Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 156 11

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪSTREPTOMYCES 156.11
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪSTREPTOMYCES 156.11
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu– bộ môn Vi sinh - Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi từ
những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy,
công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học
Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà
Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy
cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 5năm 2013.
Sinh viên
Ngô Nguyễn Quỳnh Anh

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ...............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................2
1.1. Đại cương về kháng sinh ........................................................................................2
1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh .......................................................................2
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh ...................................................................................2
1.1.3. Phân loại kháng sinh .......................................................................................2
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ......................................................................3
1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh ................................................................................4
1.1.6. Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh ..................................................4
1.1.7. Kháng sinh chống ung thư .............................................................................4
1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh ...............................................................5
1.2.Đại cương về xạ khuẩn .............................................................................................5
1.2.1. Xạ khuẩnvà sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ................................6
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ........................................................6
1.2.3.Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces...............................7
1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ....................................................8
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên ............................8
1.3.2. Đột biến cải tạo giống ......................................................................................8
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................................8
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ..........................................................................9

1.4.1.Các phương pháp lên men .............................................................................10
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ...........................................10
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ................................................10
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ................................................11
1.5.2. Các phương pháp chiết tách ..........................................................................11


1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .............................................................11
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến .................................................................................11
1.6.2.Phổ hồng ngoại .............................................................................................11
1.6.3. Phân tích khối phổ........................................................................................12
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ........................................................................12
1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomycesnâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
........................................................................................................................................12
1.8. Quá trình tiến hoá của một Dps cảm ứng có tính thấm trong chi Streptomyces....13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị .....................................................................................14
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................14
2.1.2. Máy móc thiết bị ..........................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................17
2.2.1.Chọn lọc, cải tạo giống .................................................................................17
2.2.2.Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu...........................................................17
2.2.3.Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ...........................17
2.3. Phương pháp thực nghiệm .....................................................................................17
2.3.1.Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn....................................................................17
2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.....................18
2.3.3.Chọn lọc ngẫu nhiên.....................................................................................18
2.3.4. Đột biến bằng UV ........................................................................................19
2.3.5.Phương pháp đột biến hóa học .....................................................................20
2.3.6. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh .............................................................21

2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ...........................22
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ....................22
2.3.9.Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay .........................................23


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

2.3.10.Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ....................................................23
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được..........................................24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT .................................25
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ..................................................................................25
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .......................................................................25
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 .......................................................................26
3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 .......................................................................27
3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm .................................................................28
3.6. Kết quả chọn chủng lên men..................................................................................29
3.7. Kết quả chọn pH chiết.............................................................................................30
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi...........................................................31
3.9. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh .......................................................................32
3.9.1. Kết quả sắc ký cột lần 1................................................................................32
3.9.2. Kết quả sắc ký cột lần 2 ................................................................................35
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết......................39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ISP

International Streptomyces Project
(Chương trình Streptomyces quốc tế)

B. subtilis

Bacillus subtilis

P. mirabilis

Proteus mirabilis

KS
HTKS

Kháng sinh
Hoạt tính kháng sinh

MT

Môi trường

MT2dt

Môi trường dịch thể 2

ATCC

American type culture collection
(Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ)

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

VSV

Vi sinh vật

MC

Mẫu chứng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

ĐB1

Đột biến lần 1

ĐB2

Đột biến lần 2

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr(+)

Gram dương

Gr(-)

Gram âm

DMHC

Dung môi hữu cơ


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên và ứng dụng của chúng
Bảng 2: Các vi khuẩn kiểm định.

Bảng 3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn.
Bảng 4: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.
Bảng 5: Các dung môi đã sử dụng.
Bảng 6: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên.
Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1.
Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2.
Bảng 9: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3.
Bảng 10: Kết quả chọn môi trường lên men chìm.
Bảng 11: Kết quả chọn chủng lên men.
Bảng 12: Kết quả chọn pH chiết.
Bảng 13: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký(VSV kiểm định P. mirabilis).
Bảng 14: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1.
Bảng 15: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1, 2, 3 (VSV kiểm định P. mirabilis).
Bảng 16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 – nhóm 2.
Bảng 17: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 2 (VSV kiểm định P. mirabilis).
Bảng 18: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 – nhóm 3.
Bảng 19: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 3.
Bảng 20: Kết quả IR.


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm.
Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính.
Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh.
Hình 1.4: Hình ảnh về VSV kháng kháng sinh.
Hình 1.5: Phân loại bộ Actinomycetales.
Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty xạ khuẩn.
Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.
Hình 1.8: Bản đồ vị trí DPS trong số 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales.
Hình 3.9: Kết quả chọn chủng lên men chìm tốt nhất

