KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM Salmonella TRÊN THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU THỊ THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM Salmonella TRÊN THỊT TƯƠI
TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU THỊ
THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ KIM THUẬN

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM Salmonella TRÊN THỊT TƯƠI

TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU THỊ
THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

NGUYỄN THỊ KIM THUẬN

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh, Quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt
cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu ở trường.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải, Cử nhân Võ
Tấn Hùng đã hết lòng dạy bảo, giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành tốt khóa luận.
Bên cạnh đó tôi cũng chân thành cảm ơn chị Đặng Thị Thu Hường cùng các cô,
chú, anh chị đang công tác tại Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều Trị - Chi Cục
Thú Y Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian
tiến hành đề tài.
Cảm ơn các bạn bè đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong những năm tháng học tập
dưới mái trường mến yêu này.
Xin cảm ơn Hội đồng giám khảo đã dành thời gian đọc và xem xét đề tài tốt
nghiệp này.
Mãi mãi ghi nhớ công ơn sinh thành, dưỡng dục của Ba Mẹ - Người đã cho con
cả cuộc đời và sự nghiệp.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Kim Thuận

i


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại một số chợ và siêu thị
thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh” được tiến hành từ ngày 15/12/2012 đến
15/06/2013 tại Phòng Kiểm nghiệm Vi sinh - Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều
Trị - Chi Cục Thú Y Tp. HCM và Phòng Xét nghiệm Chẩn đoán Thú y Hàn – Việt,
trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Mục đích là khảo sát tình trạng vấy nhiễm
Salmonella trên thịt tươi (heo, bò, gà) tại một số chợ và siêu thị thuộc địa bàn Tp.
HCM, sử dụng phương pháp PCR để khẳng định Salmonella.
Bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên, chúng tôi thu thập được 80 mẫu thịt
tươi trong đó có 45 mẫu tại chợ và 35 mẫu tại siêu thị. Qua khảo sát, ghi nhận: tỷ lệ
nhiễm Salmonella trung bình trên các mẫu thịt tươi là 58,8% và tỷ lệ nhiễm
Salmonella tại chợ (64,4%) cao hơn tại siêu thị (51,4%). Trong các loại thịt được lấy
tại chợ và siêu thị, thịt heo có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao nhất (65,1%), kế đến là thịt
gà (52,9%) và thấp nhất là thịt bò (50,0%). Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại
siêu thị cao hơn so với chợ (80,0% so với 60,6%); tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt bò,
thịt gà tại chợ cao hơn so với siêu thị (66,7% và 100% so với 36,4 và 42,9% ).
Vậy tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi khá cao so với tiêu chuẩn Việt Nam là
không được phép có Salmonella trên quầy thịt. Cần phải có những chiến lược để giảm
tỷ lệ này nhằm cung cấp nguồn thịt tươi an toàn cũng như bảo vệ người tiêu dùng.

ii


SUMMARY

Study “Prevalence of Salmonella on fresh meat from markets and supermarkets
in Ho Chi Minh city” was carried out from December 15th, 2012 to June 15th , 2013 in
the laboratory of Diagnostic, Tests and Treatment Station – Veterinary Department,
Ho Chi Minh city and Diagnostic laboratory VietNam – Korea, Agriculture
University, Ho Chi Minh city. This study was aimed at determining and comparing the
prevalence of Salmonella on fresh meat (pork, beef, chicken) from markets and
supermarkets in Ho Chi Minh city, using PCR to confirm Salmonella.
A total of 80 fresh meat samples (45 samples from markets and 35 samples from
supermarkets), overall Salmonella prevalence was 58.8%. The higher contaminated
frequence was in the products from market (64.4%) as compared to which from
supermarket (51.4%). The most contaminated was pork samples (65.1%), fewer with
chicken (52.9%) and beef (50.0%) samples. The contaminated frequency was different
between the samples from the supermarket and market by espece sample. For the pork,
80.0% samples of supermarket was positive with Salmonella as compared to the which
of market (60.6%); however, the higher frequency of contamination (66.7% and 100%)
in the beef and chicken was found with products from market as compared to that from
supermarkets (36.4% and 42.9%).
This study demonstrated that a high proportion of fresh meat was contaminated
with Salmonella. Strategies to reduce Salmonella levels on fresh meat in Vietnam
should be undertaken to improve the safety of meat products and reduce the incidence
of human Salmonellosis from meat consumption.
Key word: beef, chicken, market, Salmonella, supermarket, PCR, pork, prevalence

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn .............................................................................................................................i 
Tóm tắt ..................................................................................................................................ii 
Summary ............................................................................................................................. iii 

