Tách chiết và đánh giá các chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona sp

MỤC LỤC
I. Phần mở đầu .....................................................................................................................3
1.1 Lý do chọn đề tài .........................................................................................................3
.

n h

ho họ

ủ đề tài ........................................................................................ 3

1.3 Mụ tiêu đề tài .............................................................................................................3
.4 Đối tượng và phạm vi đề tài ........................................................................................ 3
.

n hiên

u tron v n o i nư

II. Phươn ph p n hiên

...........................................................................4

u .................................................................................................8

. Sơ đồ nghiên c u chung .............................................................................................. 8
2.2 Thuyết minh quy trình .................................................................................................8
2.2.1 Khảo s t phươn ph p hiết Hải miên haliclona sp. .............................................9
2.2.2 Khảo sát dung môi chiết đối v i phươn ph p hiết Soxhlet .............................. 10
. .4. hiết phân đoạn v i

dun môi h

nh u ....................................................10

. Đ nh i hoạt t nh d h hiết ải miên Haliclona sp ................................................11
. .

m ượn prot in tổng ....................................................................................... 11

. .

m ượn ph no i ............................................................................................. 12

. .

m ượn

. .4

m ượn st roid................................................................................................ 14

vonoid ........................................................................................... 13

Phươn ph p thực hiện .................................................................................................15
. . Đ nh i hoạt t nh ây độc lên tế b o Un thư....................................................15
IV. Dự kiến nội dung luận văn........................................................................................... 19
KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 19
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................20

1

DANH MỤC HÌNH
ình . . Sơ đồ nghiên c u chung.......................................................................................8
ình . . Quy trình đ nh i

hả năn

ây độc lên tế b o Un thư m u K 6 ................16

ình . . Quy trình đ nh i

hả năn

ây độc tế bào bằn phươn ph p MTT .............18

DANH MỤC BẢNG
Bản

. Đường chuẩn BSA (0-2mg/ml) ..........................................................................11

Bản

.

Bản

. Đường chuẩn Quercetin (0 – 0.1 mg/ml) ........................................................... 13

Bản

.4 Đường chuẩn Choleslerol (0 – 0,12 mg/ml) ....................................................... 15

Đường chuẩn Acid Galic (0-0,12mg/ml) .......................................................... 12

2


I. Phần mở đầu
1.1 Lý do chọn đề tài
Việc nghiên c u, khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài
sinh vật biển được coi là nhữn hư ng nghiên c u quan trọng trong thế kỉ th

. Dược

liệu Biển là nguồn cung cấp dồi dào các chất có hoạt tính sinh học và hiện đ n thu hút
được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế gi i. Tron đó, hải miên
(Pori r ) đ n đượ ưu tiên n hiên

u vì phát hiện ra một loạt các thành phần hóa học

hoạt tính sinh học và các chất chuyển hóa th cấp v i các ng dụn dược phẩm tiềm
năn mang lại kết quả đầy h a hẹn. Theo những nghiên c u gần đây ho thấy Hải miên ở
vùng biên Việt Nam rất phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng loạt các hoạt chất
sinh học tiềm năn và d ch chiết từ Hải miên biểu hiện khả năn

h n

thư. Những tiềm năn v ý n h thực tiễn của Hải miên đó ũn
“Tách chiết v đ nh

n h

1.2
-

ho họ

h t

ho t t nh s nh họ t

huẩn, kháng ung
do thực hiện đề tài

ải miên Haliclona sp. “

ủ đề tài

Kết quả nghiên c u củ đề tài cho thấy tiềm năn

ủa Hải miên nói chung và Hải

miên Haliclona sp nói riêng.
-

Đón

óp thêm ơ sở khoa học về điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh

học từ Hải miên Haliclona sp và hoạt t nh h n un thư ủa Hải miên Haliclona sp.

-

Góp phần khuyến khích các công trình nghiên c u từ Hải miên, các sinh vật biển

nói chung và Hải miên Haliclon sp nói riêng từ đó h i th

v nân

o i tr , lợi ích

tiềm tang mà chúng mang lại
1.3 Mụ t êu đề tài
-

Tách chiết và thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ Hải miên Haliclona

sp.
-

Đ nh i h m ượng hợp chất có hoạt tính sinh học từ

phân đoạn d ch cao

chiết.
-

Đ nh i

hả năn

ây độc lên tế b o un thư máu K562 của các phân đoạn d ch

cao chiết.
1.4 Đố tượng và ph m v đề tài
 Hải miên Haliclona sp. được lấy từ vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa.
3


 Dòng tế b o un thư m u K562 tế b o un thư m u v dòn tế bào biểu mô thận
n ười HEK làm đối ch ng.
1.5

n h ên

u tron v n o

nư

 Kết quả nghiên c u cho thấy các hợp chất phân lập được từ giống Haliclona thể
hiện một số hoạt t nh đ n qu n tâm như ây độc tế bào, kháng viêm, kháng khuẩn,
kháng nấm, chốn oxy ho …Tron đó, nổi bật là hoạt t nh ây độc tế bào v i khả năn
c chế mạnh trên nhiều dòn tế b o un thư h


nh u.

Hai hợp chất (halicloic acid A) và (halicloic acid B) được phân lập từ loài

hải miên Haliclona sp. thu thập ở v n biển của Philippine. Trong thử nghiệm in vitro
hún thể hiện khả năn

c chế sự tái tổ hợp và có thể được sử dụn để hư ng dẫn việc

thiết kế tổng hợp chất c chế IDO (Indoleamine-2,3-dioxygenase) [1].


