Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 52 13

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÂM

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 52.13
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÂM

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 52.13
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: DS Tạ Thu Lan
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học

HÀ NỘI-2013


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời c ảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo DS -Tạ Thu Lan người đã tận tình
hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ , kỹ thuật viên giảng dạy ,
công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trườ ng Đại học Dược
Hà Nội, Bộ môn Hóa vật liệu- khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã
giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợ

i cho

tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thứ c của bản thân có hạn, khóa luận
không thể tránh khỏi nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô ,
bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18, tháng 5, năm 2013.
Sinh viên
Nguyễn Thanh Tâm

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................. 2
1.1.Đại cương về kháng sinh .................................................................................. 2
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ............................................................................ 2
1.1.2.Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh.......................................................... 2
1.1.3.Đánh giá tác dụng: ................................................................................... 3
1.1.4 Phân loại kháng sinh ................................................................................ 3
1.1.5. Cơ chế tác dụng của kháng sinh.............................................................. 4
1.1.6.Các ứng dụng của kháng sinh .................................................................. 5
1.2.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ....................................................... 6
1.2.1.Đặc điểm hình thái: .................................................................................. 6
1.2.2.Đặc điểm sinh lý: ..................................................................................... 7
1.2.3.Đặc điểm cấu tạo: .................................................................................... 7
1.2.4.Khả năng tạo sắc tố: ................................................................................. 7
1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ............................................ 8
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên ............................. 8
1.3.2.Đột biến cải tạo giống .............................................................................. 8
1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn ......................................................................... 9
1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn ......................................................... 9
1.4.1 Sự hình thành KS ở xạ khuẩn .................................................................. 9
1.4.2.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp KS ..................... 10

1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces ............................. 11
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ........................................ 12
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ........................................ 12
1.5.2.Các phương pháp chiết tách ................................................................... 13
1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ..................................................... 14
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến ........................................................................ 144
1.6.2.Phổ hồng ngoại....................................................................................... 14
1.6.3.Khối phổ ................................................................................................. 14
1.7. Một số kết quả nghiên cứu về KS ................................................................. 15
1.7.1.Ảnh hưởng của Panamycin - 607 lên các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp sản
xuất bởi Streptomyces spp. ................................................................................. 155
1.7.2. Các polyene macrolid mới họ hàng với nystatin có vùng polyol cải biến
thông qua công nghệ sinh tổng hợp S. noursei .................................................... 15


1.7.3.Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh
ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces ............................................ 166
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 177
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................... 177
2.1.1Nguyên vật liệu ..................................................................................... 177
2.1.2Máy móc thiết bị ................................................................................... 199
2.2 Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20
2.2.1. Sàng lọc, cải tạo giống .......................................................................... 20
2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.............................................................. 20
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh khiết thu được .... 20
2.3 Phương pháp thực nghiệm ............................................................................. 20
2.3.1Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ............................................................. 20
2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán .............. 21
2.3.3.Phương pháp cải tạo giống ................................................................... 222
2.3.4.Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ..................................................... 244

2.3.5.Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ................... 255
2.3.6. Sơ bộ xác định thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng . 255
2.3.7. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ................................ 266
2.3.8. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ............................................ 266
2.3.9.Kết tinh lại KS...................................................................................... 277
2.3.10. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được................................. 277
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.............................. 278
3.1.Nâng cao khả năng sinh tổng hợp KS của chủng Streptomyces 52.13........ 288
3.1.1.Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................ 288
3.1.2.Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của
Streptomyces 52.13 ............................................................................................ 299
3.1.2.1.Đột biến bằng ánh sáng UV ................................................................ 29
3.1.2.2.Đột biến bằng hóa chất: .................................................................... 311
3.2.Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH chiết KS từ dịch lọc ........................ 322
3.3. Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh ............................................... 333
3.3.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất ...................................................... 333
3.3.2.Chọn biến chủng lên men tốt nhất: ...................................................... 333
3.4.Chiết xuất và bước đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men .............. 344
3.4.1.Kết quả sắc ký lớp mỏng...................................................................... 344
3.4.2.Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột ....................................... 355
3.4.3.Kết quả kết tinh: ..................................................................................... 40
3.4.4.Kết quả đo phổ xác định cấu trúc của KS tinh khiết.............................. 40