Mục lục ................................................................................................................................iv 
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................................vii 
Danh sách các hình ........................................................................................................... viii 
Danh sách các bảng .............................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 
1.1  Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1 
1.2  Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2 
1.3  Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 
2.1  Vi sinh thịt .................................................................................................................... 3 
2.2.  Đại cương về Salmonella ............................................................................................. 4 
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu ...................................................................................................... 4 
2.2.2 Hệ thống phân loại ....................................................................................................... 4 
2.2.3.Đặc điểm chung ........................................................................................................... 5 
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái.................................................................................................... 5
2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy .................................................................................................... 5
2.2.3.3 Đặc điểm sinh hóa .................................................................................................... 6
2.2.4 Cấu tạo kháng nguyên ................................................................................................. 6
2.2.5 Độc tố của Salmonella ................................................................................................. 6 
2.2.6 Sức đề kháng của Salmonella ...................................................................................... 7 
2.2.7 Tính biến dị của Salmonella ........................................................................................ 7 
2.2.8. Ngộ độc do Salmonella ............................................................................................... 8 
2.2.8.1 Các công đoạn dễ cảm nhiễm Salmonella trong hệ thống HACCP ......................... 8 
2.2.8.2 Điều kiện và cơ chế gây ngộ độc .............................................................................. 8 
2.2.8.3 Triệu chứng ngộ độc ................................................................................................. 8 

iv


2.2.8.4 Tình hình ngộ độc do Salmonella ............................................................................. 9 

2.3. Kỹ thuật PCR ................................................................................................................. 9 
2.3.1 Giới thiệu ..................................................................................................................... 9 
2.3.2 Nguyên lý..................................................................................................................... 9 
2.3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR ........................................................................ 11 
2.4 Ứng dụng PCR trong phát hiện Salmonella ................................................................. 11 
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 14 
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 14 
3.2. Vật liệu ......................................................................................................................... 14 
3.2.1 Đối tượng khảo sát ..................................................................................................... 14 
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................... 14 
3.2.3 Môi trường và hóa chất .............................................................................................. 14 
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 15 
3.3.1 Cách bố trí mẫu .......................................................................................................... 15
3.3.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu thịt .............................................................. 16 
3.3.3 Qui trình định tính Salmonella .................................................................................. 16
3.3.4 Phương pháp PCR khẳng định Salmonella ............................................................... 18 
Xác nhận quy trình ................................................................................................. 18
Phương pháp ly trích DNA ..................................................................................... 18
Các thông số chạy PCR .......................................................................................... 19
Điện di kiểm tra sản phẩm DNA ............................................................................ 19
3.4 Chỉ tiêu theo dõi............................................................................................................ 20 
3.5 Xử lý số liệu .................................................................................................................. 20 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 21 
4.1. Kết quả PCR ............................................................................................................... 21 
4.1.1 Xác định Salmonella .................................................................................................. 21 
4.1.2 Xét nghiệm Salmonella trong mẫu ............................................................................ 23 
4.2 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại chợ và siêu thị ..................................... 23 
4.3 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các chợ ................................................ 26 
4.4 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các siêu thị .......................................... 27 
4.5 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt heo, bò, gà tại các chợ và siêu thị.................... 29 

v


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 32 
5.1 Kết luận ......................................................................................................................... 32 
5.2 Đề nghị .......................................................................................................................... 32 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 33 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATTP
ctv
DNA
E. coli
g/l
HACCP
NXB
PCR
TCVN
Tm
Tp. HCM
UV

An Toàn Thực Phẩm
Cộng tác viên
Deoxyribo Nucleic Acid
Escherichia coli

gam/lít
Hazard Analysis and Critical Control Point
Nhà Xuất Bản
Polymerase Chain Reaction
Tiêu chuẩn Việt Nam
Temperature Melting
Thành phố Hồ Chí Minh
UltraViolet radiation

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella .................................................................................... 5
Hình 2.2 HACCP trong chăn nuôi và giết mổ lưu hành súc sản ................................. 8
Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR ............................................................................. 10
Hình 2.4 Chu trình nhiệt PCR ................................................................................... 10
Hình 2.5 Cụm gen gây bệnh SPI - I........................................................................... 12
Hình 3.1 Salmonella trên môi trường tăng sinh chọn lọc .......................................... 17
Hình 3.2 Qui trình định tính Salmonella .................................................................. 17
Hình 3.3 Salmonella trên môi trường phân lập XLD ................................................ 18
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR chạy thử với cặp mồi S139 và S141......... 22
Hình 4.2 Kết quả Blast và so sánh trình tự trên NCBI .............................................. 23
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi S139 và S141 ....................... 24
Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại chợ và siêu thị ........................... 25
Hình 4.5 Bảo quản thịt tại chợ ................................................................................... 26
Hình 4.6 Bảo quản thịt tại siêu thị ............................................................................. 26
Hình 4.7 Điều kiện bày bán thịt tại chợ..................................................................... 28
Hình 4.8 Vissan – nguồn cung cấp thịt cho siêu thị có quy trình giết mổ công nghiệp..29
Hình 4.9 Tỷ lệ nhiễm Salmonella giữa các loại thịt heo, bò và gà............................ 30