Từ loài hải miên Haliclona sp., Christine và cộng sự phân lập được sáu hợp

chất terpene. Tron đó, h i hợp chất (adociasulfate 2) và (adociasulfate 6) được phát hiện
là chất có khả năn


ìm h m đặc hiệu enzyme ATPase [2].

Tám hợp chất m i được Yu và cộng sự phân lập từ loài H. oculata. Tám

hợp chất n y đượ đ nh i

hả năn

ây độ đối v i b dòn tế b o: un thư m u

L-

60 và un thư phổi A-549. Kết quả cho thấy, hợp chất 2-ethoxycacbonyl- β-hydroxy-Anor-ergosta5,24(28)-dien-4-one thể hiện khả năn

ây độc mạnh đối v i

dòn tế bào

un thư n ười HL-60 (IC50 = 0,32 µg/mL) và A-549 (IC50 = 0,47 µg/mL) [3].


Hai hợp chất (densanin A) và (densanin B) được phân lập từ loài hải miên

H. densaspicula (Hàn Quốc). Hai hợp chất n y được phát hiện có khả năn
sự sản sinh NO trên đại thực bào v i giá tr I


,

v

c chế mạnh

, 4 μM [4 ].

Một nghiên c u khác cho biết hợp chất (papuamine) và (haliclonadiamine)

được phân lập từ một loài hải miên Haliclona sp. thuộc biển Indonesia thể hiện hoạt tính
c chế sự phát triển
tiền liệt LN

dòn tế b o un thư n ười: un thư vú M

p, un thư đại trực tràng Caco-7 v i i tr I

tron

-7, un thư tuyến

hoảng 0,93~4,44

µM [5].


Hợp chất (haliclonacyclamine A) được phân lập từ loài hải miên Haliclona

sp. (thu tại quần đảo Solomon). Hợp chất này thể hiện hoạt t nh h n vi tr n sốt rét
Plasmodium

falciparum

FCB1.

(haliclonacyclamine A) có khả năn

Và

trong

thử

nghiệm

in

vivo,

hợp

chất

hống lại vi tr n sốt rét Plasmodium vinckei petteri

trên chuột.
4




Hợp chất (haliclonin A) được Kyoung và cộng sự phân lập từ loài hải miên

thuộc giống Haliclona. Hợp chất n y được thông báo có hoạt tính ây độc tế bào trung
bình và kháng sinh mạnh đối v i các chủng vi khuẩn khác nhau [6].


Từ loài hải miên H. nigra (v n biển Papua New Guinea), Mohamad và

cộng sự đ phân ập được hợp chất (haligramide A) và (haligramide B). Cả hai hợp chất
n y đều có hoạt t nh ây độc tế b o đối v i một số dòn tế b o un thư n ười (un thư
phổi A- 49, un

thư ruột kết

T-

v un

thư n o SN - 9).

i tr I

ủa

haligramide A trong khoảng 5,17- 15,62 µg/mL và của (haligramide B) trong khoảng
3,89- 8,82 µg/mL[7] .


Hợp chất (haliclorensin) được Gainit và cộng sự phân lập từ loài hải miên

H. tulearensis thu ở v n v nh Sodw n , Durb n, N m Phi ở độ sâu
của loài hải miên n y đượ đ nh i
bạch cầu chuột P-388 v i i tr I


m. D h hiết thô

ó hoạt t nh ây độc tế bào mạnh tế b o un thư
,

mL [8].

Hai alkaloid isoquinolin (1-hydroxymethyl-7-methoxyisoquinolin-6-ol) và

(mimosamycin) được phân lập từ một loài hải miên thuộc chi Haliclona (Philippine).
Trong thử nghiệm hoạt t nh ây độc tế bào, hợp chất mimosamycin thể hiện hoạt tính
h n u đối v i khối u

t nh LOX v

dòn tế bào khối u buồng tr n n ười

OVCAR-3[9] .


Từ loài hải miên Haliclona sp. thu ở v nh

(haliclonyne)

và

một

ceramide

m i

i t, một polyacetylen m i

(N-docosanoyl-D-erythro-(2S,3R)-16-

methylheptadecasphing-4 (E)-enine) được phân lập từ loài hải miên Haliclona koremella.
Hợp chất n y được thông báo là có hoạt tính chống gỉ và chống nấm tảo [30].
 Tình hình nghiên c u các loài Hải miên ở Việt Nam
Mặ d

o i hải miên đ được các nhà khoa học trên thế gi i quan tâm nghiên c u từ

rất s m, tuy nhiên Việt N m d đượ

oi

ó v n biển giàu tài nguyên và sự đ dạng

về các loài sinh vật biển song các công trình nghiên c u về hải miên m i chỉ có rất ít.


