình thành rễ ở cây Dã
yên thảo ................................................................................................................ 26
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành rễ và sự sinh trưởng cây
Dã yên thảo........................................................................................................... 27
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể tới rèn luyện cây ngoài tự nhiên..................... 30
Bảng 3.7. Kết quả rèn luyện cây Dã yên thảo ở tuần 1, tuần 2, tuần 3, tuần 4 .... 31
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Dã n thảo rủ tím đỏ mắt đen (petunia purple black eye) ..........................3
Hình 1.2. Dã yên thảo đơn .................................................................................... 5
Hình 1.3. Dã yên thảo kép ..................................................................................... 6
Hình 1.4. Dã n thảo biển sóng ........................................................................... 7
Hình 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Dã yên thảo 19
Hình 3.2. A - mẫu chồi Dã yên thảo sử dụng để tạo vật liệu khởi đầu; B - Mẫu
Dã yên thảo sạch sau 7 ngày ni cấy ................................................................ 20
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh từ chồi cây hoa
Dã yên thảo.......................................................................................................... 21
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến hệ số nhân nhanh từ chồi
cây hoa Dã yên thảo ............................................................................................ 23
Hình 3.5 Cụm chồi Dã yên thảo sau 4 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ sung BAP ... 24
Hình 3.6. Mẫu chồi Dã yên thảo sau 4 tuần ni cấy trên mơi trường có bổ BAP và
Kinetin. ................................................................................................................ 25
Hình 3.7. Mẫu chồi Dã yên thảo bổ sung nước dừa sau 4 tuần nuôi cấy ............................ 28
Hình 3.8. Tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro................................................................................. 29
Hình 3.9. Tỷ lệ sống của cây Dã yên thảo giai đoạn rèn luyện ............................................ 32
Hình 3.10. Dã yên thảo giai đoạn rèn luyện. A - Dã yên thảo trồng ngồi ............... 33
Hình 3.11. Quy trình nhân dịng cây hoa Dã yên thảo rủ tím đỏ mắt đen in vitro.............. 34
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, phong trào chơi hoa và cây cảnh là một thú vui tao nhã và
ngày càng trở thành nhu cầu lớn của người dân. Nó góp phần làm đẹp cảnh
quan các ngơi nhà, tạo ra cây xanh điều hịa dưỡng khí khiến cho “lá phổi
xanh” của thành phố to thêm. Đối với những người chơi hoa và cây cảnh việc
chăm sóc chúng hằng ngày giúp họ thư giãn, sảng khối tâm hồn vì ln được
đắm chìm vào thiên nhiên, cỏ cây hoa lá. Với những người có tuổi thì việc
chăm sóc những chậu hoa cây cảnh giúp họ thêm yêu thiên nhiên, yêu đời và
tăng tuổi thọ.
Khi mức sống từng bước được nâng cao thì nhu cầu thưởng thức cái
đẹp của người dân càng lớn. Vì vậy, nghề trồng hoa cũng đang phát triển
mạnh không những đem lại giá trị kinh tế cao mà cịn trang trí cho ngơi nhà
đẹp hơn đồng thời giúp cho môi trường thêm trong lành sạch đẹp [8]. Với
những ngơi nhà có ưu thế về diện tích thì việc dành khoảng sân vườn để trồng
hoa sẽ tạo nên không gian tươi mát giúp thư giãn tâm hồn, tuy nhiên, với
những ngơi nhà có diện tích nhỏ thì xu hướng tận dụng góc ban cơng để tạo
nên “phong cảnh đẹp” cho ngơi nhà của mình ngày càng được ưa chuộng
[16]. Một trong những lồi hoa đẹp thích hợp dùng để trang trí ban cơng là
hoa Dã n thảo, nó khá bắt mắt bởi có hoa to, nhiều màu sắc, hương thơm
dịu nhẹ tạo cảm giác quý phái. Do đó, Dã n thảo được mệnh danh là “nữ
hồng ban cơng” về sắc đẹp [4]. Dã yên thảo dễ trồng, sai hoa, nếu chăm sóc
tốt có thể cho hoa quanh năm, đem lại giá trị kinh tế cao [6].