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số serotyp Salmonella được tìm thấy từ thực phẩm ............................ 3
Bảng 2.2 Nồng độ và thể tích các thành phần cho 50 μl PCR .................................. 11
Bảng 3.1 Số lượng mẫu thịt heo, bò, gà lấy tại chợ và siêu thị ................................ 14
Bảng 3.2 Trình tự primer S139 và S141 ................................................................... 15
Bảng 3.3 Nguồn gốc các mẫu thịt tươi lấy tại chợ.................................................... 15
Bảng 3.4 Nguồn gốc các mẫu thịt tươi lấy tại siêu thị .............................................. 16
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất PCR ......................................................................... 19
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt PCR với cặp primer S139 và S141................................... 19
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại chợ và siêu thị ......................... 23
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các chợ .................................... 26
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các siêu thị................................ 27
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella giữa các loại thịt heo, bò và gà........................... 29
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt heo, bò, gà giữa chợ và siêu thị ............ 30

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1

Đặt vấn đề
An toàn thực phẩm là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, được tiếp cận với thực

phẩm an toàn đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con người. Thực phẩm an toàn
đóng góp to lớn trong việc cải thiện sức khoẻ con người, chất lượng cuộc sống và chất

lượng giống nòi. Tuy nhiên, công tác bảo đảm ATTP ở nước ta còn nhiều khó khăn,
thách thức. Tình trạng ngộ độc thực phẩm có xu hướng tăng và ảnh hưởng không nhỏ
tới sức khoẻ cộng đồng.
Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người
(chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan đến
thực phẩm. Trong tổng số vụ ngộ độc thực phẩm thì ngộ độc do vi sinh vật chiếm 51%
và vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật
gây ra (Cục an toàn vệ sinh thực phẩm - Bộ Y tế). Salmonella phát triển trong cơ thể
người gây bệnh thương hàn và phó thương hàn. Một lượng lớn tế bào sinh nội độc tố
và khi chết sẽ giải phóng ra gây ngộ độc. Ngộ độc do Salmonella có thể gây tiêu chảy
kèm theo sốt, suy nhược, mệt mỏi, một số ca nặng dẫn đến tử vong. Mầm bệnh còn lưu
lại trên cơ thể người bệnh một thời gian dài, phát tán vào môi trường xung quanh và
lây nhiễm sang những đối tượng khác.
Mặc dù đã có quy định về điều kiện sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo đảm
ATTP, quy chế điều tra ngộ độc thực phẩm nhưng việc tuân thủ các quy định này còn
chưa nghiêm túc. Ý thức trách nhiệm của người sản xuất, kinh doanh thực phẩm đối
với sức khỏe cộng đồng còn chưa cao.
Xuất phát từ thực tế và các yêu cầu nói trên, được sự đồng ý của Trường Đại
Học Nông Lâm Tp. HCM, khoa Công Nghệ Sinh Học, với sự hướng dẫn của PGS.TS
Nguyễn Ngọc Hải và các anh chị trong Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị, tiến
hành đề tài “Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại một số chợ và siêu thị
thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh”.

1


1.2

Yêu cầu của đề tài
Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên các mẫu thịt tươi tại một số chợ và siêu thị

thuộc địa bàn Tp. HCM nhằm đánh giá chất lượng nguồn thịt tươi cung cấp cho người
tiêu dùng và cảnh báo thực trạng vệ sinh thịt tươi tại Tp. HCM.
1.3

Nội dung thực hiện
Lấy mẫu thịt tươi tại một số chợ và siêu thị trên địa bàn Tp. HCM. Xác định tỷ

lệ mẫu thịt tươi nhiễm Salmonella, sử dụng phương pháp PCR để khẳng định
Salmonella.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Vi sinh thịt
Thịt là một trong những nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có chứa

nhiều acid amin cần thiết, các chất béo, chất khoáng, vitamin và một số các chất thơm
hay còn gọi là chất chiết xuất. Theo thành phần hóa học của các loại thịt, chúng ta thấy
rằng thịt không những là thức ăn tốt cho người mà còn là môi trường thích hợp cho vi
sinh vật có hại phát triển. Các vi sinh vật này thường nhiễm vào thịt theo hai con
đường: nội sinh và ngoại sinh.
Vi sinh vật thường nhiễm nhiều trên bề mặt thịt và phát triển làm cho số lượng
tăng lên, đặc biệt khi thịt giữ trong điều kiện nóng khiến vi sinh vật tăng nhanh và thịt
chóng hư hỏng. Khi ăn phải các loại thực phẩm mang vi sinh vật gây bệnh hoặc độc tố
của chúng sẽ gây ra nhiều bệnh cho cơ thể người và động vật, có thể để lại hậu quả
nghiêm trọng thậm chí dẫn đến tử vong. Các bệnh thường gặp là thương hàn do vi