Năm

, nhóm n hiên

u củ

S. hâu Văn Minh v

ộng sự đ phân

lập được từ loài hải miên Ircinia echinata một hợp chất sesterterpene m i là 7E, 12E,
20E-variabilin

n v i một hợp chất đ biết variabilin . Các thử nghiệm về hoạt tính của

các chất cho thấy, hợp chất th nhất thể hiện hoạt t nh ây độc tế b o trên

5

dòn tế


b o un thư K

v

p

v i i tri I

tươn

ng là 1,2, 3,3µg/ml, trong khi hợp

chất th 2 có giá tri IC50 lần ượt là 5,0, 2,3 µg/ml [10].
sự đ



ũn tron năm

phân

ập được ba hợp chất steroid: ostreasterol, isofucosterol và 5,8-

, nhóm n hiên

S. hâu Văn Minh và cộng

u củ

epidioxycholest-6-en-3β-ol từ loài hải miên Dysidea cinerea. Kết quả nghiên c u hoạt
t nh ây độc tế bào cho thấy, hợp chất th nhất thể hiện hoạt tính mạnh trên cả ba dòng tế

b o un thư n ười được thử nghiệm: un thư biểu mô K

(I

,

m ), un thư

gan HepG2 (IC50 = 2,4 µg/ml) [2].


Năm

8, nhóm n hiên

u củ

S. hâu Văn Minh đ phân ập từ loài

hải miên Xestospongia testudinaria, hai hợp chất xit béo đ nối đôi h a brom m i: 20bromo-(11E,15E,19E)-eicosa-11,15,19-triene-7,9,17-triynoic
(17E,21E)-docosa-17,21-diene-9,11,19-triynoic. Hợp chất th
kháng vi sinh vật kiểm đ nh trên

và

acid

22-

bromo-

nhất thể hiện hoạt tính

hủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus và nấm mốc Fusarium oxyporum v i giá tr MIC là 50,0 µg/ml
[3].


Năm

9, nhóm n hiên

u củ

S. hâu Văn Minh phối hợp v i các nhà

khoa học Hàn Quố đ phân ập đượ năm hợp chất sterol từ loài hải miên Ianthella sp.
tron

đó có 3 hợp chất m i là: petrosterol-3,6-dione,

,6α-epoxypetrosterol và

aragusterolketal B và 2 hợp chất đ biết petrosterol và aragusterol B . Ba hợp chất m i
thể hiện hoạt t nh ây độc tế b o trên

dòn tế b o un thư A-549, HL-60, MCF-7,

SK-OV-3 và U937 v i giá tri IC50 trong khoảng 8,4-22,1 µM [11]. Ngoài ra, hai hợp

chất th 3 và hợp chất petrosterol thể hiện hoạt t nh ây độc tế b o trên b dòn tế bào
un thư n ười MCF-7, SK-Hep1, HeLa v i giá tri IC50 trong khoảng 12,8-27,8 µM [12]


Từ loài hải miên Mycale plumose, nhóm nghiên c u củ P S. Ph n Văn

Kiệm và cộng sự đ tiến hành phân lập được bốn hợp chất st ro : β-hydroxycholest-5en7-one, β, α, 6β-triolcholest-7-en , saringosterol và cholesterol [13].


Tron năm

, th o n hiên

u của GS. hâu Văn Minh v

ộng sự

n ười Nga phân lập được 2 hợp chất alkaloid m i từ loài hải miên Penares sp.. Tiếp tụ
thử nghiệm về hoạt tính của các chất phân lập được. Kết quả cho thấy, một hợp chất thể
hiện hoạt t nh ây độc tế b o trên

dòn un thư n ười HL-60 và Hela v i i tr I

lần ượt là 16,1 và 33,2 µM [14]

6




S. hâu Văn Minh v

Theo một nghiên c u khác củ

ộng sự n ười

Nga, từ loài hải miên Penares sp. phân lập được 6 hợp chất triterpenoid m i . Một hợp
chất thể hiện hoạt t nh ây độc tế b o trên dòn tế b o un thư

L-60 v i giá tri IC50 là

9,7 µM [41].


Năm

, th o n hiên

u củ P S. Ph n Văn Kiệm và các cộng sự

n ười Hàn Quố đ phân ập được 8 hợp chất sesquiterpene m i từ loài hải miên Dysidea
cinerea [16,17].

7


II. Phươn pháp nghiên c u
2.1 Sơ đồ nghiên c u chung
Quy trình tách chiết hoạt chất sinh học từ hải miên Haliclona sp [18].

Hải miên Haliclona

Xử lý mẫu
Khảo s t
phươn ph p hiết
 Khảo sát các dung môi chiết


Tách chiết

D ch chiết

Cô quay

Phân đoạn
Methanol







Đ nh i
phân đoạn
d ch chiết

m ượng protein
m ượng phenol
m ượng flavonoid

m ượng sterol
ây độc lên tế b o un thư

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung

2.2 Thuyết minh quy trình
-

Mẫu hải miên Haliclona s u hi được thu thập từ vùng biển Nha Trang Khánh

Hòa sẽ được bảo quản ở -20 o . S u đó, mẫu ân để x
8

đ nh khối ượn b n đầu.


-

Mẫu được xử ý đôn

hô, tiến hành tiền đôn

hô ở nhiệt độ -80oC trong khoảng

hô ở nhiệt độ -49 oC, ở áp suất 0.045 mbar

24 giờ. S u đó, mẫu đượ đư v o m y đôn
trong thời gian 2-3 ngày.
-

Sau khi kết thú qu trình đôn

hô, mẫu được bảo quản kín trong túi zip ở nhiệt

độ phòng.
-

10g mẫu Hải miên đ xử ý đôn

hô đượ d n để khảo s t phươn ph p hiết và

dung môi chiết.
2.2.1 Khảo s t phươn ph p hiết Hải miên haliclona sp.


