Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155 29

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HỮU NGHỊ

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 155.29
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HỮU NGHỊ

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 155.29
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn: TS. Bùi Quang Phúc

ThS. Lê Thị Thu Hương
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội
Viện sốt rét -KST-CT TW

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hương và Tiến sĩ
Bùi Quang Phúc đã tận t ình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi
hoàn thiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ, kỹ thuật viên giảng
dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại
học Dược Hà Nội, Viện sốt rét KST-CT TW đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực
nghiệm.
Cũng nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn
thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà N ội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn , khóa
luận này còn có nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô ,
bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15, tháng 5, năm 2013
Sinh viên

Lê Hữu Nghị

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Đại cương về kháng sinh ................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh .............................................................. 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh ................................................................. 2
1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh .............................. 3
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ............................................... 4
1.1.5. Khái niệm về tính kháng kháng sinh ....................................... 5
1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh .................................................. 5
1.2. Đại cương về xạ khuẩn ..................................................................... 6
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................ 6
1.2.2. Phân loại xạ khuẩn .................................................................... 6
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces ................................. 7
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .......................... 8
1.3.1. Mục đích ..................................................................................... 8
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên .. 8
1.3.3. Đột biến cải tạo giống ................................................................ 8
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn ......................................................... 9

1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .................................................. 9
1.4.1. Khái niệm lên men ...................................................................... 9
1.4.2. Các phương pháp lên men ...................................................... 10


1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men................... 11
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...................... 11
1.5.1. Mục đích ................................................................................... 11
1.5.2. Các phương pháp chiết tách ................................................... 12
1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ................................. 13
1.6.1. Phổ hồng ngoại .......................................................................... 13
1.6.2. Phổ tử ngoại ............................................................................... 13
1.6.2. Phổ khối...................................................................................... 13
1.7. Một số nghiên cứu liên quan .......................................................... 14
1.7.1. Quy định phân tử của sinh tổng hợp kháng sinh trong
Streptomyces ........................................................................................... 14
1.7.2. Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp. với những đặc
điểm thúc đẩy tăng trưởng và quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp
.................................................................................................................14
1.7.3. Nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius
D1.5 ....... ................................................................................................. 15
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................... 16
2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................... 16
2.1.2. Máy móc thiết bị ......................................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................... 19
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống ............................................................... 19
2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ................................. 19
2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được .... 20

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

2.3. Phương pháp thực nghiệm ............................................................... 20
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ................................................ 20
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
................................................................................................................. 20
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên .................................................................. 21
2.3.4. Đột biến ...................................................................................... 22
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh........................................ 23
2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men ............ 24
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ .... 24
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp
mỏng ....................................................................................................25
2.3.9.

Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ................ 26

2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột .............................. 26
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được ................... 26
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT ................ 27
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ............................................................ 27
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ................................................ 27
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ................................................ 28

3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống bằng phương pháp hóa học.......... 29
3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh .................................... 30
3.5.1. Kết quả chọn môi trường lên men chìm ................................... 30
3.5.2. Kết quả chọn chủng lên men ..................................................... 31
3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của
kháng sinh trong dịch lọc ......................................................................... 32


3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết ................................................ 33
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi ................................... 34
3.9. Kết quả sắc ký cột ............................................................................. 34
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ
các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được .............................. 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

CW

Thành tế bào- Cell wall

DMHC

Dung môi hữu cơ

ĐB1

Đột biến 1

ĐB2

Đột biến 2

Gr

Gram

IR

Hồng ngoại- Infrared

ISP

Chương trình Streptomyces quốc tế- International Streptomyces

Project
KS

Kháng sinh

MS

Phổ khối- Mass Spectrometry

MT

Môi trường

MT2dt

Môi trường dịch thể 2

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

TB

Tế bào

TĐC

Trao đổi chất

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

UV

Tử ngoại- Ultraviolet


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học.
Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định.
Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn.
Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định.
Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng.
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên.
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1.
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học.
Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men (trên P.mirabilis).
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men chìm.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis).
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis).
Bảng 3.9: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P.mirabilis ).
Bảng 3.10: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký.
Bảng 3.11: Kết quả chạy sắc kí cột lần 1 (trên P.mirabilis ).
Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc kí cột lần 2 (trên P.mirabilis ).
Bảng 3.13: Phổ IR.