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi

phi

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................ 411
1.Kết luận: .......................................................................................................... 411
2.Kiến nghị ......................................................................................................... 422
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

B.subtilis

Bacillus subtilis ATCC 6633

CLNN

Chọn lọc ngẫu nhiên

CW

Thành tế bào- Cell wall

DM

Dung môi

DMHC

Dung môi hữu cơ

ĐB

Đột biến

Gr

Gram

IR

Hồng ngoại- Infrared

KS

Kháng sinh

L-DAP

L- diaminopimelat

MTdt

Môi trường dịch thể

P.mirabilis

Proteus mirabilis BV 108

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

TB

Tế bào

TĐC

Trao đổi chất

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

UV

Tử ngoại ultra violet

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các VSV kiểm định
Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 52.13
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến bằng UV lần 1
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến bằng UV lần 2
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học
Bảng 3.5: Kết quả chọn dung môi và pH chiết
Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men chìm
Bảng 3.7: Kết quả chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất
Bảng 3.8: Kết quả chạy sắc kí lớp mỏng
Bảng 3.9: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy sắc kí cột lần 1
Bảng 3.10: Kết quả sắc kí lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc kí cột lần 1
Bảng 3.11: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng 3.12: Kết quả sắc kí các phân đoạn sau chạy sắc kí cột lần 2


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ KS chính

Hình 1.2: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
Hình 1.3: Đường cong biểu diễn sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát hiện ra tác dụng của kháng sinh lần đầu tiên của nhà bác sĩ người
Anh Alexander Flaming vào tháng 10 năm 1928 là một thành tựu vĩ đại của y học.
Sự xuất hiện của kháng sinh đã giúp con người chống lại sự tấn công của các loài
vi khuẩn nguy hiểm và làm giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh. Song, do bản năng
sinh tồn, vi khuẩn luôn tìm mọi cách biến đổi để trở nên kháng thuốc. Một ví dụ
điển hình có thể kể đến là việc vi khuẩn có thể tạo ra β- lactamase một loại enzym
do vi khuẩn tiết ra có thể phá hủy cấu trúc của penicillin và vô hiệu hóa tác dụng
kháng khuẩn của các kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam. Tốc độ biến đổi như
vũ bão hiện nay của vi khuẩn có thể tạo ra hàng loạt các loại siêu vi khuẩn đa
kháng thuốc khiến cho thế giới lâm vào tình trạng không có phương pháp cứu chữa
cho nhiều loại bệnh.Chính vì vậy việc tìm ra, phát triển các loại kháng sinh mới có
hoạt tính kháng khuẩn và hiệu quả điều trị cao đang là một vấn đề hết sức bức thiết
của ngành công nghiệp kháng sinh hiện nay.
Như chúng ta đã biết trong số các kháng sinh được biết đến hiện nay một tỉ
lệ lớn đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Bên cạnh đó theo các kết quả điều tra 65%
kháng sinh nguồn gốc xạ khuẩn là do chi Streptomyces sản xuất ra. Đó là cơ sở để

các nhà khoa học nước ta hiện nay tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn này.
Tại bộ môn Vi sinh – sinh học trường đại học Dược Hà Nội chúng tôi đã
chọn đề tài : “Góp phần vào nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ
Streptomyces 52.13”. Nội dung của khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu
sau đây:
- Nghiên cứu các biện pháp cải tạo giống Streptomyces 52.13 nhằm làm tăng khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh.
- Nghiên cứu điều kiện lên men, nuôi cấy và chiết xuất thích hợp.
- Tìm điều kiện tinh chế KS thích hợp, bước đầu nghiên cứu cấu trúc của KS


