Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa Cát tường trắng viền tím từ đốt thân
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.65 MB, 49 trang )
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
-----------------------
LÊ THỊ NHUNG
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY HOA CÁT TƢỜNG
TRẮNG VIỀN TÍM TỪ ĐỐT THÂN
(Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
HÀ NỘI - 2018
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
-----------------------
LÊ THỊ NHUNG
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY HOA CÁT TƢỜNG
TRẮNG VIỀN TÍM TỪ ĐỐT THÂN
(Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. LA VIỆT HỒNG
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu của mình, trong quá trình nghiên
cứu và học tập, tôi đã nhận được sự quan tâm chỉ bảo tận tình từ phía thầy cô,
sự giúp đỡ đoàn kết từ phía bạn bè.
Lời đầu tiên, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy
hướng dẫn của mình là TS. La Việt Hồng cùng cô giáo Mai Thị Hồng đã
hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài,
việc đánh giá, theo dõi nghiêm túc của thầy giúp tôi luôn chủ động trong công
việc, đồng thời trau dồi được kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Sự giúp đỡ
và đóng góp ý kiến không nhỏ từ phía cô để tôi được hoàn thiện mình hơn
trong công việc.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Phòng thí nghiệm sinh lý học thực
vật, khoa Sinh – KTNN của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ
quan tâm và tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị đầy đủ trong
suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã động viên, bạn bè đoàn kết giúp
đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Nhung
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây
hoa Cát tường trắng viền tím từ đốt thân” là công trình nghiên cứu của riêng
tôi do TS. La Việt Hồng hướng dẫn. Các kết quả số liệu tôi đưa ra là trung
thực, khách quan, không trùng lặp, sao chép của một luận văn nào của người
khác. Thông tin đưa ra có dẫn chứng.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Nhung
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BAP
: 6-Benzyl amino purin
NAA
: Napthalene acetic acid
Kinetin (K)
:6-furfurryl-aminopurin:
C10H9H5O
Agar
: Thạch
Nxb
: Nhà xuất bản
MS
: Murashige và Skoog, 1962
ĐC
: Đối chứng
STTV
: Sinh trưởng thực vật
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 2
4. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn......................................................... 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu .......................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc ............................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại khoa học ................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm thực vật học............................................................................. 5
1.1.4. Đặc điểm sinh trưởng .............................................................................. 6
1.1.5. Tình hình nghiên cứu hoa Cát tường trên thế giới .................................. 7
1.1.6. Tình hình nghiên cứu hoa Cát tường tại Việt Nam................................. 8
1.1.7. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa Cát tường ở Việt Nam ..................... 9
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 11
2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................ 11
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 11
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ................................................................. 11
2.2.1. Dụng cụ ................................................................................................. 11
2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 12
2.2.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 12
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
2.3.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 12
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 12
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 17
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu................................................................................ 17
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây hoa Cát tường trắng viền tím .. 18
3.2.1. Tái sinh từ đốt thân ............................................................................... 19
3.2.2. Tái sinh từ mẫu lá .................................................................................. 22
3.4. Rèn luyện cây hoa Cát tường in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên . 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 29
1. Kết luận ....................................................................................................... 29
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 31
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân của cây hoa Cát tường
trắng viền tím .................................................................................................. 17
Bảng 3.2. Kết quả thí nghiệm tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt
thân của cây hoa Cát tường trắng viền tím .................................................. 19
Bảng 3.3. Kết quả của sự tái sinh và nhân nhanh chồi từ mẫu lá nguyên . 22
Bảng 3.4. Kết quả tạo cây hoa Cát tường trắng viền tím in vitro hoàn chỉnh
......................................................................................................................... 24
Bảng 3.5. Kết quả của cây con Cát tường in vitro giai đoạn rèn luyện ..... 27
DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân của cây hoa Cát tường
trắng viền tím .................................................................................................. 18
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi từ đốt
thân của cây hoa Cát tường trắng viền tím ...... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi từ
đốt thân của cây hoa Cát tường trắng viền tím Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi từ
đốt thân của cây hoa Cát tường trắng viền tím Error! Bookmark not defined.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá nguyên
............................................................................. Error! Bookmark not defined.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến sự kích thích ra rễ của chồi hoa Cát
tường trắng viền tím ........................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của NAA đến sự kích thích ra rễ của chồi hoa Cát
tường trắng viền tím ....................................................................................... 26
Hình 3.8. Cây con Cát tường in vitro giai đoạn rèn luyện ........................... 28
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống của con người ngày một
nâng cao, nhu cầu làm đẹp cho cuộc sống cũng theo đó mà tăng mạnh mẽ.