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp sản xuất kháng sinh.
Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn.
Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn.
Hình 4: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.
Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.
Hình P3: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Hình P4: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV.
Hình P5: Tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột.
Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh.
Hình P7: Phổ hồng ngoại của kháng sinh.
Hình P8: Phổ khối (MS).


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lượng thuốc kháng sinh mà các quốc gia trên thế giới sử dụng trong thời gian qua đã

tăng mạnh. Dù Bộ Y tế của nhiều quốc gia đã ban hành những quy định cụ thể nhằm hạn
chế việc lạm dụng thuốc kháng sinh nhưng thị trường thuốc kháng sinh của thế giới vẫn
liên tục phát triển. Thị trường thuốc kháng sinh của Việt Nam không nằm ngoài quy luật
này.
Nhu cầu sử dụng cao dẫn đến việc sử dụng kháng sinh tràn lan, khó kiểm soát đã dẫn
đến tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh, thuốc kháng sinh mất dần tác
dụng đang ngày trở nên nghiêm trọng, trong khi lại có quá ít các loại thuốc thay thế. Vì
vậy việc nghiên cứu tìm ra kháng sinh mới, các kháng sinh có hoạt tính cao, độc tính
thấp, ít bị kháng khuốc là vấn đề được các nhà khoa học trên thế giới và trong nước quan
tâm.
Hiện nay xu hướng trên thế giới là tìm kiếm kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh
vật, như tìm kiếm kháng sinh mới dưới lòng đại dương của các nhà khoa học Scotland,
hay từ các loài nấm rừng của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan,…hay là từ chi xạ khuẩn
Streptomyces loài vi sinh vật thường sống ở đất, chúng cũng sản xuất hơn một nửa số
thuốc kháng sinh của thế giới và đó là những sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế
(như : thuốc kháng sinh, thuốc chống nấm, thuốc chống ung thư, thuốc ức chế miễn
dịch,…) . Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng
hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.29” làm khóa luận tốt nghiệp. Khóa luận mong
muốn đạt được các mục tiêu sau đây:
-

Nghiên cứu các biện pháp nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh thu được.

-

Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích.

-

Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được.

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Đại cương về kháng sinh

1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [18], [21], [22]
Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh.
Theo nghĩa hẹp: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác
dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh v ật xác định
(vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus…) hay cả tế bào ung thư, ở nồng độ thấp.
Theo nghĩa rộng: Kháng sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng hóa học có
tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon (pefloxacin, norfloxacin…).
Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là
kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác
không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao.
1.1.2. Phân loại kháng sinh [2], [3], [4], [8]
Có nhiều cách khác nhau để phân loại các kháng sinh : Phân loại theo nguồn gốc
(kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên , kháng sinh bán tổng hợp ), theo phổ tác dụng (phổ
rộng hay chọn lọc), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách t ế bào, tác dụng lên quá

trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nhân, thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế
tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học…
Song cách phân loại KS theo cấu trúc hóa học là khoa h ọc nhất vì nó giúp cho các
nhà nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm

của chất kháng sinh mới

phát hiện khi biết được công thức hóa học của nó.
Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1).


3

Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học
Phân loại

Nhóm kháng sinh

Kháng sinh cụ thể

Aminoglycosid

Streptomycin, neomycin

1. KS có chứa đường trong Orthosomycin

Everninomycin

phân tử

N-glycosid

Streptothrinin

C-glycosid

Vancomycin

Glycolipid

Moenomycin

KS macrolid

Erythromycin

2. KS chứa vòng lacton lớn KS polyen

Candicidin, nystatin

(macrocyclic lacton)