khuẩn Salmonella, tả do Shigella, lao do Micobacterium,... Ngoài ra còn có thể dẫn
đến các triệu chứng ngộ độc nghiêm trọng nếu chúng ta ăn phải độc tố của vi khuẩn
như độc tố botulin của vi khuẩn độc thịt Clostridium botulinum, độc tố của vi khuẩn tụ
cầu vàng Staphylococcus aureus.
Trong đó ngộ độc do Salmonella là trường hợp ngộ độc thức ăn do vi khuẩn
thường hay gặp nhất trên người và động vật. Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là do
Salmonella typhimurium, Salmonella cholerae, Salmonella enteritidis.
Bảng 2.1 Một số serotyp Salmonella được tìm thấy từ thực phẩm có nguồn gốc động
vật và từ mẫu bệnh phẩm người
STT Các serotyp của Salmonella

STT

Các serotyp của Salmonella

1

S. typhimurium

7

S. thompson

2

S. enteritidis

8

S. anatum

3

S. panama

9

S. agona

4

S. infantis

10

S. abony

5

S. derby

11

S. hadar

6

S. saint- paul

(Dương Thanh Liêm, 2010)

3


Tại Việt Nam, bệnh thương hàn do Salmonella typhi và Salmonella paratyphi
A, B, C gây ra. Bệnh rất nguy hiểm, có thể gây ra biến chứng xuất huyết đường tiêu
hóa, khiến ruột trở nên mỏng và có thể bị thủng. Salmonella thường vào cơ thể người
qua đường ăn uống. Độc tố vi khuẩn tiết ra có thể làm tổn thương hay làm chết các tế
bào lót bên trong ruột làm ruột bị mất nước dẫn đến tiêu chảy. Một số Salmonella có
thể sống sót trong các tế bào của hệ miễn dịch và có thể vào máu gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết. Những Salmonella khác có thể vào túi mật khiến bệnh nhân mang mầm
bệnh mãn tính. Trong trường hợp sau này, Salmonella theo mật truyền từ gan vào phân
rồi theo phân thải ra ngoài gây bệnh cho người khác (ytehagiang.org.vn/old/index.php
?option = article &id = 408 hong-ng-c-do-nhim-salmonella&catid=94:y-t-d-phong&itemid=185).
2.2.

Đại cương về Salmonella

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu
Giống Salmonella gồm trên 600 chủng vi khuẩn, chủng đại diện của giống này
là Salmonella cholerae suis, trực khuẩn phó thương hàn lợn, do Salmon và Smith phân
lập ra vào năm 1885 trên lợn mắc bệnh dịch tả.
Theo đề nghị của Hội nghị vi sinh vật học Quốc tế năm 1934, để kỷ niệm người
đầu tiên tìm ra vi khuẩn, người ta đặt tên cho vi khuẩn này là Salmonella.
Năm 1888, Gaertner phân lập được Salmonella enteritidis từ thịt của bò bị mắc
bệnh. Năm 1889, Klein phân lập được Salmonella gallinarum từ gà mắc bệnh thương
hàn. Năm 1909, Rettger phân lập được Salmonella pullorum từ gà con mắc bệnh bạch
lỵ (Nguyễn Quang Tuyên, 2010).
2.2.2 Hệ thống phân loại
Salmonella thuộc:

Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc: Salmonelleae
Salmonella có 2 loài là Salmonella enterica và Salmonella bongori. Theo hệ
thống phân loại của Kauffmann –White:
Salmonella enterica chia thành 6 loài phụ:
I

Salmonella enterica

II

Salmonella salamae

IIIa

Salmonella arizona
4


IIIb

Salmonella diarizona

IV

Salmonella houtenae

VI

Salmonella indica

Salmonella bongori chỉ có một loài phụ V (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.2.3. Đặc điểm chung
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái
Salmonella là một loại vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 0,6 x 1 - 3 μ, không hình thành giáp mô và nha bào, phần lớn vi khuẩn thuộc giống
Salmonella có thể di động, trên thân có lông (7 đến 12 lông chung quanh thân), trừ S.
pullorum và S. gallinarum không có lông, gram âm, dễ nhuộm với các thứ thuốc
nhuộm thông thường (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella
(futurity.org/health-medicine/sensors-turn-salmonella-into-a-killer)