2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh
Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của
Penicillin notatum mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Năm 1938,
Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị. [6]
Năm 1942, Waksman đưa ra định nghĩa: “Kháng sinh hay một chất có tính
kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát
triển hoặc thậm chí tiêu diệt các vi khuẩn khác”. Năm 1950, Baron bổ sung giới
hạn định nghĩa như sau: “Kháng sinh là những chất được tạo ra bởi cơ thể sống, có
khả năng ức chế sự phát triển hay sự tồn tai của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở
nồng độ thấp”. [8]
Nghiên cứu, sản xuất, sử dụng kháng sinh đã phát triển mạnh do tác dụng
hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng khuẩn khác.
Hiện nay, giới khoa học quan niệm rằng: “Kháng sinh là những sản phẩm
đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh
học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi

sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở
nồng độ thấp”.[15]
Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi
là kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật
khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao.
1.1.2.Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh
Những yêu cầu của y học đối với 1 kháng sinh là:
-

Kháng sinh phải không độc hoặc rất ít độc với cơ thể.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
3

Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây

bệnh.
-

Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài.

-

Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ
thể. [11]

1.1.3.Đánh giá tác dụng:
Theo đơn vị tác dụng (IU) :thường dùng cho cá sản phẩm thiên
nhiên và không tinh khiết.
-

Theo khối lượng chất chuẩn (g,mg..): thường dùng cho các chế
phẩm bán tổng hợp và tinh khiết. [8]

1.1.4 Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm
của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân
loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên
cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện
khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về
các đặc điểm khác.[8]
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất
sau đây:
- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactamase
+ Penicillin: oxacillin, ampicillin..
+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim…
+ Các β-lactamase khác: carbapenem, chất ức chế β-lactamase
- Các kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol..)
- Các kháng sinh có cấu trúc aminosid (streptomycin, gentamicin…)
- Các KS nhóm lincosamid (lincomycin, clindamycin…)


4

- Các KS nhóm quinolon (acid nalidixic…)
- Các KS nhóm Co – trimoxazol (co-trimoxazol..)
- Các kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline…)
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…)
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…)
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)
- Các kháng sinh khác (rifapicin…) [8], [18]
1.1.5. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác
hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi
nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Các kiểu chủ yếu:
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào : ức chế tổng hợp vách tế bào vi
khuẩn làm VK bị tiêu diệt. Một số KS như vancomcin, β- lactamase… tác
dụng theo cơ chế này.
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất: KS làm thay đổi tính thấm của màng
dẫn đến làm rối loạn quá trình trao đổi chất giữa tế bào VK với môi trường
làm VK bị tiêu diệt.
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN: ức chế sự tổng hợp ADN từ quá trình sao
chép và phiên mã. VD: actinomycin, rifampicin..
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein:
+ Gắn vào tiểu đơn vị 30S hoặc 50S, làm gián đoạn quá trình tổng
hợp protein có khả năng kìm hãm vi khuẩn. VD: Cloramphenicol,
tetracycline macrolid và lincosamid…
+ Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm sai lệch quá trình tổng
hợp protein có khả năng tiêu diệt VK. VD: các aminosid, spectinomycin…


Ket-noi.com

Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
5

- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian: ức chế tổng hợp acid folic. VD:
Co-trimoxazol.
- Tác dụng lên hệ hô hấp [18]
Hình sau đây giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh
chính.[18]

Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính
1.1.6.Các ứng dụng của kháng sinh
- Trong y học: Kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn,
nhiễm nấm và một số bệnh ung thư.
- Trong chăn nuôi: Điều trị các bệnh nhiễm trùng ở động vật như dùng
griseofulvin để điều trị viêm phổi cấp, viêm vú của trâu bò ; dùng cloramphenicol
để điều trị các bệnh do Brucella gây ra.


6

- Trong nông nghiệp: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus
gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây
bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả.
- Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực
phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh subtilin (do

Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra).[4], [7]

1.2.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
1.2.1.Đặc điểm hình thái:
Streptmyces là 1 chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi trong
tự nhiên. Nơi sống của các loài thuộc chi Streptomyces rất đa dạng (đất, thủy
vực…). Chúng thuộc VK thật phát triển dạng sợi phân nhánh là các VK Gr(+), có
tỉ lệ G+C>55% .[17]
Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khí sinh.
+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong
suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số
loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng,
móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh
sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da
cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha).Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô
tính.[7], [17]
Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. [17]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
7