Hoa được coi là thứ trang sức không thể thiếu của con người, nó mang lại cho
cuộc sống thêm màu sắc và hương vị ngọt ngào và là cầu nối giữa những
người yêu thương để gửi đến nhau những thông điệp tốt đẹp. Mỗi một loài
mang trong mình một vẻ đẹp và một ý nghĩa riêng, trong muôn vàn các loài
hoa đó có một loài mang tên hoa Cát tường.
Hoa Cát tường (Eustoma grandiflorum) là giống hoa được nhiều người
ưa chuộng bởi sắc hoa tươi thắm, thanh thoát, đơn giản mà quý phái, tên gọi
của hoa mang ý nghĩa sâu sắc với quan niệm mang lại sự may mắn, hanh
thông, tốt lành. Một loài hoa có đa màu mắc, mỗi màu hoa toát lên vẻ quý
phái riêng: Trắng viền xanh, trắng viền tím, trắng viền hồng, vàng
chanh,...Tuy bông hoa có vẻ đẹp gợi cho ta sự dịu dàng, ê ấp, mỏng manh.
Nhưng Cát tường là loài hoa vươn lên mạnh mẽ, sức sống cao, chịu lạnh tốt.
Hoa Cát tường là loài hoa cắt cành phổ biến, tăng nhanh trên thị trường,
các giống thương mại được phát triển mạnh mẽ ở Nhật Bản (Halevy và
Kofranek, 1984) [17]. Do điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng phù hợp với điều
kiện sinh trưởng của hoa, nên du nhập vào nước ta lần đầu tiên tại Đà Lạt.
Cây hoa Cát tường có khả năng kháng bệnh, chịu được axit, phát triển tốt nhất
ở pH 6,3 đến 6,7, khả năng thích ứng với nhiệt độ tốt [17]. Tuy nhiên, hạt có
kích thước quá nhỏ, bằng kĩ thuật thông thường để nhân giống thì không hiệu
quả [14]. Trước đây, có nhiều công trình nghiên cứu thường nhân giống in
vitro bằng nuôi cấy hạt. Tuy nhiên, các vỏ hạt thường bám đọng vi khuẩn nên
mẫu dễ bị nhiễm, thời gian nghiên cứu lâu, khó đạt kết quả cao, ảnh hưởng
đến năng suất và chất lượng hoa thương phẩm [14].
1
Xuất phát từ lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Hoàn thiện quy
trình nhân giống in vitro cây hoa Cát tƣờng trắng viền tím từ đốt thân”
2. Mục đích nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa Cát tường trắng viền tím bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô, nhằm cung cấp nguồn giống sạch, nâng cao chất lượng
hiệu quả sản xuất giống Cát tường ở Việt Nam, phục vụ nhu cầu chơi hoa của
người dân.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo nguồn vật liệu khởi đầu: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất,
nồng độ thời gian khử trùng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy từ đốt thân.
- Tái sinh và nhân nhanh chồi Cát tường in vitro bằng kĩ thuật nuôi cấy
mô thực vật.
Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin, nước dừa đến khả năng tái sinh
và tạo đa chồi mẫu đốt thân.
Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin, nước dừa đến khả năng tái sinh
chồi từ mẫu lá nguyên.
- Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi in vitro.
- Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.
4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài được thực hiên trong phạm vi phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
Sinh lí thực vật học và vườn Sinh học thực nghiệm của trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Đề tài góp phần bổ sung vào tài liệu khoa học về
quá trình nhân giống hoa Cát tường, làm sáng tỏ sự ảnh hưởng của chất điều
2
hòa sinh trưởng cũng như điều kiện nuôi cấy tới sự sinh trưởng của cây hoa
Cát tường.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài được áp dụng đáp ứng trong quy
mô sản xuất hoa Cát tường đảm bảo giống sạch bệnh, năng suất, chất lượng
cao.
3
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Nguồn gốc
Hoa Cát tường có tên tiếng Anh là Lisianthus, tên khoa học là Eustoma
grandiflorum (Raf.) Shinn thuộc họ Long đởm (Gentianacea) có nguồn gốc
từ Tây Mỹ [2].
1.1.2. Phân loại khoa học
Giới (Regnum)
: Plantae
Nghành (Divisio) : Magnoliophyta
Lớp (Class)
: Magnoliopsida
Bộ (Ordo)
: Gentianales
Họ (Familia)
: Gentianaceae
Chi (Genus)
: Eustoma Salisb (1806) [2].
Các giống hoa sản xuất thương mại gồm 2 loại: Giống hoa kép và hoa đơn
[23].
Giống hoa kép:
Nhóm Alivia: Nhóm này thích hợp ở điều kiện ánh sáng yếu và
nhiệt độ mát. Thường trồng vào vụ đông. Phổ biến trắng ngà, viền
xanh, hồng cánh sen, đỏ tía.
Nhóm Balboa: Nhóm này thích hợp với nhiệt độ và cường độ
ánh sáng cao hơn. Thích hợp trồng vụ xuân đến hè.
Nhóm Catanila: Thích hợp điều kiện ngày dài và thời tiết ấm áp.
Thường màu xanh tía và màu vàng.
Nhóm Candy: Thích hợp cường độ ánh sáng trung bình và quang
chu kì ngày ngắn. Hoa nở đồng loạt.
4
Nhóm Echo: Phổ biến, không thích hợp với ánh sáng quá cao
hoặc quá thấp, thích hợp vụ đông xuân. Phổ biến trong giống: Xanh
bóng, xanh tía, hồng, hồng tía, trắng tuyền.
Nhóm Mariachi: Thích hợp trồng trong chậu, số cánh hoa nhiều,
cánh hoa mỏng hơn nên nhìn rất đẹp. Phổ biến trong giống: trắng, hồng,
hồng nhạt…
Giống hoa đơn:
Nhóm Flamenco: Thích hợp cường độ ánh sáng cao và quang chu
kì ngày dài. Các màu: Xanh bóng, hồng, vàng, trắng.
Nhóm Heidi: Thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và
quang chu kì ngày ngắn. Có nhiều màu để chọn.
Nhóm Laguana: Là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao
và quang chu kì ngày dài. Có hai màu: xanh đậm và xanh tía.
Nhóm Malibu: Thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và
trong mùa xuân và mùa thu. Có nhiều màu: hoa cà, xanh đậm, trắng,
hồng, trắng viền xanh.
Nhóm Yodel: Thân hoa dài khoảng 45-50 cm. Có nhiều màu là
xanh đậm, xanh, hoa cà, hồng phấn, hồng, trắng.
1.1.3. Đặc điểm thực vật học
Rễ: thuộc loại rễ cọc, có nguồn gốc từ mầm rễ của hạt. Rễ phát triển
theo chiều sâu, ít phát triển theo chiều ngang. Do vậy, cây có khả năng chịu
hạn cao [2].