Hoa Dã yên thảo du nhập vào nước ta hiện nay chủ yếu là nhân giống
bằng hạt. Tuy nhiên, hạt của dã yên thảo nhỏ và rất chậm để xử lí nhân giống
bằng hạt. Đối với nhân giống bằng cành thì hệ số nhân thấp, không đồng đều
nên chưa đáp ứng được nhu cầu trồng cây với số lượng lớn. Trong khi đó,
1
nuôi cấy mô là biện pháp hiệu quả để nhân nhanh giống, đang được áp dụng
phổ biến để tạo ra số lượng lớn cây con chất lượng cao, không nhiễm bệnh và
chất lượng đồng đều [7].
Vì vậy, để tạo ra sản phẩm cây giống đồng đều khỏe mạnh, số lượng
lớn, tiết kiệm chi phí chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy
trình nhân dịng vơ tính Dã yên thảo rủ tím đỏ mắt đen (petunia purple black
eye) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình nhân dịng vơ tính Dã yên thảo rủ tím đỏ mắt đen
(petunia purple black eye) in vitro.
3. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài khảo sát ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng BAP,
BAP và Kinetin, α - NAA, nước dừa trong phịng thí nghiệm và tỉ lệ sống sót
của cây khi đưa ra ngoài vườn thực nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Góp phần bổ sung dẫn liệu nghiên cứu về quy trình
nhân dịng vơ tính cây Dã n thảo rủ tím đỏ mắt đen in vitro.
- Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu ra quy trình nhân giống cây Dã n
thảo rủ tím đỏ mắt đen với số lượng lớn, đồng đều, có hiệu quả cao và chất
lượng tốt.
2
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrid)
1.1.1. Vị trí, phân loại
Giới
: Plantea (Thực vật)
Ngành
: Magnoliophyta
Lớp
: Magnoliopsida
Bộ
: Solanales
Họ
: Solanaseae
Giống
: Petunia
Tên khoa học : Petunia hybrid
Tên Việt Nam : Dạ yên thảo, Dã n thảo
Hình 5.1. Dã n thảo rủ tím đỏ
mắt đen (petunia purple black eye)
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Dã yên thảo là cây thân thảo lâu năm, cao khoảng 15 - 30 cm. Thân
thẳng đứng và mọc theo chiều ngang, có lông mịn bao quanh, phân nhánh từ
các nách lá. Lá đơn, ở phần thân trên mọc đối xứng nhau, phần giữa thân mọc
xen kẽ nhau, phiến lá hình bầu dục trịn, ngọn lá nhọn, có màu xanh thẫm, mặt
trên và dưới của lá có phủ lớp lơng mịn [2].
Hoa Dã yên thảo mọc đơn lẻ trên đỉnh nhánh hoặc tại nách lá, có màu
sắc rất đa dạng, thường ra hoa vào tháng 5 - 11. Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu
nhụy gắn ở phần dưới của ống vành. Hoa Dã n thảo ngun thủy có hình
phễu, tuy nhiên sự lai tạo đã cho nhiều dạng hoa khác nhau như: hoa cánh
đơn, hoa cánh kép mép có viền và gợn sóng với nhiều màu sắc khác nhau như
đỏ tía, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng [12].
Dã yên thảo là cây ưa sáng, nở hoa vào mùa hè thu. Dã yên thảo sẽ trở
nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với khí hậu nóng
3
ẩm, điều kiện độ ẩm vừa phải, có thể sống trong điều kiện hơi khơ nhưng
khơng thích ứng với điều kiện ngập úng, không chịu được nhiệt độ quá lạnh
hay quá nóng. Dã yên thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt
nhất là đất màu mỡ. Khi thân cây dài ra bấm ngọn sẽ kích thích cây đâm
nhánh nhiều hơn tạo độ rủ cho cây, nếu cây ốm yếu hay sau khi cho hoa rộ thì
cũng nên tỉa lá bớt, cắt bỏ cành già để cây phục hồi lại.