Phươn ph p n âm h ết (ngâm l nh)



10g Bột Hải miên haliclona

đ đôn

hô, n âm trong 300ml methanol ở

nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, trong thời gian 24 giờ, s u đó ắng, lọc thu lấy d ch
chiết, cô quay đuổi b t dung môi, v phơi hô, x
được sẽ đượ đ nh ượn :

m ượn prot in,

m ượng sterol v Đ nh i


hả năn

đ nh hiệu suất chiết. D ch chiết thu
m ượn ph no ,

m ượng flavonoid,

ây độc lên tế b o un thư K 6 .

Phươn ph p h ết Soxhlet:
- 10g Bột Hải miên haliclona đ được xử ý đôn

hô hô được gói trong túi giấy

lọ , đặt trực tiếp vào trong ống.
- Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi chiết vào bình cầu, ượng dung môi phải đủ
thấm ư t bột nguyên liệu rồi m i chảy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau
(khoảng 2/3 thể tích bình cầu).
- Sau khi kiểm tra hệ thống kín, mở nư c chảy ho n ưu tron ốn n ưn hơi. ật
bếp cách thủy điều chỉnh nhiệt độ cho dung môi sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi
đượ đun nón dun môi sôi, b y hơi ặp lạnh, n ưn tụ ở tháp trích ly ch a nguyên liệu.
trong thời gian này, dung môi sẽ ngấm vào nguyên liệu và chiết các chất hữu ơ ó thể
hòa tan vào dung môi trong bột hải miên, đến hi dun môi tron th p tr h y vượt quá
đầu ống xi phông sẽ tràn về bình cầu kéo theo các chất được chiết r , qu trình đó ặp lại
theo một chu trình. Các hợp chất được rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó hỉ có dung
môi tinh khiết

được bố hơi để tiếp tục quá trình chiết.

- Sau khi quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi tiến hành cất dung môi ngay
tron th p để thu hồi dung môi và d ch cao chiết.
- S u hi t h được d ch chiết Hải miên, tiến h nh ô qu y hân hôn để đuổi
dun môi, đến thể t h dư i m , s u đó mẫu được sấy ở 60oC
9


- D ch chiết thu được sẽ đượ đ nh ượn :
m ượn

vonoid,

m ượng protein,

m ượng sterol và Đ nh i khả năn

m ượng phenol,

ây độc lên tế bào ung

thư K 6 .
2.2.2 Khảo sát dung môi chiết đối v
-

phươn ph p h ết Soxhlet
đ được xử ý đôn

Lấy 10g Hải miên haliclona

hô, n hiền thành

bột, gói trong giấy lọc thực hiện chiết trên máy Soxhlet v i 3 dung môi methanol,
ethanol, và hexan ở 60oC trong 6-9 giờ. Thu hồi dung môi và d ch cao chiết, tiến hành cô
quay mẫu trên m y ô qu y hân hôn để đuổi dun môi, đến thể t h dư i m , s u đó
mẫu được sấy 60o

để thu được cao chiết, x

đ nh khối ượng, hiệu xuất chiết của cả 3

dung môi chiết. D ch chiết thu được sẽ đượ đ nh ượn :
ph no ,

m ượn

vonoid,

m ượn prot in,

m ượng sterol v Đ nh i

hả năn

m ượng

ây độc lên tế

bào ung thư K 6 .
2.1.4. Ch ết phân đo n v
-

dun mô

h

nh u

Hòa tan cao chiết v i dung môi chiết b n đầu. S u đó , tiến h nh phân đoạn (lắc

v i dung môi khác ở nhiệt độ phòng trên phiễu chiết), phân đoạn v i các dung môi:
x n,

ut no , ty

t t, Nư c v i tỉ lệ d ch cao chiết : dung môi là 1:1, ở nhiệt độ

phòng.
Mẫu

o hiết s u hi sấy hô x

M th no ắ trên phiễu hiết v i
t h, thu phân đoạn
đượ

x n ở nhiệt độ phòn , tỉ ệ : . Đợi

x n, ô qu y x

ô qu y, sấy hô hò t n v i

độ phòn , tỉ ệ : . Phân đoạn ty
Phân đoạn nư
ả

đ nh hối ượn sẽ đượ hò

ại v i

dun môi phân

đ nh hối ượn . Đối v i phân đoạn m th no sẽ

m nư

ắ trên phiễu hiết v i ty

t t đượ

ô qu y sấy hô, x

t t , ở nhiệt

đ nh hối ượn .

sẽ tiếp tụ ắ trên phiễu hiết v i but no , nhiệt độ phòn , tỉ ệ : . Thu

phân đoạn, ô qu y, sấy hô, x

đ nh hối ượn v hò

ại v i m th no . Tất ả

phân đoạn ủ qu trình phân đoạn trên sẽ đượ hò v i ại v i m th no về
nồn độ hối ượn dự trên hối ượn x
đoạn d h
năn

m

o hiết đượ x

n một

đ nh đượ s u hi sấy hô. S u đó,

đ nh: h m ượn prot in, ph no ,

vonoid, st ro v

phân
hả

ây độ tế b o un thư.
Đối v i mẫu hiết từ h x n s u hi thu d h hiết, mẫu sẽ đượ

m th no rồi tiến h nh phân đoạn v i ty

hiết ại v i

t t trư , quy trình tươn tự như mẫu đượ

hiết v i m th no .
10


. Đ nh
. .

ho t tính d h h ết

ải miên Haliclona sp

m ượn prot n tổng

N uyên tắ
Phươn ph p n y dự trên sự th y đổi bư
Coomassie
hi hư
đại

ri

nt

u

hi tạo ph

són hấp thu ự đại ủ thuố nhuộm

hợp v i prot in. Tron dun d h m n t nh

ết nối v i prot in thì thuố nhuộm ở dạn m u đỏ ó bư

46 nm v

id

sốn thấp thu ự

hi ết hợp v i prot in thì thuố nhuộm huyển s n dạn m u x nh

dươn v hấp thu ự đại ở m
9 nm ó iên hệ một

ự đại ở bư

són

9 nm. Độ hấp thu ở bư

són

h trự tiếp v i nồn độ prot in.