Thân: thân thảo cao 120-150 cm chia thành nhiều đốt, có khả năng
phân nhánh mạnh, giòn, dễ gãy. Cây càng lớn thân càng cứng, bên ngoài thân
được phủ một lớp sáp trắng mỏng. Các đốt sát gốc thường to và trắng hơn các
đốt trên ngọn, độ dài các đốt thay đổi theo từng giống. Thân chính có khả
5
năng phân nhánh mạnh sau khi cây hình thành nụ hay ưu thế ngọc hoặc sâu
cắt ngọn. Các đốt ở ngọn cây dài và nhỏ [2].
Lá: hơi mọng nước, lá mọc đối, hầu như không có cuống, không có lá
kèm, có hình ô van hay hình bầu dục dài tùy từng giống, đầu lá nhọn, lá
không có cuống mà ôm sát lấy thân. Mép lá không có răng cưa. Phiến lá có
thể to hay nhỏ tùy thuộc vào đặc điểm từng giống. Từ mỗi nách thường phát
sinh một mầm nhánh. Lá Cát tường có màu xanh biếc, mảnh dẻ, mọng nước,
bề mặt lá có phủ một lớp sáp mỏng. Trên lá có từ 3-5 gân, gân lá song song,
trong đó gân giữa ăn sâu và rõ hơn cả.
Hoa: đối xứng, lưỡng tính, tự thụ, có dạng hoa đơn và hoa kép với
nhiều màu sắc. Đài hoa, cánh hoa liền nhau. Các nhị hoa trên tràng nằm sole
với các thùy tràng hoa. Đáy nhụy hoa có một đĩa mật. Các hoa đính noãn vách
bên. Cụm hoa hình xim. Tràng hoa có nhiều màu sắc khác nhau, có loại cánh
đơn và loại cánh kép tùy từng giống [2].
Qủa: cây cát tường có khả năng đậu quả cao, dạng quả nang tự nở, khi
quả còn non có màu xanh đậm, khi chín có màu xanh xám vỏ quả nứt ra. Qủa
hoa cát tường thuộc dạng quả nẻ, hình tròn, hình tròn mỗi quả có vài trăm hạt.
Hạt: có kích thước rất nhỏ, có nội nhũ dầu nhiều, phôi mầm lớn, khi
chín hạt có màu đen nhánh. Nảy mầm kém.
1.1.4. Đặc điểm sinh trƣởng
Sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ ban ngày từ 18- 200C, nhiệt độ ban
đêm từ 15- 180C. Nhiệt độ ban đêm thấp hơn 150C sẽ làm trì trệ quá trình sinh
trưởng của cây. Vào ban ngày, khi nhiệt độ cao hơn 280C sẽ làm cho hoa nở
sớm, rút ngắn quá trình sinh trưởng của hoa và cho hoa chất lượng kém. Tùy
theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ và quang chu kỳ khác
nhau, do vậy trước khi trồng nên tìm hiểu chủng loại giống mà bố trí mùa vụ
thích hợp.
6
Ánh sáng tự nhiên: 70-80 klux
Giờ chiếu sáng trong ngày tối ưu: 16-18 giờ/ngày sẽ cho chất lương
bông cao nhất, thích hợp với vụ ngày dài
Độ ẩm đất: khoảng 70%
Đất có độ pH: 6,3-6,7
Hàm lượng dinh dưỡng cao, nhiều mùn, dễ thoát nước và đặc biệt thích
hợp với các loại đất có chứa nhiều canxi [22].
1.1.5. Tình hình nghiên cứu hoa Cát tƣờng trên thế giới
Theo các nguồn tài liệu khác nhau, trên thế giới, việc nghiên cứu nuôi
cấy mô cây hoa Cát tường đã được nghiên cứu từ lâu, đã thu được nhiều thành
công. Vật liệu nuôi cấy khởi đầu thường được sử dụng là hạt, lá, đỉnh chồi,
đoạn thân. Đặc biệt nghiên cứu từ mẫu lá là được thấy nhiều.