Hình 3.10: Biểu đồ kết quả chọn pH chiết với dung môi n - butanol.
Hình 3.11: Sắc ký cột lần 1
Hình 3.12: Sắc ký cột lần 2 - nhóm 2.
Hình 3.13: Sắc ký cột lần 2 - nhóm 3.
Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau 5 - 6 ngày.
Hình P.15: Đĩa cấy zigzag sau 5 – 6 ngày.
Hình P.16: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 bằng phương pháp khối thạch
(VSV kiểm định P. mirabilis).
Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng
Streptomyces156.11
Hình P.18: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau lên men chìm bằng
phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P. mirabilis)
Hình P.19: Kết quả hiện hình vi sinh vật (VSV kiểm định P. mirabilis).
Hình P.20: Phổ UV của kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp.
Hình P.21: Phổ IR của kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp.
Hình P.22: Phổ MS của kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm với nền kinh tế đang phát triển, nằm trong
khu vực có tỷ lệ bệnh nhiễm trùng cao nên nước ta có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất lớn.
Do nhiều nguyên nhân, tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh ngày càng diễn
biến phức tạp và đang là mối lo ngại của cả xã hội, chúng ta đã và đang phải đối mặt với
“kỉ nguyên hậu kháng sinh”. Tuy nhiên, hầu hết các kháng sinh trên thị trường dược phẩm
trong nước vẫn còn được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, bán thành phẩm hay thành
phẩm. Chính vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh nước ta
là: một mặt cải tiến các chất kháng sinh cũ và phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh,
mặt khác phải thúc đẩy việc tìm ra kháng sinh mới. Đây là yêu cầu tất yếu và cấp thiết
trong công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe nhân dân.
Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, bên cạnh tổng hợp và bán tổng
hợp, phương pháp phân lập kháng sinh từ xạ khuẩn vẫn là con đường quan trọng để tìm
được các chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới.
Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ
Streptomyces. Bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và
bước đầu có kết quả với chi xạ khuẩn Streptomyces. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề
tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờStreptomyces156.11” làm
luận văn tốt nghiệp với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh.
2. Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho quá trình lên men.
3. Tách chiết và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết.
4. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi

phi
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Chất kháng sinh (antibiotic) trước đây gọi là chất kháng khuẩn (antimicrobic) - là
thuốc được con người dùng chủ yếu để chữa các bệnh nhiễm khuẩn [21]. Cho đến nửa
sau thế kỷ XIX người ta đã xác định được vi sinh vật là nguyên nhân gây ra hàng loạt
các bệnh này. Do đó liệu pháp hoá học nhằm vào vi sinh vật gây bệnh trở thành liệu
pháp điều trị chính.
Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện
hiện tượng nấm mọc trên đĩa và quanh tảng nấm đó là những vòng diệt khuẩn. Năm
1929, ông công bố penicillin trước công chúng.Năm 1938, Howara Walter Florey và
Ernst Boris Chaen đã chiết xuất được penicillin.Năm 1942, penicillin được áp dụng
vào điều trị.Ngay sau đó, penicillin đã trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu
sống hàng triệu chiến binh trong chiến tranh thế giới II.Từ những năm 1940 đến cuối
những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được tìm ra và thời kỳ này được coi là một giai
đoạn vàng son của việc nghiên cứu kháng sinh. Năm 1944, streptomycin được phát
hiện từ vi khuẩn đất Streptomyces griseus[21].Sau đó đến chloramphenicol,
tetracycline, các kháng sinh nhóm macrolid và glycopeptides ... được tìm ra (tham
khảo phụ lục – hình 1.1). Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được
nhiều kháng sinh phổ rộng hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn, như các kháng
sinh họ β – lactam... Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men
sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con đường tổng hợp và bán tổng
hợp cũng dần phát triển.
Việc phát hiện và phát triển kháng sinh của thế kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử
vong do nhiễm khuẩn. Song từ những năm 1980, những kháng sinh mới được phát hiện
và đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí quá lớn. Đồng thời, vi sinh vật nhanh kháng
thuốc và tốc độ đó lại nhanh hơn tốc độ tìm ra thuốc mới của con người. Vì vậy, việc

3

áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật dung hợp tế bào, tái tạo gen... là rất
quan trọng để giúp con người tìm ra các chủng có HTKS cao và phát hiện các loại
kháng sinh mới [10].
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
Theo quan niệm truyền thống, kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được
từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm
hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn,
nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [3, 5].
Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật,
được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc
tiêu diệt VSV gây bệnh [1]
1.1.3. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá học,
theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng...
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra làm các nhóm chính sau đây
[1]:
1. Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
2. Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
3. Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
4. Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)
5. Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
6. Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
7. Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
8. Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)
9. Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D).
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
4

Kháng sinh có một hay nhiều đích tác dụng trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm, tuy
nhiên có thể khái quát thành 5 nhóm kháng sinh theo đích tác dụng chính (tham khảo
phụ lục – hình 1.2) [1].
1. Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn:β -lactam, vancomycin, bacitracin...
2. Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: amphotericin, polymicin...
3. Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, rifampicin...
4. Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: chloramphenicol,
tetracyclin, macrolid...
5. Ức chế chuyển hóa: co-trimoxazol.
1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh
 Trong lĩnh vực y học:
-

Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh
nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm.