2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Salmonella vừa hiếu khí vừa yếm khí, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp
37oC, pH 7,2 - 7,6. Salmonella của gia súc sinh trưởng tốt trong điều kiện hiếu khí,
kém hơn ở điều kiện yếm khí.
Trên môi trường nước thịt, Salmonella làm canh trùng đục đều, nếu nuôi lâu dài
thì ở đáy ống có cặn, trên môi trường có màng mỏng.
Trên môi trường thạch, xuất hiện những khuẩn lạc tròn, trong sáng, ẩm ướt,
nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ hơn và trắng hơn khuẩn lạc của E. coli. Thỉnh
thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R, nhám, mặt trong mờ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

5


2.2.3.3 Đặc điểm sinh hóa
Trực khuẩn Salmonella phần lớn lên men và sinh hơi đường glucoza, mannit,
mantoza, galactoza, levuloza, arabizona. Phần lớn các loài Salmonella không lên men
lactoza và saccaroza.

Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không thủy hóa ure, không sản
sinh indol, sinh H2S, phản ứng VP âm tính, phản ứng MR dương tính (Nguyễn Quang
Tuyên, 2010).
2.2.4 Cấu tạo kháng nguyên
Salmonella có ba lọai kháng nguyên O, H và K:
Kháng nguyên O: Về mặt cấu trúc kháng nguyên O, những nghiên cứu mới đây
cho biết kháng nguyên O không phải là một đơn chất mà gồm nhiều phân tử kháng
nguyên cấu tạo thành, gồm 40 thành phần khác nhau được đánh số la mã hay số Ả
Rập. Do sự khác nhau giữa các loài Salmonella về phương diện cấu tạo kháng nguyên
O nên người ta đã chia Salmonella ra làm 34 nhóm: A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2,
E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, 49, 50.
Kháng nguyên H: Cấu tạo của kháng nguyên H cũng rất phức tạp, chỉ ở các
Salmonella có lông. Kháng nguyên H chia làm hai pha:
Pha 1: có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông biểu thị bằng
chữ mẫu la tinh thường như a, b, c, d, e, f, g, h,…z
Pha 2: không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác
và có khi với trực khuẩn E. coli, gồm có hơn 6 loại biểu thị bằng số Ả Rập: 1, 2, 3, 4,
5, 6, hay chữ la tinh thường: e, n, x….
Kháng nguyên K: Kháng nguyên K (Kapsel - vỏ) của vi khuẩn Salmonella
không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ đã biết là kháng nguyên Vi (Virulence - độc
tính) có ở hai typ huyết thanh Salmonella typhi và Salmonella paratyphi (Nguyễn
Quang Tuyên, 2010).
2.2.5. Độc tố của Salmonella
Nội độc tố
Nội độc tố của Salmonella rất mạnh và chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào vi
khuẩn bị phân hủy. Tiêm nội độc tố với liều thích hợp cho chuột lang, có khả
năng gây ngộ độc thần kinh, gây hôn mê, co giật và chết chuột lang trong vòng

6

48 giờ. Nội độc tố của Salmonella gồm có hai loại là độc tố ruột gây sung
huyết, mụn loét trên ruột và độc tố thần kinh gây triệu chứng thần kinh.
Ngoại độc tố
Ngoại độc tố của Salmonella chỉ hình thành trong điều kiện invivo và trong
nuôi cấy kị khí. Ngoại độc tố có tác động vào hệ thần kinh và ruột, có tính
kháng nguyên bền vững. Có thể chế thành giải độc tố bằng cách trộn thêm 5%
formol vào ngoại độc tố, để ở 37oC trong 20 ngày. Giải độc tố tiêm cho thỏ sẽ
tạo ra kháng thể ngưng kết, kháng thể kết tủa và thỏ có khả năng trung hòa độc
tố và vi khuẩn (Nguyễn Quang Tuyên, 2010).
2.2.6 Sức đề kháng của Salmonella
Salmonella bị diệt ở 70oC trong 20 phút, 75oC trong 5 phút, có thể sinh trưởng
trong môi trường thạch ở nhiệt độ 10oC trong 116 ngày. Ánh sáng mặt trời chiếu trực
tiếp diệt Salmonella ở nước trong sau 6 giờ, ở nước đục sau 9 giờ. Các chất sát trùng
như formol 1/50, acid phenic 3% diệt vi khuẩn trong 15 - 20 phút.
Trong xác động vật chết Salmonella có thể sống 100 ngày, trong đất bùn có thể
sống 3 tháng. Salmonella có thể sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối có tỷ lệ muối
29%, nhiệt độ 6 - 12oC. Xử lý bằng cách hơ lửa hay nướng miếng thịt nhiễm trùng ít
có tác dụng diệt Salmonella ở bên trong (Nguyễn Quang Tuyên, 2010).
2.2.7 Tính biến dị của Salmonella
Trong khi nuôi cấy Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên.
Biến dị S – R
Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc S dạng trơn, bóng láng, có kháng nguyên
O đặc hiệu của chủng. Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến dị,
khuẩn lạc có thể trở thành dạng nhám, xù xì, có dạng R, khi biến thành dạng R
thì kháng nguyên O không đặc hiệu nữa.
Biến dị O – H
Trong khi nuôi cấy, dưới ảnh hưởng của một số chất như acid fenic vi khuẩn sẽ
mất lông, sinh biến dị, không di động chỉ còn kháng nguyên O.
Biến dị của kháng nguyên H