Asamycin

Rifamycin

Macrotetrolid

Tetralactin

Anthracyclin

Adriamycin

3. Quinon và các KS cùng

Naphthoquinon

Actinortidin

họ

Benzoquinon

Mitomycin

Các tetracyclin

Tetracyclin, terramycin

Dẫn xuất aminoacid

Cycloserin

KS β-lactam

Penicilin, cephalosporin

4. Các KS amino acid và

KS peptid

Bacitracin, polymycin

peptid

Chromopeptid

Actinomycin

Depsipeptid

Valinomycin

5. KS dị vòng chứa N

Các KS nucleotid

Polyoxin

6. KS dị vòng chứa O

Các KS polyether

Mononsin

7. Các KS nhân thơm

Dẫn xuất benzen

Chloramphenicol

Các ether thơm

Novobiocin

1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh [3], [8], [21]
Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được
thể hiện trong hình 1 dưới đây.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
4

Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm
Nhân giống trong phòng thí nghiệm
Nhân giống trên thiết bị nhân giống
Lên men tạo kháng sinh
Dịch lên men
Lọc, ly tâm
Sinh khối
Dịch lọc

Chiết bằng dung môi hữu cơ

Dùng cột trao đổi ion…

Dịch chiết sinh khối

Dịch chiết
Cô, tinh chế
Sản phẩm tinh chế
Kiểm nghiệm
Sản phẩm đã được kiểm nghiệm
Đóng gói
Sản phẩm đóng gói
Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp sản xuất kháng sinh
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16], [22]
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác
nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân


5

tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác
dụng lên các đích khác nhau. Có 6 kiểu chủ yếu:
• Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
• Tác dụng lên màng nguyên sinh chất
• Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
• Tác dụng lên sự tổng hợp protein
• Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
• Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian
1.1.5. Khái niệm về tính kháng kháng sinh [22]
Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong
một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu.

Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng
thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh
nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do
các enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con
đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng.
1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh [8], [21]
• Trong lĩnh vực y học : Kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn , nấm
gây ra. Ngày nay, một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị bệnh ung
thư.
• Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác nhau:
-

Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật:
Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh
còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm
chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt.

-

Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus
gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani
gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien

mien phi
phi
6

-

Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực
phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh
subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra).

1.2.

Đại cương về xạ khuẩn [4], [5], [9], [22]
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng

rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất
nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật
hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều
sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm
nghiên cứu rất nhiều.
Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là
do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase,
celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [22]
Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát
triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn
ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá
đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà
thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có
các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. (Hình 2)

Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong

Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn

khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc
khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám…
1.2.2. Phân loại xạ khuẩn [6], [22]
Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đ ã được các nhà KH nghiên cứu phát triển để
phân loại xạ khuẩn

, phải kể đến khóa phân loại của Waksman

, khóa phân loại

Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze…Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn
(Actinomycetes) thành bộ

Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn

. Bộ


7

Actinomycetales được chia thành các họ

: Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,

Streptomycetaceae, Mocromonosporaceae, Nocardiaceae…
Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3.

Actinomycetes
Actinomycetales
Actinoplanaceae

Streptomycetaceae

Streptoverticulum

Streptomyces

VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetaceae

Themostreptomyces

…

…

Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (ISP) do
Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại nà y, các đặc
trưng phân loại được sử dụng bao gồm : màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất , sắc tố
melanoid, sắc tố hòa tan , hình dạng chuỗi bào tử , bề mặt bào tử , khả năng tiêu thụ các
nguồn carbon.
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces [5], [7], [22]
Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu
trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì

có tới 55% là từ Streptomyces.
Đặc điểm hình thái: Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí
sinh:
Khuẩn ty cơ chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt
quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố,
có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
8

Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một
thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ.
Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu,
xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của
xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp)
hoặc có tóc (ha).
Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát
triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng,
đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C,
pH tối thích thường là 6,8-7,5.
Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố
hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.