Bảng 2.1 Đường chuẩn BSA (0-2mg/ml)

Nồn độ
BSA(µg/ml)

BSA
(2mg/ml)
H2O (µl)

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

10

20

20

20

20

20

30

4

40

20

20

20

20

20

20

0

200

200

4 µl BSA các nồn độ (mẫu)/ giến ( đ 96 iếng)

Thuốc thử
Bradford(µl)

200

200

200

200

200

200

Ủ 25oC, 15 phút

Phươn ph p thực hiện:
-

S u hi ô qu y

-

Ph

-

Pha loãng mẫu trên v i

-

4µl mẫu đ ph o n ở trên hoặ

-

200µl thuốc thử Bradford/giếng

-

Ủ ở nhiệt độ phòng trong tối( gói trong giấy bạc) 15 phút

phân đoạn, thu được m (g) cao chiết

phân đoạn mẫu d ch chiết về cùng 1 nồn độ theo khối ượng bằng MeOH
độ pha loãng 1:10 và 1:50, v/v
hất huẩn ( SA m m ) iến ( đ 96 iến )

11


-

Đo mật độ quang trên máy UV-vis ở bư c sóng 595nm

. .

m ượn ph no

N uyên tắ

Phươn ph p o in-Ciocalteu (F- ) đượ đề xuất

phươn ph p tiêu huẩn để

đ nh ượng tổng Polyphenols trong chiết xuất thực vật. Phươn ph p n y dựa vào phản
ng của các hợp chất phenolic v i thuốc thử Folin-Ciocalteu Thuốc thử folin-ciocalteu là
một hỗn hợp củ n tri vo r m t v n tri mo ybđ t hi ó mặt phenol sẽ xảy ra phản ng
oxi hóa-khử, các nhóm –OH trong phenolic sẽ được chuyển thành nhóm quinol tạo thành
ph c hợp có màu xanh ph c tạp đượ đ nh ượng bằng mật độ quang ở bư c sóng 760
nm [19].
Bảng 2. 2 Đường chuẩn Acid Galic (0-0,12mg/ml)
Nồn độ Gallic acid
(µg/ml)

Gallic acid 1mg/ml
(µl)
H2O (µl)

20

40

60

80

100

120

4

8

12

16

20

24

196

192

188

184

180

176

10 µl Galic acid các nồn độ ( mẫu)/giến ( đ 96 iếng)
Folin – Ciocalteu
(1:10) (µl)

50

50

50

50

50

50

40

40

40

40

5 phút
Na2CO3 10% (µl)

40

40
Ủ 25oC, 2h
OD760nm

Phươn ph p thực hiện:
-

S u hi ô qu y

-

Ph

-

Pha loãng mẫu trên v i

phân đoạn, thu được m (g) cao chiết

phân đoạn mẫu d ch chiết về cùng 1 nồn độ theo khối ượng bằng MeOH
độ pha loãng 1:10 và 1:50, v/v
12


-

10 µl mẫu hoặc chất chuẩn (Galic acid 1mg/ml) trên mỗi giến ( đ 96 iếng)

-

50 µl thuốc thử Folin – Ciocalteu (pha loãng 1:10, v/v)/giếng

-

Sau 5 phút, thêm 4µl Na2CO3 (10% w/v)/giếng

-

Ủ ở nhiệt độ phòng trong tối ( Ủ trong giấy bạ ) h để phản ng

-

Đo mật độ quang trên máy UV-vis ở bư c sóng 760 nm [19].

. .

m ượn

vono d

N uyên tắ
m ượng tổn

vonoids đượ x

đ nh th o phươn ph p tạo ph c v i nhôm.

Phươn ph p n y dựa trên việ nitr t hó

vòn thơm ó h a nhóm catechol. Sau

khi bổ sung Al(III), dung d ch màu vàng của ph c hợp được tạo thành, tiếp theo dung
d ch sẽ chuyển s n m u đỏ sau khi bổ sung NaOH và giá tr hấp thụ đượ đo ở bư c
sóng 510 nm [19].
Bảng 2.3 Đường chuẩn Quercetin (0 – 0.1 mg/ml)
Nồn độ Quercetin

20

40

60

80

100

Quercetin 1mg/ml (µl)

2

4

6

8

10

H2O (µl)

98

96

94

92

90

(µg/ml)

20 µl Quercetin các nồn độ/ giến (Đ 96 iếng)
H2O (µl)

20

20

20

20

20

NaNO2 5% (µl)

6

6

6

6

6

6 phút
AlCl3 10% (µl)

6

6

6

6

6

40

40

40

40

40

54

54

54

6 phút
NaOH 1M (µl)

15 phút
H2O (µl)