Vi khuẩn có lông có thể biến dị từ pha 1 sang pha 2 có cấu tạo kháng nguyên
khác pha 1 (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

7


2.2.8. Ngộ độc do Salmonella
2.2.8.1 Các công đoạn dễ cảm nhiễm Salmonella trong hệ thống kiểm tra HACCP
Thức ăn nhiễm
Salmonella từ
phân chuồng

Xí nghiệp chăn

Lò giết mổ gia súc

Kho trữ lạnh

nuôi công

tập trung vấy

nhiễm lẫn nhau

nghiệp, quy mô

nhiễm giữa thú

giữa các quầy thịt

lớn, vệ sinh kém

khỏe và bệnh
Thịt bày bán ngoài

Vật ký chủ mang

chợ và các siêu thị

mầm bệnh truyền
lan vào thức ăn

Nguồn nước và

Người tiêu thụ trữ

chất thải nhiễm

thực phẩm ở gia

Salmonella

đình kém vệ sinh

nhiễm Salmonella

Hình 2.2 HACCP trong chăn nuôi và giết mổ lưu hành súc sản
(Dương Thanh Liêm, 2010)

2.2.8.2 Điều kiện và cơ chế gây ngộ độc

Điều kiện cần thiết để ngộ độc do Salmonella bộc phát là: (1) thực phẩm phải
chứa hoặc nhiễm vi khuẩn, (2) số lượng vi khuẩn phải đủ cao trong lúc vấy nhiễm
hoặc chúng phát triển mạnh mẽ, nghĩa là thực phẩm đó phải là môi trường tốt cho vi
khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở, (3) vi khuẩn
phải được đưa vào ống tiêu hóa.
Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, theo hệ thống bạch huyết vào tuần hoàn
gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết. Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm
mạc ruột, tiết ra độc tố. Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu. Ngoài ra vi khuẩn
trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố. Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần
kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức
năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể. Như vậy, Salmonella gây bệnh là do độc tố ruột
(enterotoxin) và có lẽ còn do cytotoxin và neurotoxin (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
2.2.8.3 Triệu chứng ngộ độc
Thời gian ủ bệnh trung bình từ 12 - 24 giờ. Đối với cơ thể yếu và nhiễm nhiều
có khi chỉ vài giờ sau xuất hiện triệu chứng, ngược lại cũng có khi kéo dài đến vài
ngày. Trước khi phát bệnh thường có hiện tượng nhức đầu, biếng ăn, mặt tái nhợt, ra
nhiều mồ hôi. Sau đó là nôn mửa, tiêu chảy… có khi nhiệt độ tăng đến 38 - 40oC. Tùy

8


theo từng trường hợp mà sốt có thể kéo dài đến 3 hoặc 7 ngày. Bệnh nặng có thể viêm
dạ dày, ruột (Dương Thanh Liêm, 2010).
2.2.8.4 Tình hình ngộ độc do Salmonella
Năm 1940, Salmonella typhi và Salmonella paratyphi được coi là nguyên nhân
chủ yếu của các bệnh ở người do Salmonella phát sinh từ thực phẩm và nước trên
phạm vi toàn thế giới. Giữa những năm 1969 và 1976, số vụ dịch phát sinh từ thực
phẩm do Salmonella gây ra khoảng 37 trong một năm ở Mỹ (Kiều Hữu Ảnh, 2010).
Ở Đan Mạch năm 1995 có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó có
19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng bị nhiễm

vi khuẩn này. Năm 1999 ở Hàn Quốc nghiên cứu cho thấy 25,9% mẫu thịt gà tươi
sống bị nhiễm Salmonella. Ở Netherland 23% thịt heo nhiễm Salmonella spp. Năm
2001 nghiên cứu của Swanen Burg và ctv cho thấy 26% thịt heo nhiễm Salmonella
( />Giữa năm 1981 và 1991, số lượng các bệnh nhiễm khuẩn Salmonella đã tăng
170% ở Anh, chủ yếu là do một dịch Salmonella enteritidis, dịch này đã đạt đỉnh vào
năm 1993 ( />Năm 2012, Viện Pasteur Tp. HCM cho biết trong hơn 1.100 mẫu thịt tươi sống
lấy tại các chợ trên thị trường Tp. HCM có hơn 32% mẫu nhiễm khuẩn Salmonella.
Trong đó, thịt lợn chiếm gần 40%, kế đến là thịt gà và thịt bò (vietbao.vn/kinh-te/385mau-thit-tuoi-nhiem-khuan-salmonella/55500457/88).
2.3.