`Hình 1.2: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
1.2.2.Đặc điểm sinh lý:
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời
thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 2530°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5. [4], [7]
1.2.3.Đặc điểm cấu tạo:
Cấu tạo của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất,
tế bào chất.
- Thành tế bào: dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20nm. Thành tế bào
thuộc nhóm CW I, có chứa L – DAP và glycin.
- Màng tế bào chất: dày 7,5 – 10 nm, không chứa cellulose và kitin.
- Meosome: nằm phía trong tế bào chất hình phiến,bọng hay hình ống.[16]
1.2.4.Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố
của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7]


8

1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có hoạt tính KS tăng 20 - 30 % so với những cá thể khác. Cần phải
chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [11]
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng
có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo.

1.3.2.Đột biến cải tạo giống
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm: hóa học
(ethylamine, acid nitrơ…), vật lí (UV, tia X…) và sinh học. Trong đó, các tác nhân
vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các
VSV. Những cá thể còn sống sót sẽ có sự ĐB gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn
đến hoặc làm mất khả năng tạo KS (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng
hợp kháng sinh lên mạnh (ĐB dương). [4]
- Đột biến bằng UV:
Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với các tế bào VSV có
kích thước nhỏ thì tia UV có thể xuyên thấu tới vùng nhân. Tia UV có thể làm cho
các base pyrimidin trên cùng 1 mạch của ADN hình thành các cấu trúc dimer T-T,
C-C, T-C. Các dimer ảnh hưởng tới sự ghép đôi bổ sung trong sao chép để lại 1 vết
khuyết trên mạch bổ sung gây ra ĐB gen.[14]
- Đột biến bằng HNO2:
Axit nitrơ là chất gây ĐB mạnh. Nó có tính oxy hóa mạnh làm loại nhóm
amin (NH2) ra khỏi A, G và C. Phản ứng này làm thay đổi amino thành keto và
làm thay đổi liên kết hydro của các base này. A sau loại amin có xu hướng liên kết


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
9

với C; C sau khi chuyển thành U có xu hướng liên kết với A; G chuyển thành
xanthin nhưng xanthin vẫn liên kết với C nên trường hợp này không gây ĐB.[16]

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến
hành đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử.
1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền
không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền
sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt
độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được
đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng
thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng
thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.[13]

1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn
1.4.1 Sự hình thành KS ở xạ khuẩn
Các nhà nghiên cứu hình thành lên nhiều quan điểm khác nhau về sự sinh
tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. Một số cho rằng sự hình thành KS là do sự cạnh
tranh trong môi trường dinh dưỡng. Một số khác lại cho rằng việc hình thành KS
giúp cho sự tồn tại của VK trong điều kiện sống khắc nghiệt. Tuy nhiên hầu hết
đều đồng ý công nhận KS là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, được hình thành vào
cuối pha sinh trưởng đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng.
Mặc dù KS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng
nhưng quá trình tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định:


10

- KS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzyme.

- KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa khác nhau.
- KS được hình thành bằng con đường polymer hóa các chất chuyển hóa sơ
cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.
Hình dưới giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải
qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy
tàn.[11].

Hình 1.3: Đường cong biểu diễn sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn
Một số chủng xạ khuẩn có thể tổng hợp được nhiều loại kháng sinh có cấu
trúc và tác dụng tương tự nhau. Việc tổng hợp này do các cơ chế điều khiển đa
gen, ngoài gen và các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme,
cofactor qui định.[13], [15]
1.4.2.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp KS
a) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và chủng giống sử dụng[11], [24]
- Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp KS là 22 – 28ºC
- pH môi trường: thường pH thích hợp nhất là pH trung tính.
- Độ thông khí: xạ khuẩn là loài hiếu khí, cần đảm bảo thong khí tốt đặc biệt là ở
giai đoạn nhân giống tức 6 – 12 giờ đầu của quá trình nuôi cấy. Nồng độ O2 thích
hợp cho sinh tổng hợp KS là 2 – 8 ml O2 / 100ml.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
11

- Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh tổng
hợp cao nhất là 36 – 72 giờ tuổi. Lượng giống 2 – 10 %
b) Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men:[11] , [24]
- Nguồn Carbon: có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành KS. Nguồn
carbon thường được sử dụng nhất là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau
mà sử dụng các loại khác nhau. Có thể là: glucose, fructose…hoặc 1 số các loại
acid hữu cơ hay chất béo khác.
- Nguồn nitơ: gồm nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ có thể là các hợp chất
từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Nguồn vô cơ thường là muối amoni.
- Nguồn phosphate vô cơ : đóng vai trò là tác nhân điều hòa sự tổng hợp KS. Nồng
độ thích hợp: 10mg/ml.
- Các yếu tố vi lượng: Nếu môi trường lên men có nguồn gốc dinh dưỡng tự nhiên
thì hầu hết các yếu tố vi lượng đều đã có sẵn không cần bổ sung thêm. Việc bổ
sung thêm các hợp chất giàu yếu tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng
kể khả năng sinh tổng hợp của KS của nhiều loại xạ khuẩn.
1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
a.Định nghĩa: Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do hoạt
động sống của VSV nhờ xúc tác của enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và
các hợp chất trung gian cần cho chúng.[5] , [12]
b.Các phương pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không
khí để hô hấp trên bề mặt MT.
+ Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.
+ Nhược điểm: diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất,
hiệu suất sử dụng thấp.
- Phương pháp lên men chìm: VSV nuôi trong MT lỏng, phát triển 3 chiều.


12

+ Ưu điểm:
Hiệu suất sử dụng không gian cao, lượng hoạt chất tổng hợp trong 1 thể tích
môi trường cao, hiệu suất lên men cao.
Môi trường nuôi cấy là 1 thể thống nhất, vì vậy có thể kiểm soát quy trình
lên men 1 cách dễ dàng. Thiết bị tự động hóa tiết kiệm được mặt bằng và nhân lực.
+ Nhược điểm
Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn
Cần thiết bị chịu áp lực.
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên
men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm.
Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.
+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường
dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả
sử dụng bình lên men.
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng
thời bổ sung đồng lượng MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT
dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau
những khoảng thời gian nhất định.[11], [13]

1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Giai đoạn này có vai trò rất quan trọng bởi sản phẩm thu được sau khi lên
men thường không bền vững, hàm lượng KS trong dịch lên men thường thấp. Do
đó, cần tách riêng KS khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt các tiêu

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
13

chuẩn cần thiết. Công đoạn tinh chế góp phần quyết định giá thành của sản
phẩm.[12]
1.5.2.Các phương pháp chiết tách
a.Chiết xuất
Chiết xuất là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác ( thường
dùng DMHC hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất hỗn hợp cần
nghiên cứu.[3]
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha không hòa lẫn vào
nhau.
b.Tách và tinh chế sản phẩm
Tách sản phẩm là sự kết hợp của nhiều phương pháp hóa học, vật lí, hóa lý
nhằm đi từ 1 hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp giản đơn và từ hỗn hợp giản
đơn tách riêng từng chất. Tinh chế là quá trình tạo sản phẩm tinh khiết dùng cho
nghiên cứu tiếp theo. [19]
Phương pháp thường được sử dụng hiện nay để tách và tinh chế sản phẩm là
sắc ký.
Các phương pháp sắc ký hay dùng:[1], [9]
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên
khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn
(chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá
đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.

+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự
phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo
thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ
hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
Ngoài ra để tinh chế còn hay dùng phương pháp kết tinh: phương pháp này
dựa trên sự hòa tan có giới hạn của một chất trong dung dịch [10]. Từ đó có thể áp


14

dụng hòa tan chất (chất này có thể chưa tinh khiết) vào 1 DM sau đó thêm 1 dung
môi thứ 2 vào. Do độ tan trong dung môi thứ 2 khác nên các tinh thể của chất sẽ
kết tinh và ta có thể tách chúng ra 1 cách dễ dàng. Độ tinh khiết của chất đó đã
tăng.