Do Dã yên thảo không sống được trong điều kiện ngập úng, vì vậy cần
tưới nước đúng liều lượng, không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và
nụ, thường xun duy trì độ ẩm thích hợp cho cây. Ngoài ra, Dã yên thảo
thường bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắn
phá. Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến cây như làm biến dạng lá, cây
chậm phát triến, hoa khơng có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi liên tục
nên cần ngắt bỏ những cành bị bệnh để tránh lây nhiễm đồng thời có các biện
pháp pháp chăm sóc thích hợp [3].
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Hoa Dã yên thảo thuộc chi 35 của một lồi thực vật có hoa, liên quan
chặt chẽ với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae).
Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, hiện nay Dã yên thảo đã phổ
biến khắp thế giới với hàng trăm giống lai. Ở miền bắc Việt Nam, hoa nở vào
dịp hè thu, còn ở miền nam, hoa nở vào dịp Tết. Ngoài ra, tại các nhà vườn cịn
có các dạng Dã n thảo hoa kép hay hoa biển sóng rất đẹp [3].
1.1.4. Các loại Dã yên thảo
- Dã yên thảo đơn: Đây là loại đầu tiên được du nhập đến Việt Nam và
cũng là loại phổ biến nhất. Hoa đơn sắc, có hình dáng giống như chiếc loa nhỏ,
hoa nở dày và liên tục nhưng chỉ có 1 lớp cánh, đường kính của hoa lên tới 5 7,5 cm. Cây thân thảo, phát triển bò ngang, chiều dài tối đa được khoảng 80 100 cm, thích hợp trồng trong các chậu treo rủ.
4
Hình 1.6. Dã yên thảo đơn
- Dã yên thảo kép: Tiếp sau Dã yên thảo đơn là sự nhu nhập của Dã yên
thảo kép. Hoa Dã yên thảo kép cũng giống như Dã yên thảo đơn, cùng sở hữu
màu sắc sặc sỡ, bông to. Tuy nhiên, Dã yên thảo kép được đánh giá cao hơn
bởi hoa gồm nhiều lớp cánh xếp chồng lên nhau, 1 bơng hoa có thể gồm 2 - 3
màu hịa trộn, đường kính của hoa có thể lên đến 13 cm. Cây thân bụi và cứng
cáp hơn Dã yên thảo đơn, phát triển thẳng đứng, chiều cao 30 - 50 cm.
5
Hình 1.7. Dã yên thảo kép
- Dã yên thảo biển sóng: Đây là loại hoa Dã yên thảo mới nhất, được
tạo ra do cơng nghệ sinh học, hoa có hình dạng giống như Dã yên thảo đơn,
cây thân leo, cũng phát triển bị ngang nhưng có thể dài đến 5 m. Đây là loại
hoa khỏe nhất trong dòng Dã yên thảo, cây phát triển rất nhanh, vươn dài, hoa
nhiều và có mùi thơm benzene đặc trưng vì trên cây có nhiều tinh dầu. Giống
như cái tên của mình, những cây Dã yên thảo biển sóng trưởng thành cho rất
nhiều hoa, hoa tầng tầng lớp lớp giống như những cơn sóng biển cuộn trào
[15].
6
Hình 1.8. Dã n thảo biển sóng
1.1.5. Kĩ thuật trồng và chăm sóc cây Dã yên thảo
1.1.5.1. Chuẩn bị nhà che
Dã n thảo là lồi cây khơng chịu được mưa nhiều và cường độ ánh
sáng mạnh nên phải trồng cây trong nhà lưới đen, có độ thong thống. Giai
đoạn đầu khi chuyển cây từ môi trường in vitro sang môi trường tự nhiên cây
chưa thích ứng được ngay với điều kiện thời tiết. Vì vậy giai đoạn đầu cần
kiểm sốt đến sự thoát hơi nước của cây bằng cách dùng túi nilon che kín, sau
đó mở túi nilon từ từ để cây thích nghi dần với điều kiện mơi trường mới.
1.1.5.2. Chuẩn bị đất
Đất thịt phải đảm bảo sạch sẽ. Không sử dụng lại đất đã trồng mùa
trước hoặc đất của cây Dã yên thảo đã chết. Đất thịt lấy về tốt nhất là phơi
thật khơ sau đó đập nhỏ. Trấu hun xong có thể trồng trực tiếp ngay hoặc xả
qua nước để bỏ độ mặn.