Kỹ thuật PCR

2.3.1 Giới thiệu
Kỹ thuật PCR được nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis và cs phát minh năm
1985 tại công ty Cetus.
Phương pháp PCR là một phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên
khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp
mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này (Trần Linh Thước, 2009).
2.3.2 Nguyên lý
Phản ứng PCR được thực hiện dựa trên cơ sở đặc điểm của sự hồi tính, biến
tính và kéo dài của chuỗi DNA trong điều kiện nhiệt độ và chất xúc tác thích hợp
(Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
9


Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước biến tính (denaturation): Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn
Tm của phân tử, thường là ở 94 - 95oC trong vòng 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách
ra thành dạng mạch đơn.

Bước lai (anealation): Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các
mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng
40 - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây.
Bước tổng hợp (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA
polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tốt nhất. Thời gian của bước này
tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến
nhiều phút (Trần Linh Thước, 2009).

Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR
( />
Hình 2.4 Chu trình nhiệt PCR
( mun.ca/biologv/scarr/PCRsimplified.html)
10


2.3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR
Bảng 2.2 Nồng độ và thể tích các thành phần cho 50 μl PCR
STT

Thành phần

1

Nước cất khử ion

2
3

Đệm 10X PCR
(+MgCl2)

25 mM MgCl2

Nồng độ

Mục đích

Thể tích

-

Bù cho thể tích nhất định.

Thay đổi

1X

Giữ pH ổn định để PCR xảy ra.

5 μl

cuối cùng

1 - 4 mM

Thay đổi
Cung cấp năng lượng và
nucleoside để tổng hợp DNA.

4

Deoxynucleotide
2mM

200 μM

Nồng độ mỗi nucleotide (dATP,
dTTP, dCTP, dGTP) bổ sung

5 μl

vào hỗn hợp chung đều như
nhau để ngăn gắn sai base.
5

Polymerase

1,25

Enzyme bền nhiệt gắn dNTP

unit/50 μl

vào khuôn DNA.

Thay đổi

Đoạn DNA ngắn (20 - 30 base)
liên kết với khuôn DNA cho
6

Mồi xuôi và mồi
ngược

0,1 - 1 μM

phép Taq pol khởi động phản
ứng gắn dNTP. Cả mồi đặc hiệu

Thay đổi

lẫn mồi chung có thể được sử
dụng.
7

Sợi khuôn DNA

10 pg - 1

Làm khuôn để khuếch đại phân

μg

đoạn DNA mong muốn.

Thay đổi

(Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2003)

2.4

Ứng dụng PCR trong phát hiện Salmonella
Nuôi cấy định danh vẫn còn là phương pháp truyền thống được áp dụng trong

tất cả các phòng kiểm nghiệm vi sinh để phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm và
bệnh phẩm. Hạn chế của phương pháp này là mất nhiều thời gian từ 5 – 7 ngày. Ngày
nay với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật

11


PCR cũng được áp dụng để chẩn đoán nhanh Salmonella spp trong thực phẩm có kết
quả trong vòng 24 giờ.
Một số lượng lớn các gen tham gia vào quá trình gây bệnh bởi Salmonella. Các
gen này tập trung thành từng cụm trên nhiễm sắc thể gọi là cụm gen gây bệnh
(Salmonella Pathogenicity Island – SPI).

Hình 2.5 Cụm gen gây bệnh SPI-I
(mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/pai.cgi?Genus=Salmonella&PAI=SPI-1)

Để xâm nhiễm vào tế bào ruột, đầu tiên vi khuẩn phải bám dính vào màng nhầy
của thành ruột. Việc bám dính này được thực hiện nhờ các protein trên các khuẩn mao
(fimbriae) được mã hóa bởi 4 operon là fim, lpf, pef và agf. Locus có vai trò giúp vi
khuẩn xâm nhiễm vào tế bào biểu mô ruột là inv. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào biểu
mô ruột, Salmonella cư trú bên dưới lớp màng nhầy. Ở đây chúng thích nghi dần để
tránh sự tấn công của các thực bào và sau đó chúng xâm nhiễm vào các thực bào và
tồn tại bên trong các thực bào này. Các locus giúp cho Salmonella chống lại sự tấn
công của các thực bào là phoP/Q, pag, prg. Locus spv được mang bởi plasmid ở các
kiểu huyết thanh gây bệnh có vai trò làm tăng tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn sau pha
xâm nhiễm. Gen hilA (hyper invasion locus) hay còn gọi là iagA nằm trên SPI-I, có vai
trò điều hòa sự biểu hiện của operon inv. Sự biểu hiện của gen hilA được hoạt hóa bởi