Theo Rezaee, F., F. Ghanati and L. Yusefzadeh Boroujeni (2012), Cát
tường là một loại cây cảnh rất phổ biến. Do hạt nảy mầm thấp, các kỹ thuật
thông thường để nhân giống không hiệu quả. Nghiên cứu này nhằm mục đích
tạo mô callus từ các bộ phận thực vật khác nhau của cây hoa Cát tường trên
các môi trường B5, LS và MS. Bộ phận lấy từ mẫu lá được nuôi cấy trên môi
trường LS cơ bản chứa 3 mg/l IAA + 3 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin và môi
trường B5 chứa 0,25 mg/l BA và 1,86 mg/l NAA là môi trường tốt nhất để tạo
ra mô callus. Và môi trường LS là con đường tạo mô callus nhanh hơn so với
nuôi cấy trong môi trường B5 và môi trường MS bổ sung 3 mg/l IAA + 3
mg/l NAA+ 2 mg/l Glycin. Tất cả các môi trường trên đều thích ứng cho việc
tạo mô callus tái sinh hình thành cây mới [14].
Theo Budi Winarto và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu về sự
hình thành mô callus và tái sinh chồi từ mẫu lá của E. grandi florum 'White
Lavender' được nuôi cấy trên môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ sung
với tidiazuron 3,0 mg/l (TDZ) và α-naphthalene acetic acid 0,3 mg/l (NAA),
nhưng tái sinh chồi chất lượng nhất được nuôi cấy trên môi trường MS có
7
chứa N6-benzyladenin 0,5 mg/l và NAA 0,002 mg/l. Môi trường MS có chứa
BA 0,1 mg/l và NAA 0,02 mg/l là môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ.
Cây chồi được rèn luyện thành công trong hỗn hợp vỏ trấu đốt và phân hữu
cơ (tỷ lệ 1:1, v/v) với tỷ lệ sống sót 90% [20].
Theo Ruffoni và cộng sự (2016) đã nghiên cứu phôi soma của cây Cát
tường, kết quả cho thấy có thể tạo ra mô sẹo phôi từ mảnh lá của các kiểu gen
được lựa chọn và để có được phôi hoặc trong chất nền agarized hoặc hệ thống
chất nền lỏng. Với việc sử dụng chất nền lỏng, với tỉ lệ lan truyền cao có thể
làm giảm chi phí lao động có thể hỗ trợ chi phí tự động hóa tối ưu [12].
Đây là các công trình nghiên cứu rất có ý nghĩa, luôn hoàn thiện, bổ
sung trong việc nghiên cứu cây hoa Cát tường, đây là tài liệu quý báu nhằm
mục đích đưa ra những phương pháp tốt nhất, hiệu quả nhất và tiết kiệm được
thời gian, chi phí trong quy trình nuôi cấy sản xuất chủng hoa mới Cát tường
trong điều kiện Việt Nam.
1.1.6. Tình hình nghiên cứu hoa Cát tƣờng tại Việt Nam
Tại Việt Nam, xu hướng ưa chuộng hoa Cát tường ngày càng được phổ
biến. Chính vì vậy mà mà những năm gần đây, giống hoa Cát tường càng
được quan tâm, đưa vào quy trình nuôi cấy sản xuất, phục vụ nhu cầu thị
trường, kèm theo đó là sự phát triển không ngừng tìm hiểu và nghiên cứu để
phục vụ cho nhân giữ giống và sản xuất. Tuy nhiên, việc nghiên cứu về nhân
giống hoa Cát tường ở Việt Nam vẫn còn chậm tiến độ hơn so với thế giới.
Năm 2009, Nguyễn Thị Bích Hoa tiến hành nhân giống hoa Cát tường
bằng phương pháp in vitro. Bước đầu xác định việc khử trùng các chồi (chồi
đỉnh, chồi nách) có thể dùng HgCl21% Ca(OH)2 có tác dụng khử trùng tốt
nhất. Môi trường tốt nhất để vào mẫu, nhân nhanh, ra rễ là môi trường cơ bản
MS mà tùy vào từng gia đoạn để bổ sung các chất ngoại sinh cho phù hợp, tùy
thuộc vào từng mô nuôi cấy và từng giai đoạn bổ sung 1-2 ppm BAP và 0,40,5 ppm NAA [16].