1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích.
Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có
mối quan hệ chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự
hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân
tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ
năng lượng ánh sáng UV-VIS. [2] , [9]
1.6.2.Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử.
Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước
sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[1], [9]
1.6.3.Khối phổ

Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng
chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) bắn phân phá phân tử hữu cơ
ở chân không cao (10-6mmHg). Trong quá trình đó các chất hữu cơ bị ion hóa và bị
phá vỡ thành các mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện
bằng một số vạch pic có cường độ khác nhau tập hợp thành khối phổ đồ.[1], [20]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
15

1.7. Một số kết quả nghiên cứu về KS
1.7.1.Ảnh hưởng của Panamycin - 607 lên các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp
sản xuất bởi Streptomyces spp.
Sự ảnh hưởng của Panamycin – 607 lên sự phát triển của khuẩn ty khí sinh
và các chất kháng sinh được sản xuất bởi Streptomyces đã được chứng minh. Tiếp
xúc với 6,6 µg Panamycin – 607 kích thích làm tăng 2,7 lần puromycin được sản
xuất bởi Streptomyces alboniger NBRC 1278, trong đó trước tiên là nó làm tăng
khuẩn ty khí sinh. Panamycin – 607 cũng kích thích làm tăng sản xuất sản phẩm
tương ứng streptomycin của S.griseus NRBC 12875 và cirenubin A và B của
S.tauricus JCM 4837 lần lượt là 1,5; 1,7 và 1,9 lần. Kháng sinh được sản xuất bởi
Streptomyces sp. 91-a được xác định là virginiamycin M1, và khả năng tổng hợp
của nó đã tăng lên 2,6 lần bởi panamycin -607. Kết quả này đã chứng minh rằng
không chỉ khôi phục hay kích thích sự phát triển của khuẩn ty khí sinh mà còn làm

tăng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp.[21]
1.7.2. Các polyene macrolid mới họ hàng với nystatin có vùng polyol cải biến
thông qua công nghệ sinh tổng hợp S. noursei
Nystatin là một kháng sinh nhóm polyene macrolid có phổ kháng nấm rộng,
hiệu quả cao và ít có xu hướng kháng thuốc. Tuy nhiên, KS này có độc tính tương
đối cao, đặc biệt là đối với các tế bào thận. Nystatin được sản xuất bởi S.noursei.
Cấu trúc của nystatin tương tự amphotericin B. Amphotericin B có 7 liên kết đôi
trong phần polymer trong khi nystatin có 4 liên kết đôi. Sự khác biệt này dẫn đến
khả năng kháng nấm của nystatin cao hơn amphotericin do sự tương tác kị nước
với màng sterol hiệu quả hơn. Tiến hành đột biến gen GG5073SP của S. noursei,
sản xuất heptaneic nystatin đồng đẳng S44HP đã cải thiện đáng kể khả năng kháng
nấm nhưng lại tăng độc tính so với nystatin. Bất hoạt gen nysN P450
monooxygenase của biến chủng GG5073SP mang lại biến chủng S.noursei đột
biến có khả năng sản xuất nystatin đồng đẳng BSG005 (16 decarboxy – 16 –


16

methyl – 28, 29 – didehydronystatin).Hoạt chất này có khả năng kháng nấm cao
hơn của S44HP và giảm độc tính hơn.[23]
1.7.3.Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh
ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces
Một con đường sinh tổng hợp sử dụng acid pivalic như là đơn vị khởi đầu
đã được phát hiện ở ba loài vi khuẩn Alicyclobacillus acidoterrestris, Rhodococcus
erythropolis và Streptomyces avermitilis. Khi thêm acid pivalic được đánh dấu
bằng đồng vị Deuteri vào môi trường dinh dưỡng của A. acidoterrestris và R.
erythropolis, nó sẽ kết hợp với các acid béo để tạo thành acid béo có thêm nhánh
tert- butyl (t- FAs). Thêm vào đó, trong R. erythropolis, acid pivalic chuyển hóa
thành hai đơn vị khởi đầu là acid isobutyric và acid 2- methylbutyric, tương ứng là
tiền chất của iso-FAs và anteiso- FAs. Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở loài S.

avermitilis khi có thêm acid pivalic mang lại ba nhánh FAs. Ngoài con đường này,
cả acid pivalic và acid 2- methylbutyric cũng được kết hợp trong sinh tổng hợp
kháng sinh avermectin. [22]