54

54
Ủ 25oC, 15 phút
∆OD 510nm
13


-

S u hi ô qu y v

-

Ph

-

Pha loãng mẫu trên v i

-

Cho 20µl mẫu đ ph o n ở trên hoặc chất chuẩn (Quercetin 1mg/ml)/giến ( đ

phân đoạn d ch chiết, thu được m (g) cao chiết chiết

phân đoạn mẫu d ch chiết về cùng 1 nồn độ theo khối ượng
độ pha loãng 1:10 và 1:50, v/v

96 giếng)
-

20 µl nư c cất/giếng

-

6µl NaNO2 5%/giếng

-

Sau 6 phút, thêm vào 6µl AlCl3 10% (pha trong MeOH)/giếng

-

Sau 6 phút, thêm vào 40 µl NaOH 1M/giếng

-

Chờ 15 phút, cho vào 54 µl nư c cất/giếng

-

Đo mật độ quang trên máy UV-vis ở bư c sóng 510nm

. .

m ượn steroid

N uyên tắ
Đ nh Thực hiện phản ng Liebermann-Burchard của mẫu sterol tổng và mẫu chuẩn
cholesterol (Merck): Sterol / CHCl3 + thuốc thử Liebermann-Burchard (Thuốc thử : 1ml
Ac2O ,1ml CHCl3 để lạnh ở 0oC ,thêm vài giọt H2SO4 ) ph c màu xanh lục. Mẫu thử
là d nh chiết hòa tan trong cloroform cho vào vài giọt thuốc thử đ ph sẳn như trên Đo
độ hấp thụ trên máy quang phổ hấp thụ UV-vis ở bư c sóng 620 nm, từ đó t nh toán hàm
ượng sterol tổng bằn phươn ph p so s nh: [20].

14


Bảng 3.4 Đường chuẩn Choleslerol (0 – 0,12 mg/ml)

Nồn độ Choleslerol (µg/ml)

20

40

60

80

100

120

Choleslerol 1mg/ml (µl)

2

4

6

8

10

12

MeOH (µl)

98

96

94

92

90

88

4 µl Choleslerol các nồn độ/ giến (đ 96 iếng)

100 µl thuốc thử Liebermann-Burchard
Ủ 25oC, 5 phút
OD620nm

Phươn ph p thực hiện
- S u hi ô qu y
- Ph

phân đoạn, thu được m (g) cao chiết

phân đoạn mẫu d ch chiết về cùng 1 nồn độ theo khối ượng bằng MeOH

- Pha loãng mẫu trên v i độ pha loãng 1:10 và 1:50, v/v
- 4µl mẫu đ ph o n ở trên hoặ

hất Choleslerol (1mg/ml) iến ( đ 96 iến )

- 100µl thuốc thử Liebermann-Burchard /giếng
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong tối 5 phút
- Đo mật độ quang trên máy UV-vis ở bư c sóng 620nm.

15


. .5 Đ nh

ho t t nh ây độc lên tế b o Un thư
Nuôi cấy dòng tế bào ung máu K562

-R đôn từ bình nito lỏng

Qu n s t dư i kính hiển vi

Tế b o un thư nổi

Thu hồi vào các falcon

Ly tâm

Đếm tế bào

- Đ 96 iếng

Thêm 100𝜇𝑙 tế bào/ giếng

- Buồn đếm hồng cầu

- 104 tế bào
- 24h, 37oC , 5% CO2

Ủ

Thêm 1 𝜇𝑙 d ch chiết

Ủ

X

- 72h, 37oC , 5% CO2

đ nh độ sống/ chết

- Phươn ph p MTT

Hình 2.2. Quy trình đánh giá khả năng gây độc lên tế bào Ung thư máu K562

16


Thuyết mình quy trình
-

Thực hiện khảo s t t

độn

ây độc của d ch chiết hải miên s u hi phân đoạn

v i các dung môi trên dòng tế b o un thư m u K 6
-

Các dòng tế b o đượ r đôn từ các ống stock tế bào trong nito lỏn , được ủ

trong bể ủ nhiệt 37oC. Bổ sung 2- m môi trường vào falcon có ch a tế b o, s u đó đ m
đi y tâm loại bỏ d ch.
-

S u đó tế b o được nuôi cấy trong các bình flask, v i môi trường nuôi cấy RPMI

1640 bổ sung 10 % Fetal Bovine Serum (FBS) và 1% kháng sinh Penicillin +

St ptomy in (PS), điều kiện nuôi cấy ở 37oC, 5% CO2.
-

Sau 3 – 5 ngày khi tế b o đ bắt đầu tăn sinh, thực hiện qu n s t dư i kính hiển

vi ư

ượng mật độ ũn như qu n s t tạp nhiễm. Sau khi mật độ tế b o đạt hơn 8 %

thực hiện thu hồi tế bào cho việc khảo sát khả năn

ây độc của d ch chiết hải miên và

cấy chuyền [21].
-

Thực hiện huyền ph để tách rời các cụm tế bào.