1.1.5.3. Phân bón
- Phân bón lót: Khi cho bầu cây nhỏ vào chậu sử dụng NPK bón lót của
Lâm Thao. Bón lót giúp cây bén rễ nhanh, cây phát triển xanh tốt.
7
- Phân bón định kì: Sử dụng NPK đầu trâu 13 - 13 - 13. Phân phải dùng
nước hòa tan sau đó tưới, tránh tưới lên lá làm cháy lá. Khơng bón phân hạt
trực tiếp lên chậu. Tưới phân xong tưới nhẹ bằng nước lã tránh phân đọng
trên lá gây hư cây. Bón định kì 5 - 7 ngày/ lần [14].
1.1.5.4. Nước tưới
Lưu ý quan trọng trong quá trình trồng Dã yên thảo là chỉ tưới nước khi
đất bề mặt chậu hơi khô. Dã yên thảo cần nhiều nước nhưng cũng khơng chịu
được úng, vì vậy đất tơi xốp và lỗ thoát nước rất cần thiết cho Dã yên thảo.
Hãy tưới vào mỗi buổi sáng và chỉ nên tưới thêm nếu thấy đất khô. Nhớ rằng,
cây càng lớn hoặc thời tiết càng nắng nóng thì sẽ càng cần nhiều nước tưới.
Mùa nồm ẩm thì khoảng cách tưới ít hơn
Lưu ý: Không nên tưới vào buổi chiều tối để tránh cây bị ướt sung cả
đêm tạo điều kiện cho nấm phát triển. Ta khơng nên tưới định kì, sáng nào
cũng tưới mà phải kiểm tra đất nếu thấy khô ta mới tưới [14].
1.1.5.5. Chăm sóc
- Thường ngắt ngọn khi cây cịn nhỏ để cây gia tăng số lượng mầm.
- Khi cây quá già thực hiện cắt bớt thân ngọn, có thể thay đất hoặc chậu
to hơn, bổ sung chất dinh dưỡng cây sẽ bật mầm lộc dày và trong thời gian
ngắn cây tiếp tục cho nhiều hoa vì cây được trẻ hóa.
- Nhặt lá vàng thường xun khơng để lá thối trong chậu sẽ gây nấm
bệnh cho cây, không nên để đất lấp vào cành của Dã yên thảo.
- Tránh đặt chậu cây nơi có gió lớn, cây hoa dễ bị tổn thương. Tưới
nước với lượng vừa đủ. Trời ẩm không tưới hoặc tưới ít, trời hanh khơ tưới
nhiều hơn [14].
1.1.5.6. Các bệnh thường gặp của Dã yên thảo
- Thối nhũn: Do rất nhiều nguyên nhân như giá thể không tốt, tưới thừa
nước hoặc mưa to, nắng thất thường. Cây gặp vi khuẩn, nấm, virut xâm nhập từ
nhiều đường như đất, nước, khơng khí, dụng cụ làm vườn…
8
- Ngọn, lá vàng:
+ Thiếu Sắt ta phải phun sắt cho chúng.
+ Cây thiếu chất: Dã yên thảo rất ham ăn vì vậy phải cho chúng ăn phân
thường xuyên giúp cây phát triển tốt và tăng khả năng kháng sâu bệnh.
- Lá xoăn: Nhện đỏ gây những đốm đỏ hoặc trắng mặt dưới của lá làm lá
xoăn.
- Bệnh rệp: Cây Dã yên thảo cũng thường bị rệp ấp.
+ Để phòng bệnh rệp tốt nhất là khi mới mua cây giống về nên sử dụng
nước rửa chén pha loãng hoặc nước tỏi, ớt phun đều lên toàn bộ cây.
+ Nếu cây bị rệp có thể diệt rệp bằng các loại thuốc đặc trị theo hướng
dẫn của từng loại thuốc [14].