1.3.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1. Mục đích [8], [13]
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô
thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu
được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các
phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên [13], [21]
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác. Cần
phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu
ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả
năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.
1.3.3. Đột biến cải tạo giống [8], [10]
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:


9

Tác nhân hóa học: 5-bromouracil, ethylenimin, 2-aminopurin, dimethylsulfat,
hydroxylamin…
Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β. Tác nhân vật lý hay được
dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách
chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh học các Tn, bacteriophage Mu,…
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết
hầu hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi

các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm
tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương).
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột
biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính,
kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn [8], [12], [15]
Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa,
nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ thể là: giữ
giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp
nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
bảo quản lạnh - cấy chuyền (bảo quản lạnh trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy
chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở
nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông
lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).
Để giữ giống xạ khuẩn trong phňng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ
khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và
định kỳ 2-3 tháng cấy lại 1 lần.
1.4.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1. Khái niệm lên men [8], [22]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu

lieu mien
mien phi
phi
10

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi
sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp
chất trung gian cho chúng.
Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ thể
hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá
trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng.
Hình 4 : Giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4
giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn.

Hình 4: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
1.4.2. Các phương pháp lên men [3], [8]
Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể
lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp
trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi
thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi
trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt
trong chọn giống và giữ giống.
Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều
nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu
tư trang thiết bị ban đầu lớn.


11

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

- Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên
men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản
phẩm. Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.
- Lên men có bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi
trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao
hiệu quả sử dụng bình lên men.
- Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng
thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT
dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau
những khoảng thời gian nhất định.
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [12]
pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của
các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng
gián tiếp.
Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong
tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của
VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiếm
phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không
giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí
mạnh là tốt.
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá
trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho
sinh tổng hợp chất mong muốn.
1.5.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.5.1. Mục đích [8]

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
12

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình
lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp.
Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được
các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn tinh chế sẽ góp phần
quyết định tới giá thành của sản phẩm.
1.5.2. Các phương pháp chiết tách [1], [2], [11], [17], [21]
Một số phương pháp chiết tách thường dùng:
-

Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.

-

Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên cột…).

-

Phương pháp tạo phức kết tủa.

-

Phương pháp chưng cất.

Chiết xuất: Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp.
Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: Một pha lỏng và
một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thường
một pha là nước).
Phương pháp sắc ký:
Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một hỗn
hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một
pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh
được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di
chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và
chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt
thành dải trên sắc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng.
Cơ chế của sự phân tách là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử
hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh
và dung môi làm pha động.
Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp KS:


13

Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng.
Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ lệ. Pha
động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.
Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha
tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm
liên tục lượng mới của pha động.

1.6.

Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh [17], [19], [20]

1.6.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi
qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi
trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan giữa
nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết
một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở
của việc phân tích cấu trúc bằng IR.
1.6.2. Phổ tử ngoại
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số
song là phổ tử ngoại.
Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân
tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E0 chuyển sang trạng thái kích thích E1, E2. Các
electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn, liên kết bội,
hệ thống thơm…, hay cặp electron tự do không tham gia liên kết của O, N, các halogen.
1.6.3. Phổ khối
Phổ khối là tập hợp các tín hiệu tương ứng với các ion- được thể hiện dưới dạng
các pic có cường độ khác nhau. Các tín hiệu này thu được khi các ion được tạo thành
trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối của máy khối phổ.
Phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng các ion, phân tử, xác định công thức
cấu tạo của chất nghiên cứu hoặc dùng trong phân tích định lượng.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai

tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
14

1.7.