-

Thu hồi các dòng tế bào vào các ồng falcon. Ly tâm 1000rpm, nhiệt độ phòng, 4

phút loại bỏ d ch nổi và thu cặn tế bào. Bổ sun

m môi trường RPMI và huyền ph để

tách rời tế bào.
-

S u đó, mật độ của các các dòng tế b o đượ x

đ nh bằng buồn đếm hồng cầu

và thuốc nhuộm trypan blue
-

Pha loãng tế bào v i môi trườn để đạt được mật độ tế bào 104 tế bào/ giếng v i

thể tích là 100
-

. Ủ trong vòng 24h, 37oC, 5% CO2

Các tế bào sẽ được xử lý v i 1

v i những nồn độ đ đượ x

đ nh s u hi đ

khảo sát IC50.
-

Tế bào sau khi xử ý được ủ trong các khoảng thời i n 4h, 48h, 7 h để x

thời gian xử lý thuốc phù hợp.
-

S u đó hả năn

Phươn ph p đ nh

ây độc tế b o đượ đ nh i bằn phươn ph p MTT [21].
độ sống chết tế bào : Phươn ph p MTT
17

đ nh


Phươn ph p MTT

phươn ph p phổ biến d n để đ nh i sự sống chết của tế bào

ng tạo màu của thuốc thử. Nguyên lý củ phươn

dựa trên phản

ph p

vòn

tetrazolium trong thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt độn , dư i tác dụng
củaenzym dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím
formazan. Kết quả đượ đọc trên máy quang phổ, ó độ chính xác cao [22].
Phươn ph p t ến hành :
- Nuôi tron đ 96 iếng
Dòng tế b o được xử lý bằng d ch chiết

- 72h, 37oC, 5%CO2

Thêm 20 𝜇𝑙 MTT 5mg/ml

Loại bỏ môi trường

Thêm 100 𝜇𝑙 DMSO 100%

Đọc kết quả ở bư c sóng 540nm

Hình 2.3. Quy trình đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT
Dòng tế b o được xử lý v i
tron

vòn 7 h được bổ sun

phân đoạn d ch chiết Hải miên haliclona B003
μ dun d ch MTT có nồn độ 5 mg/mL và tiếp tục ủ

trong 3 giờ. Enzyme dehydrogenase của những tế bào sống sót sẽ chuyển hóa MTT thành
tinh thể màu tím formazan không b hò t n tron môi trường nuôi cấy. Formazan sẽ
được hòa tan bằn DMSO v đo độ hấp thu ở bư c sóng 540 nm. Tỷ lệ tế bào sống sót
biểu th khả năn

ây độc lên tế bào của cao chiết. Khả năn

ây độc càng cao thì số

ượng tế bào sống sót càng thấp. Tỷ lệ phần trăm tế bào sốn sót đượ x

đ nh bằng cách

so sánh giá tr đo độ hấp thụ OD540nm ở giếng thử nghiệm (có xử lý d ch chiết) v i giá tr

đo độ hấp thụ ở giến đối ch ng (không xử lý v i d ch chiết) [23].
Tỷ lệ c chế =

X 100%
18


IV. Dự kiến nội dung luận văn
MỞ ĐẦU

hươn

: Tổng quan. ...........................................................................................................

1.1 Gi i thiệu chung về Hải miên .......................................................................................
. . Đặ điểm cấu tạo và sinh lý .....................................................................................
. . Đặ điểm sinh sản ....................................................................................................
1.1.3. Hệ thống phân loại .................................................................................................
1.2 Haliclona sp...................................................................................................................
1.3 Thành phần và hoạt tính sinh học của Hải miên Haliclona.sp ......................................
1.3.1 Các hợp chất terpene ................................................................................................
1.3.2 Các hợp chất alkaloid ...............................................................................................
1.3.3 Các hợp chất có ch a mạch dài ...............................................................................
1.3.4 Hoạt tính sinh học của các loài Hải miên Haliclona sp ...........................................
1.4 Tình hình nghiên c u tron v n o i nư c trên Hải miên Haliclona sp
hươn

vật ệu v phươn ph p

. vật iệu

2.1.1 phươn ph p
hươn

ết quả v b n uận
KẾT LUẬN

Hải miên ở vùng biển Việt Nam rất phon phú, đ dạng, trữ ượng l n ch a hàng
loạt các hoạt chất sinh học tiềm năn v d ch chiết từ Hải miên biểu hiện khả năn
khuẩn, h n un thư. Việc nghiên c u, xây dựng quy trình t h
sinh họ từ

hất ó hoạt t nh

ải miên Haliclona sp. bằn phươn ph p Soxh t v i dun môi m th no ,

s u đó ô qu y d h hiết, phân đoạn v i
h

h n

dun môi ........., thu đượ

d h hiết ó

hất ó hoạt t nh sinh họ . V i mon muốn đạt đượ hiệu suất t h hiết trên
19


8 % v một số phân đoạn sẽ thu đượ
b o Un thư n dụn v o n hiên

hoạt hất ó hả năn

ây độ đặ hiệu ên tế

u thuố điều tr un thư từ đó h i th

giá tr , lợi ích tiềm tàng mà Hải miên Haliclon sp. mang lại đặc biệt tron

v nân

o

nh vự dược

phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. D. E. Williams, A. Steino, N. J. de Voogd, A. G. Mauk, R. J. Andersen, Halicloic acids
A and B isolated from the marine sponge Haliclona sp. collected in the Philippines inhibit
indoleamine 2,3-dioxygenase, J. Nat. Prod., 2012, 75 (8), 1451-1458.
2. Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Hoang Thanh Huong, Nguyen Xuan Cuong, Pham
Quoc Long, Nguyen Hoai Nam, Tap Chi Hoa Hoc, 2005, 43 (4), 499-502.
3. Nguyễn Thi Phươn