8
Theo Nguyễn Thị Ngọc Lan (2016) với đề tài nhân giống cây Cát
tường qua hai con đường phát sinh phôi sinh dưỡng và phát sinh cơ quan. Kết
quả của cô tiến hành trên mẫu lá in vitro có nguồn gốc từ chồi trên môi trường
MS bổ sung 2 mg/l α-naphtaleneacetic acid (α-NAA) hoặc 0,5 mg/l 2,4Dichlorophenoxyaxetic acid (2,4-D) cho tỉ lệ hình thành mô sẹo đạt 100%.
Loại mô sẹo đặc vàng, dạng hạt phát sinh phôi sinh dưỡng, tạo thành cây con
(tỷ lệ đạt 84,17%) và loại mô sẹo xốp xanh hình thành chồi (tỷ lệ 82,50%)
trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurine (BAP). Các chồi
hình thành cây con khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA
[25].
Đây là một trong số công trình nghiên cứu trong nước, rất có ý nghĩa
trong việc xây dựng quy trình nghiên cứu và sản xuất giống hoa Cát tường
trong nước cũng như trên thế giới.
1.1.7. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa Cát tƣờng ở Việt Nam
Nước ta có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, nhiều vùng miền có đất đai phì
nhiêu, màu mỡ phù hợp với sự phát triển của hoa cây cảnh, nhà nước cũng rất
quan tâm, đầu tư theo hướng công nghiệp hóa của nghành trồng hoa. Tuy
nhiên thì diện tích trồng hoa cây cảnh còn quá thấp, tập trung chủ yếu ở vùng
hoa truyền thống như Đà Lạt, Lâm Đồng, Tây Tựu, Mê Linh - Hà Nội. Hoa
Cát tường là loại hoa mới, màu sắc đẹp nên được thị trường trong và ngoài
nước ưa chuộng. Hoa Cát tường được trồng tại Đà Lạt - Lâm Đồng vì khí hậu
ở đây phù hợp với điều kiện sinh trưởng của cây.
Hiện nay, Nhật Bản là thị trường tiêu thụ, xuất khẩu hoa cắt cành lớn
nhất của Việt Nam, chiếm 90% tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nước [3].
Tại phía Bắc hai vùng trồng hoa Cát tường đầu tiên là Tây Tựu, Mê Linh.
Hầu hết là hộ dân mua cây giống từ Đà Lạt, tìm hiểu kĩ thuật trồng hoặc mua
hạt giống bán trên thị trường về tự gieo cấy. Nguồn cấp giống chưa đủ cùng
9
với khí hậu miền Bắc không được thuận lợi cho sự phát triển tốt nhất của hoa,
bởi vậy chất lượng và sản lượng hoa còn chưa cao, chỉ đáp ứng nhu cầu trong
nước, chưa có khả năng xuất khẩu. Tuy nhiên, đánh giá sơ bộ kết quả sản xuất
hoa Cát tường trong vài vụ theo người dân cho thấy hiệu quả kinh tế bước đầu
đạt cao gấp 1,5-2 lần so với trồng hoa cúc, hoa hồng [24].
10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Cây hoa Cát tường (Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn) cho hoa kép.
Vật liệu được lấy từ vườn cây giống Đà Lạt.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu vào mẫu ban đầu là đốt thân của cây hoa Cát tường.
- Các giai đoạn tạo vật liệu, tái sinh và nhân nhanh, ra rễ in vitro tại
phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Sinh lý thực vật học trong điều kiện nhân tạo,
chủ động điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm.
- Giai đoạn hình thành cây, được đưa ra trồng tại vườn thực nghiệm
Sinh học của khoa Sinh – KTNN.