Một số nghiên cứu liên quan

1.7.1. Điều hòa phân tử sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces [24]
Streptomyces là nguồn phổ biến nhất của thuốc kháng sinh. Thông thường mỗi
loài sản xuất một số thuốc kháng sinh với đặc điểm đặc trưng cho từng loài.
Streptomyces coelicolor là một điển hình, tạo ra ít nhất năm loại thuốc kháng sinh khác
nhau. Chúng tôi xem xét các cơ chế điều hòa về sinh tổng hợp kháng sinh trong S.
coelicolor và các Streptomyces không mô hình trong hướng các nghiên cứu gần đây.
Sinh tổng hợp của mỗi kháng sinh được xác định bởi một nhóm gen lớn, thường bao gồm
cả gen điều tiết [CSR s]. Đây là những điểm chính để kết nối với rất nhiều hệ thống quản
lý bảo tồn nói chung như theo dõi chức năng sinh lý của sinh vật, tổ chức sinh vật, mật
độ sinh vật và môi trường để khởi phát và mức sản xuất của mỗi thuốc kháng sinh. Một
số CSR cũng có thể nhạy cảm với các mức độ ở các loài khác nhau của các phối tử, bao
gồm cả các sản phẩm của quá trình riêng của mình, cũng như là các sản phẩm của con
đường kháng sinh khác trong cơ thể, và đặc biệt là các phân tử nhỏ như gammabutyrolactones . Những tương tác này có thể dẫn đến sự tăng cường các chất chuyển tiếp
và các mạch liên hệ phức tạp giữa các con đường. Các tín hiệu sinh lý và cơ chế điều tiết
có tầm quan trọng cho sự hoạt hóa của nhiều nhóm chuyển hóa thứ cấp trong sự phát
hiện của nhiều trình tự gen Streptomyces gần đây.
1.7.2. Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp. với những đặc điểm thúc đẩy
tăng trưởng và quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp [25]
Một chủng vi khuẩn Streptomyces sp. CIMAP-A1 được phân lập từ rễ Phong lữ và
xác định bởi hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa và phân tử (16S trình tự gen rDNA). Nó

đã được tìm thấy có liên quan chặt chẽ nhất với S. vinacendrappus, chủng NRRL-2363
với 99% trình tự giống nhau. Chủng đã có hoạt động tiềm năng đối kháng (in vitro)
chống lại nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng như Stemphylium sp., Botrytis cinerea,
Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum spp., Curvularia spp., Corynespora cassicola
và Thielavia basicola. Các chất chuyển hóa trung gian ngoại bào được tạo ra bởi chủng
trong dịch lọc nuôi cấy ức chế mạnh sự nảy mầm bào tử, phát triển của ống mầm của các
bào tử nảy mầm và phát triển xuyên tâm của Alternaria alternata, Colletotrichum


15

acutatum, Curvularia andropogonis và Fusarium moniliforme. Việc khai thác nuôi cấy
trong dịch lọc bằng các dung môi và lọc bằng VLC và PTLC phương pháp luôn luôn
mang lại 10 hợp chất chống nấm có thể chống lại nhiều loại nấm gây bệnh cho thực vật.
Các chủng có thể sản xuất siderophores và axit indole-3-acetic. Chủng đã được tìm thấy
để tăng cường sự tăng trưởng và sản xuất của Phong lữ. Nó tăng 11,3% sinh khối chồi
của Phong lữ và sản lượng dầu cần thiết 21,7%.
1.7.3. Nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius D1.5 [23]
S. hygroscopius D1.5 đã được phân lập và nghiên cứu thấy nó có khả năng kháng
cả nấm cả vi khuẩn. Chủng này có thể sử dụng nguồn nitơ là arginine và nguồn cacbon là
glycerin với nồng độ tối ưu lần lượt là 0,75 g/l; 11,5 g/l. S.hygroscopius D1.5 là một
VSV mesophylic, sản xuất kháng sinh nhóm ester nonaromatic. Trong nghiên cứu này,
VSV được sử dụng là B.subtilis và E.coli; sự tăng trưởng được đo bằng trọng lượng khô
của sinh khối (mg/50ml); hoạt tính kháng sinh được xác định bằng vòng vô khuẩn. Ngoài
2 điều kiện dinh dưỡng trên, các thông số vật lý khác cũng được nghiễn cứu. Kết quả thu
được là: pH, nhiệt độ lên men và số ngày lên men tối ưu lần lượt là 7,0; 30 0C; 7 ngày.
Như vậy, nghiên cứu này đưa ra một cách để sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius
D1.5 trong môi trường ít dinh dưỡng, nhiệt độ và pH kiểm soát được, từ đó góp phần
giảm giá thành sản phẩm.