12


SirA, nhưng người ta chưa biết bằng cách nào các tín hiệu môi trường kích thích sự
biểu hiện hay hoạt động của chúng (trích dẫn Nguyễn Tiến Dũng, 2002).
Khi sử dụng các gen mục tiêu khác nhau để phát hiện Salmonella spp thì độ đặc
hiệu của chúng cũng khác nhau. Trần Thị Xuân Mai và ctv (2011) đã sử dụng phối
hợp hai cặp mồi invA và spvC để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. Kết quả
nghiên cứu cho thấy cặp mồi invA đặc hiệu cho Salmonella spp và cặp mồi spvC đặc
hiệu cho S. enterica bao gồm S. typhimurium và S. enteritidis.
H.V. Murugka và ctv (2003) khi nghiên cứu sự phân phối của các gen độc lực
trong các serovas Salmonella được phân lập từ người và động vật đã báo cáo rằng: gen
stn được phân phối rộng rãi trong các vi khuẩn Salmonella, không phụ thuộc vào phân
loài và nguồn gốc của sự cô lập; tuy nhiên, gen sef chỉ có ở các serovar cụ thể. Báo cáo
của Nguyễn Mạnh Phương và ctv (2012) cho biết hầu hết các chủng Salmonella phân
lập từ phân và cơ quan nội tạng lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy đều mang gen mã hóa
yếu tố xâm nhập invA (96,77%) và tỷ lệ cao các các chủng mang gen quy định độc tố
đường ruột stn (87,1%).
Theo Galan (1991), tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang gen invA
giúp vi khuẩn xâm nhiễm vào tế bào biểu mô ruột và trình tự tương tự gen invA không
tìm thấy ở E. coli. Để nhận diện các dòng vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật PCR
nhiều tác giả như Rahn (1992); Zahraei và ctv (2005); Kumar và ctv (2006) đã thiết kế
các mồi chuyên biệt dựa trên trình tự gen invA (trích dẫn Trần Thị Xuân Mai và ctv,
2011). Hiện nay, khuếch đại gen này đã được công nhận như một tiêu chuẩn quốc tế
phát hiện Salmonella spp (Malorny và ctv., 2003) (trích dẫn Jamshidi và ctv, 2008).

13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ ngày 15/12/2012 đến 15/06/2013 tại Phòng Vi Sinh -

Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều Trị - Chi Cục Thú Y Tp.HCM; Phòng xét
nghiệm chẩn đoán thú y Hàn - Việt, trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
Địa điểm lấy mẫu: các chợ (Phước Bình, Phú Nhuận, Trần Hữu Trang, Bà
Chiểu, Hàng Xanh, Cầu Đỏ, Thị Nghè, Thanh Đa) và siêu thị (Metro, Big C,
Coopmart, Coopfood) tại Tp. HCM.
3.2.

Vật liệu

3.2.1 Đối tượng khảo sát
Mẫu thịt heo, bò, gà lấy tại các chợ và siêu thị: 80 mẫu
Bảng 3.1 Số lượng mẫu thịt heo, bò, gà lấy tại chợ và siêu thị
Chợ

Siêu thị

Tổng

Thịt heo

33

10

43

Thịt bò

9

11

20

Thịt gà

3

14

17

Tổng

45

35

80

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Máy dập mẫu, cân kỹ thuật, nồi hấp tiệt trùng, máy vortex, tủ hút, tủ
ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy ly tâm lạnh Smart R17, máy PCR Applied Biosystems 2720,
bộ nguồn và khay điện di model Mupid – Exu, máy soi UV ETX - F20.M 300nm
Dụng cụ: Dụng cụ lấy và bảo quản mẫu, đèn cồn, que cấy, kéo, pipette các loại,

eppendoff các loại, ống nghiệm, đĩa petri.
3.2.3 Môi trường và hóa chất
Môi trường nuôi cấy và phân lập Salmonella:
-

Peptone Buffer Water (PBW): môi trường tiền tăng sinh.

-

Rappaport Vassiliadis Borth (RVS), Tetrathionate (TT): môi trường tăng sinh
chọn lọc Salmonella.

-

Xylose Lysine Deoxycholate (XLD): môi trường phân lập Salmonella.

-

Brain Heart Infusion Broth (BHI): môi trường phục hồi, tăng sinh Salmonella.
14