1.1.6. Những thuận lợi, khó khăn khi trồng Dã yên thảo ở nƣớc ta
1.1.6.1. Thuận lợi
- Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới, có thảm thực vật phong
phú, người dân chủ yếu sống bằng nghề nông, cần cù, chăm chỉ.
- Nghề trồng hoa đã có từ rất lâu, thị trường tiêu thụ hoa ngày càng
được mở rộng có khả năng đem lại lợi nhuận cao cho người nông dân.
- Hiện nay khi mức sống từng bước được nâng cao thì nhu cầu thưởng
thức cái đẹp càng lớn vì vậy nghề trồng hoa càng phát triển mạnh.
1.1.6.2. Khó khăn
- Ở Việt Nam, miền Bắc mùa hè nóng ẩm mưa nhiều, mùa đơng có gió
mùa Đơng Bắc lạnh. Miền Nam quanh năm nóng ẩm. Vì vậy, cây Dã n thảo
dễ bị các bệnh như thối nhũn, nấm,...
- Hiện nay chưa có giống chất lượng cao, thích ứng với điều kiện khí
hậu của từng vùng.
- Sản xuất hoa chưa có quy mơ lớn vẫn còn nhỏ lẻ, các tiến bộ kĩ thuật
trong sản xuất hoa vẫn chưa được áp dụng vì vậy năng suất chưa cao, chất
9
lượng chưa tốt. Đội ngũ cán bộ chưa được đào tạo đầy đủ, vẫn chưa xử lí
được một số bệnh cây mắc phải.
1.2. Sơ lƣợc về nhân giống vơ tính in vitro
Nhân giống vơ tính in vitro là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất
trong cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật. Đây là phương pháp nhân giống
hiện đại được thực hiện trong phịng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp
nhân giống trong ống nghiệm.
Khác với phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành
hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời
gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đồng đều để phủ kín một diện
tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế
được. Ở Việt Nam, hiện nay có nhiều phịng thí nghiệm ni cấy mơ, nhiều
trung tâm sản xuất cây giống cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng
cao cho sản xuất như chuối, dứa,…
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vơ tính in vitro
Đầu thế kỉ XX, người ta khám phá ra rằng, mỗi một tế bào bất kì của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào
đã chun hóa đều chứa một lượng thơng tin di truyền tương đương với lượng
thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất
định một tế bào bất kì đều có thể phát triển thành một cơ thể hồn chỉnh. Đặc
tính đó của tế bào gọi là tính tồn năng của tế bào. Đó cũng là cơ sở khoa học
của kĩ thuật ni cấy mơ tế bào (in vitro) nói chung và kĩ thuật nhân giống vơ
tính nói riêng [5].
1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống vơ tính
1.2.2.1. Ưu điểm
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số
lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây với kích thước nhỏ khoảng
0,1 – 10 mm.
10
- Hồn tồn tiến hành trong điều kiện vơ trùng nên cây giống tạo được
sẽ không bị nhiễm bệnh từ mơi trường bên ngồi.
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn
cây sạch virus.
- Hệ số nhân giống cao nên có khả năng sản xuất số lượng lớn cây
giống trong một thời gian ngắn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà khơng bị chi phối bởi điều kiện ngoại
cảnh của thời vụ [5].
1.2.2.2. Nhược điểm
- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước
nhỏ và đơi khi xuất hiện các dạng cây không mong muốn (biến dị, mọng nước).
- Cây giống in vitro do được cung cấp nguồn hydrat carbon nhân tạo
nên khả năng tự tổng hợp các vật liệu hữu cơ của cây kém. Do đó, khi trồng
cây ra ngồi tự nhiên cây thường bị mất cân bằng, gây hiện tượng cây bị héo
và chết. Vì vậy, trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện tự
nhiên, cây cần trải qua giai đoạn huấn luyện để quen dần với điều kiện môi
trường bên ngồi có độ ẩm khơng khí thấp và ánh sáng mạnh.
- Cần trang thiết bị hiện đại, kĩ thuật viên có tay nghề cao [5].