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Dụng cụ
Khay cấy, dao cấy, panh cấy, bình thủy tinh hoặc túi nilong, bình tam
giác, pipet, đèn cồn, kéo, bình xịt cồn,…
11
2.2.2. Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy: Nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân kỹ
thuật, cân phân tích, tủ lạnh, buồng cấy vô trùng.
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Chất khử trùng: Javen, xà phòng, cồn.
Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS + 30 g/l đường saccarozơ + 7 g/l agar,
pH= 5,8 [19].
Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ là 117 0C trong 15 phút.
Chất điều hòa sinh trưởng: BAP (6-benzyl amoni purin), NAA (αnapthalene acetic acid), K (Kinetin) [Dulchefa, Hà Lan], nước dừa.
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy: 25- 280C.
Độ ẩm trung bình: 50% - 70%.
Ánh sáng: Sử dụng đèn chiếu sáng huỳnh quang.
Cường độ chiếu sáng: 2000- 3000 Lux.
Thời gian chiếu sáng: từ 14h – 16h/ngày.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Là đoạn thân còn non chứa nách lá cây hoa Cát tường có kích thước
tương đối bằng nhau (2-3cm), chất lượng tương đương. Các thí nghiệm được
bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại.
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nội dung 1. Tạo vật liệu khởi đầu
Dùng dao lam cắt cây Cát tường thành những đốt thân đều nhau khoảng
2-3 cm có chứa nách lá đều nhau khoảng 2-3 cm. Lắc mẫu bằng xà phòng, rửa
lại bằng nước sạch. Sau đó để ráo nước rồi đưa vào buồng cấy vô trùng. Tại
đây, mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng (2-3 lần) được khử trùng sơ bộ
12
bằng cồn 70% trong 3-5 phút, việc này làm tăng tiếp xúc giữa tế bào và hóa
chất khử trùng. Bố trí công thức Javen theo bảng dưới. Lấy mẫu ra khỏi dung
dich khử trùng rửa lại bằng nước cất khử trùng 3-5 lần rồi cấy vào môi
trường: MS + 30 g/l đường saccarozơ + 7 g/l agar [6].
Công thức thí nghiệm tạo vật liệu invitro cây hoa Cát tường từ đốt thân
Công thức
Chất xử lí và thời gian
CT1
Xử lý sơ bộ + dung dịch Javen 5% trong 5phút
CT2
Xử lý sơ bộ + dung dịch Javen 7% trong 5 phút
CT3
Xử lý sơ bộ+ dung dịch Javen 10% trong 5 phút
CT4
Xử lý sơ bộ + dung dịch Javen 10% trong 7 phút
Đánh giá thí ghiệm sau 15 ngày theo dõi dựa trên chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu
nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sạch sống, tỷ lệ mẫu chết.
Nội dung 2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
Thí nghiệm 1. Tái sinh chồi từ đốt thân
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường: MS + 30 g/l đường saccarozơ +
7 g/l agar có bổ sung BAP ở các nồng độ: 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 0,75 mg/l; 1,0
mg/l.
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường: MS + 30 g/l đường saccarozơ +
7 g/l agar có bổ sung Kinetin (K) ở các nồng độ: 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 0,75
mg/l.
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường: MS + 30 g/l đường saccarozơ +
7 g/l agar có bổ sung nước dừa: 5%, 10%, 15%.
Tất cả đều theo dõi đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần dựa trên chỉ tiêu: Số
chồi/mẫu, số lá/chồi, chiều cao chồi.