hi,

o n Th nh

ươn , hâu Văn Minh, Tap Chi Dươc Hoc,

2005, 345, 10-12.
4. B.S. Hwang, J.S. Oh, E.J. Jeong, C.J. Sim, J.R. Rho, Densanins A and B, new
macrocyclic pyrrole alkaloids isolated from the marine sponge Haliclona densaspicula,
Org.Lett., 2012, 14 (24), 6154-6157.
5. H. Yamazaki, D.S. Wewengkang, S. Kanno, M. Ishikawa, H. Rotinsulu,
R.E.Mangindaan, M. Namikoshi, Papuamine and haliclonadiamine, obtained from an
Indonesian sponge Haliclona sp., inhibited cell proliferation of human cancer cell lines,
Nat. Prod. Res., 2013, 27 (11), 1012-1015.
6. K.H. Jang, G.W. Kang, J.E. Jeon, C. Lim, H.S. Lee, C.J. Sim, K.B. Oh, J. Shin,
Haliclonin A, a new macrocyclic diamide from the sponge Haliclona sp, Org.Lett., 2009,
11 (8), 1713-1716.
7. M.A. Rashid, K.R. Gustafson, J.L. Boswell, M.R. Boyd, Haligramides A and B,
two new cytotoxic hexapeptides from the marine sponge Haliclona nigra, J. Nat. Prod.,
2000, 63 (7), 956-959.

20


8. G. Koren-Goldshlager, Y. Kashman, M. Schleyer, Haliclorensin, a novel diamino
alkaloid from the marine sponge Haliclona tulearensis, J. Nat. Prod., 1998, 61 (2), 282284.
9. M.A. Rashid, K.R. Gustafson, M.R. Boyd, A new isoquinoline alkaloid from the
marine sponge Haliclona species, J. Nat. Prod., 2001, 64 (9), 1249-1250.
10. S. Yu, Z. Deng, P. Proksch, W. Lin, Oculatol, oculatolide, and A-nor sterols from the
sponge Haliclona oculata, J. Nat. Prod., 2006, 69 (9), 1330-1334.
11. T. Hattori, K. Adachi, Y. Shizuri, New ceramide from marine sponge Haliclona
koremella and related compounds as antifouling substances against macroalgae, J.Nat.
Prod., 1998, 61 (6), 823-826.
12. Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Tran Thu Ha, Phan Van Kiem, Hoang Thanh
Huong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, J.-H. Hyun, H.- K. Kang,

Y.H. Kim, C29 sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese
marine sponge Ianthella sp. and their anticancer properties, Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters, 2009, 19 (16), 4584-4588.
13. Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Hoang Thanh Huong, Tran
Thu Ha, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Xuan Cuong, J.-H. Hyun, H.K. Kang, Y.H. Kim, A new C29-sterol with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the
Vietnamese marine sponge lanthella sp, Archives of Pharmacal Research, 2009, 32, (12),
1695-1698.
14. Hoang Le Tuan Anh, Phan Van Kiem, Pham Hai Yen, Chau Van Minh, Dan Thi
Thuy Hang, Nguyen Thi Cuc, Durong Thi Hai Yen, Duong Thi Dung, Nguyen Xuan
Nhiem, Bui Huru Tai, Tran Hong Quang, Steroids from Vietnamese marine sponge
Mycale plumose, Tap Chi Hoa Hoc, 2012, 50 (6), 737-741.
15. E.G. Lyakhova, S.A. Kolesnikova, A.I. Kalinovsky, S.S. Afiyatullov, S.A.
Dyshlovoy, V.B. Krasokhin, C.V. Minh, V.A. Stonik, Bromine-containing alkaloids from
the marine sponge Penares sp, Tetrahedron Letters, 2012, 53 (45), 6119-6122.
16. S.A. Kolesnikova, E.G. Lyakhova, A.I. Kalinovsky, M.A. Pushilin, S.S. Afiyatullov,
E.A. Yurchenko, S.A. Dyshlovoy, C.V. Minh, V.A. Stonik, Isolation, Structures, and
21


Biological Activities of Triterpenoids from a Penares sp. Marine Sponge, Journal of
Natural Products, 2013, 76 (9), 1746-1752.
17. Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Ngo Van Quang, Chau Van Minh, Nguyen
Hoai Nam, Nguyen Thi Cuc, Hoang Le Tuan Anh, Bui Huu Tai, Pham Hai Yen, Nguyen
Xuan Cuong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Thi Hoai, N.Y. Kim, S.J. Park, K.S. Hyun,
New butenolide and pentenolide from Dysidea cinerea, Natural product communications,
2013, 8 (12), 1751-1752.
18. Isolation and Structure Elucidation of Bioactive Secondary Metabolites from
Indonesian Marine Sponges, 29-31
19. A. Pę

: K. Pyrzyns , D p rtm nt o

h mistry, Univ rsity o W rs w, v u tion

of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid Content Assay.
20. Wall, M. E. and Kelley, E. G., Determination and nature of leaf sterols, Anal. Chem.
19: (1990), 677-683.
21. ATCC ANIMAL CELL CULTURE GUDE.: Globally Delivered.
22. Terry L Riss, PhD, Richard A Moravec, BS, Andrew L Niles, MS, Sarah Duellman,
PhD, Hélène A Benink, PhD, Tracy J Worzella, MS, and Lisa Minor., "Cell Viability
Assays," 2013.
23. Vandana Patravale, Prajakta Dandekar ,Ratnesh Jain, 4 - Nanotoxicology: evaluating
toxicity potential of drug-nanoparticles., 2014.

22