1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới
1.3.1. Trên thế giới
- Năm 1978, E. G. Kirby và cộng sự của ông đã nghiên cứu sự nảy mầm
trong ống nghiệm của hạt phấn cây Dã yên thảo và cho rằng sự nảy mầm của
hạt phấn trong ống nghiệm sẽ giảm nhanh nếu tẩy rửa bằng nước cất nguội.
Nhưng khi eluted được bổ sung vào mơi trường ni cấy thì khả năng nảy mầm
được phục hồi đáng kể. Nguyên nhân là một phần protein không ổn định nhiệt
(50000 - 100000 daltons) có trách nhiệm khơi phục khả năng nảy mầm [8].
- Năm 1992, Kortessa Dimasi và cộng sự đã nghiên cứu về ảnh hưởng
của ethylene đến sự tái sinh chồi và rễ từ lá của cây Dã yên thảo nuôi cấy mô.
11
Trường hợp làm giảm etylen sản xuất nội sinh bằng cách giảm ethysorb
(KMnO4), chất thấm ethylene thì sẽ làm giảm số lượng chồi. Còn trong
trường hợp bổ sung ethylene (0,01 - 10 ppm) sẽ làm tăng số lượng chồi mà
không có bất kỳ ảnh hưởng nào đến chiều dài và trọng lượng tươi. Ethylene
có nồng độ 10 ppm sẽ gây ra sự hình thành rễ ngẫu nhiên, trong khi ở nồng độ
thấp (0,01 - 1 ppm) nó khơng có ảnh hưởng đến sự hình thành rễ [10].
1.3.2. Trong nước
- Năm 2006, Lê Hồng Thủy Tiên, Bộ môn Công nghệ sinh học Trường
Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu về sự ra hoa trong
ống nghiệm ở cây dừa cạn và Dã yên thảo cho thấy nồng độ KH2PO4 340
mg/l và 40 g/l đường thích hợp nhất cho sự hình thành nụ sau 41 ngày ni
cấy, bổ sung TDZ hoặc BA kết hợp NAA, tăng nồng độ KH2PO4, giảm nồng
độ KNO3 đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây và không cảm ứng được
với sự ra hoa in vitro [6].
- Năm 2015, phịng Sinh lí thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
nghiên cứu về sự nhân nhanh cây Dã yên thảo màu trắng bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật đã đưa ra quy trình đơn giản tạo vật liệu khởi đầu in
vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây, mơi trường thích hợp để tạo cây Dã yên
thảo in vitro hoàn chỉnh là môi trường MS + 30 g/l đường saccarose + 8 g/l
agar + 5
nước dừa cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất [7].
- Năm 2017, phịng Sinh lí thực vật trường Đại học sư phạm Hà Nội 2
nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm rèn luyện đến tỉ lệ sống và một số đặc
điểm sinh lí của cây Dã yên thảo nuôi cấy mô giai đoạn vườn ươm [3].
- Năm 2011, Trần Quốc Cường nghiên cứu về hiệu quả của BA, NAA,
TDZ lên sự tái sinh chồi Dã yên thảo (petunia sp.) in vitro [1].
Như vậy, các cơng trình nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào tái
sinh và nhân nhanh Dã yên thảo in vitro trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên
màu sắc cịn chưa đa dạng vì vậy cần có nhiều đề tài nghiên cứu hơn để tạo ra
các cây hoa Dã yên thảo có màu sắc phong phú.
12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, hóa chất, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây Dã yên thảo rủ tím đỏ mắt đen (petunia purple black eye) thu
ngoài tự nhiên, khi đỉnh sinh trưởng cao khoảng 8 – 10 cm tiến hành thu mẫu
cho nghiên cứu ni cấy mơ tại phịng Sinh lí thực vật - Trường Đại học sư
phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
- Hóa chất: Dung dịch MS (Murashige & Skoog, 1962), αnaphthaleneacetic acid (α - NAA), BAP, Kinetin…
- Thiết bị: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon, dao cấy,
khay cấy, box cấy vơ trùng, kính hiển vi điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử
trùng, cân phân tích,…
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 6/ 2017 đến tháng 4/ 2018.