13
Chất điều hòa/Nước dừa
Mẫu chồi từ đốt thân
Nước dừa Số chồi/mẫu
BAP
K
(mg/l)
(mg/l)
(% v/v)
-
-
-
0,25
-
-
0,50
-
-
0,75
-
-
1,00
-
-
-
0,25
-
-
0,50
-
-
0,75
-
-
1,0
-
5%
-
-
10%
-
-
15%
Số lá/chồi
Chiều cao
chồi
Thí nghiệm 2. Tái sinh từ mảnh lá
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường: MS + 30 g/l đường saccarozơ +
7g/l agar có bổ sung BAP ở các nồng độ: 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5
mg/l; 2,0 mg/l dành cho mảnh lá.
Công thức
Chất điều hòa STTV (BAP mg/l)
ĐC
MS cơ bản
CT1
BAP 0,5 mg/l
CT2
BAP 1,0 mg/l
CT3
BAP 1,5 mg/l
CT4
BAP 2,0 mg/l
Theo dõi, đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần dựa trên các chỉ tiêu: Tỷ lệ
mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết, số chồi/mẫu, số lá/chồi, chiều cao chồi.
14
Nội dung 3. Ra rễ và tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS cơ bản: MS + 30 g/l đường
saccarozơ + 7g/l agar có bổ sung NAA: 0,02 mg/l; 0,04 mg/l; 0,06 mg/l; 0,08
mg/l; 0,1 mg/l.
Ngoài ra, thí nghiệm tiến hành thêm trên môi trường MS cơ bản: MS+
30 g/l đường saccarozơ+ 7 g/l có bổ sung NAA: 0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4 mg/l.
Theo dõi đánh giá thí nghiệm sau 3 tuần dựa trên chỉ tiêu: Tỷ lệ ra rễ
(%), số rễ/chồi, chiều dài rễ(cm).
Công thức
Chất điều hòa STTV (NAA mg/l)
ĐC
MS cơ bản
CT1
NAA 0,02 mg/l
CT2
NAA 0,04 mg/l
CT3
NAA 0,06 mg/l
CT4
NAA 0,08 mg/l
CT5
NAA 0,1 mg/l
Nội dung 4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
Những cây sinh trưởng tốt và có bộ rễ sinh trưởng đồng đều thu được
từ nuôi cấy in vitro được chuyển ra ngoài vườn ươm.
Tiến hành chuyển cây con trong bình thí nghiệm ra vườn ươm
Hỗn hợp giá thể: Đất vườn: vỏ trấu: phân ải: tỉ lệ 1:1:1 [20].
Đất phải được đánh tơi xốp, nhào trộn ít vỏ trấu và một lượng ít phân ải,
rồi cuốc xới sâu 20 cm trước khi trồng cây [23].
Lên luống rộng 130 cm, cao 15-20 cm, rãnh luống rộng 30 cm. Trồng 5
hàng trên mặt luống cách nhau 15-18 cm, cây này cách cây kia 10-12 cm, mật
độ 50-60 cây/ m2 [23].
Bình cây trong phòng thí nghiệm, trước khi trồng trực tiếp vào đất, thì
phải để bình trong đất 3 đến 4 ngày, mở hé nắp bình để cây thích nghi được
15
với nhiệt độ ngoài tự nhiên, tránh để ánh sáng mạnh chiếu trực tiếp vào bình
cây.Khi trồng trực tiếp vào đất, phải chú ý tưới nước dạng phun sương, ngày
tưới 3 lần/ngày để cây con nhanh bén rễ. Khi cây đã lên xanh, điều chỉnh
lượng nước tưới, dùng túi nilon đen để che bớt 30-40% ánh sáng nhằm giúp
tăng chiều dài cành hoa, tăng chất lượng hoa (chú ý vào mùa xuân, mùa đông
của miền Bắc, mùa mưa ở miền nam, cần tháo bỏ lưới che để hạn chế sự phát
sinh sâu bệnh), thường xuyên kiểm tra, phun thuốc phòng trừ sâu bệnh kịp
thời, nhất là các loại bọ trĩ, bọ phân,….[23].
Theo dõi thí nghiệm: Chiều cao thân, số chồi/mẫu, số lá phát sinh, tỉ lệ
sống.
16