- Địa điểm nghiên cứu: Phịng sinh lí học thực vật, Trung tâm hỗ trợ
nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và vườn thực nghiệm trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nội dung nghiên cứu
2.3.1.1. Thí nghiệm 1. Tạo vật liệu in vitro từ chồi cây hoa Dã yên thảo
Chồi Dã yên thảo thu ngoài tự nhiên dài khoảng 8 - 10 cm, ta đem cắt
bỏ lá cho vào cốc thủy tinh, xử lí sơ bộ bằng cách: Rửa sạch dưới vịi nước
máy để loại bỏ cát, đất, sau đó rửa trong dung dịch nước xà phòng và được
rửa lại bằng nước cất rồi đưa vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
- Rửa chồi bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần.
13
- Lắc cồn 70% trong 3 phút.
- Rửa bằng nước cất vơ trùng 3 lần.
- Lắc mẫu bằng hóa chất khử trùng với nồng độ và thời gian theo thí
nghiệm. Rửa lại 3 - 4 lần bằng nước cất vô trùng.
Bảng 2.1. Các cơng thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng
Cơng thức
Chất xử lí/ thời gian
ĐC
Xử lí sơ bộ
CT1
Xử lí sơ bộ + Javen 5%/ 5 phút
CT2
Xử lí sơ bộ + Javen 5%/ 7 phút
CT3
Xử lí sơ bộ + Javen 10%/ 5 phút
CT4
Xử lí sơ bộ + Javen 10%/ 10 phút
Mẫu cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt bỏ bề mặt tiếp
xúc với chất khử trùng, vì các tế bào ở bề mặt tiếp xúc dưới tác dụng của chất
khử trùng mạnh dễ bị chết. Sau khi cắt tiến hành thấm khô mẫu và cấy vào môi
trường MS cơ bản đã chuẩn bị trước. Đặt mẫu lên giàn nuôi cấy theo dõi tỷ lệ
mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch chết, tỷ lệ mẫu sạch sống sau 7 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%): (tổng số mẫu nhiễm / tổng số mẫu cấy vào) x 100
+ Tỷ lệ mẫu sạch sống (%): (tổng số mẫu sạch sống / tổng số mẫu cấy
vào) x 100
+ Tỷ lệ mẫu sạch chết (%): (tổng số mẫu sạch chết / tổng số mẫu cấy
vào) x 100
2.3.1.2. Thí nghiệm 2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo
cụm chồi in vitro.
Trong thí nghiệm này chúng tơi sử dụng BAP và Kinetin là 2 chất điều
hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Cytokinin để tìm hiểu ảnh hưởng của
chúng đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây hoa Dã yên thảo.
14
Chúng tôi bổ sung BAP với nồng độ 0,1 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7
mg/l, hỗn hợp: BAP 0,1 mg/l và Kinetin với các nồng độ 0,1 mg/l; 0,3 mg/l;
0,5 mg/l; 0,7mg/l vào mơi trường MS để tiến hành thí nghiệm. Các mẫu sạch
ở thí nghiệm 1 được chuyển sang mơi trường có bổ sung BAP, BAP và
Kinetin theo dõi từng tuần.
a) Thí nghiệm 2a: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cụm
chồi cây Dã yên thảo (bảng 2).
b) Thí nghiệm 2b: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng
tạo cụm chồi cây Dã yên thảo (bảng 3).
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên thảo
Công thức
Thành phần môi trường
CT1
MS (ĐC)
CT2
MS + 0,1 mg/l BAP
CT3
MS + 0,3 mg/l BAP
CT4
MS + 0,5 mg/l BAP
CT5
MS + 0,7 mg/l BAP
Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi
cây Dã yên thảo.
Công thức
Thành phần môi trường
CT1
MS (ĐC)
CT2
MS + 0,1 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin
CT3
MS + 0,1 mg/l BAP+ 0,3 mg/l Kinetin
CT4
MS + 0,1 mg/l BAP+ 0,5 mg/l Kinetin
CT5
MS + 0,1 mg/l BAP+ 0,7 mg/l Kinetin
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 4 tuần nuôi cấy
+ Hệ số nhân chồi =∑ chồi tạo thành / ∑chồi đưa vào
15