 Lĩnh vực khác:
-

Trong chăn nuôi: Kháng sinh cũng được dùng để điều trị bệnh do vi sinh vật gây
ra trên động vật. Ví dụ: Griseoviridin dung điều trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú
của trâu bò...

-

Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây
trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin...[3], [12]

1.1.6. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh
Các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn được thể hiện ở hình 1.3 phần
phụ lục. [3], [4], [8].
1.1.7. Kháng sinh chống ung thư
Ở sinh vật bậc cao, mỗi tế bào có chức năng nhất định được thực hiện trong mối tương
tác/liên hệ với các tế bào khác. Khi gặp điều kiện bất thường, tế bào mất liên hệ với các
tế bào xung quanh và phân chia không ngừng tạo thành cấu trúc khối u hay ung thư.
Ung thư được điều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp cùng


5

phẫu thuật để loại bỏ khối u, chiếu xạ để phá huỷ chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hoá
trị. Nhiều chất hoá học dùng trong hoá trị liệu ung thư là sản phẩm bậc hai mà vi sinh
vật sinh ra do đó được gọi là kháng sinh chống/ kháng ung thư. Một số nhóm kháng
sinh đã được dùng trong điều trị ung thư là anthracycline, actinomycin, bleomycin... và
đạt được những kết quả khả quan.[16], [23]
1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh
Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một
thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu [22].

Hình 1.4: Vi khuẩn kháng kháng sinh
Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng thuốc
tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất
định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các
enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường
trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng. [5]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria)có cấu tạo dạng sợi
phân nhánh. Chúng phân bố rộng rãi và đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và
tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
6

“actys” (tia) và “mykes” (nấm).Đa số xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất. Trong mỗi gam
đất nói chung có tới hàng triệu xạ khuẩn [5].
Streptomyces là chủng phổ biến, chiếm tới 95% các chủng phân lập được.Xạ khuẩn có
thể được phân lập từ nước ngọt nhưng mật độ hiện diện thấp hơn. Các giống phổ biến
là Actinoplanes, Micromonospora... Nhiều giống xạ khuẩn đã được phân lập từ nước
biển và trầm tích biển bao gồm Streptomyces, Mocrobispora...[22]
Xạ khuẩn tổng hợp được nhiều chất có giá trị, đặc biệt là kháng sinh.Chúng sản sinh
một lượng lớn chất kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng. [3]

Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế
bào (nội bào) hay phóng thích ra ngoài môi trường (ngoại bào).Các chủng xạ khuẩn
cùng loài có thể sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chủng thuộc các loài
khác nhau có thể sản xuất cùng một loại kháng sinh. Bảng 1 phần phụ lục đưa ra một
số kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp và ứng dụng của chúng.[13]
Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc.Khuẩn lạc xạ
khuẩn thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp toả ra theo
hình phóng xạ, đồng tâm hay chia thuỳ. Với hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và đa
số không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Kích thước và
khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy
(khoảng từ 0,3µm đến 2-3µm).Để hiểu rõ hiểu sự đa dạng của xạ khuẩn, hình 1.5 phần
phụ lục giới thiệu phân loại bộ Actinomycetales.[5]
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces
Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomytaceae, bộ Actinomycetales.
Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là
từ Streptomyces[8].
Dưới đây là các đặc điểm thường thấy ở xạ khuẩn Streptomyces:
Đặc điểm hình thái:Streptomyces phát triển thành dạng sợi, sợi nhỏ, dài. Mạng lưới
phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí


7

sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất.Hệ sợi chia làm 2 loại là khuẩn ty cơ chất
và khuẩn ty khí sinh [5].

Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty của xạ khuẩn
cp – tế bào chất; cm – màng tế bào chất; cw – thành tế bào; me – mezoxom; se – vách
ngăn; ri – riboxom; re – chất dự trữ
Đặc điểm cấu tạo: Cấu tạo của Streptomyces chia làm ba phần: thành tế bào, màng tế

bào chất, tế bào chất. Trong đó thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I,
có chứa L – diaminopimelic acid ( L –ADP ) và glycin.
Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là VSV dị dưỡng và hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát
triển từ 20-40°C (thích hợp là 26-32°C), pH thích hợp là 6,8-7,5. Nguồn hydratcacbon
như tinh bột, glucose... Nguồn nitơ như muối nitrat, amoni...
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành bốn loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của
khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt khuẩn lạc), sắc tố
melanoid.
1.2.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
- Qua đặc điểm hình thái: khóa phân loại ISP được sử dụng làm bảng phân loại
chính để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa trên các đặc điểm: màu
khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử, khả năng
tạo sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, khả năng tiêu thụ các nguồn đường. [5]
- Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN; phản ứng PCR, giải trình tự 16S rADN và
phân tích cây chủng loại phát sinh. [8]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
8

1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20 - 40 % so với những cá thể khác.

Chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.[3]
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban
đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng
siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[3],
[15]
1.3.2. Đột biến cải tạo giống
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:
- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật lý
hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV).
- Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh học biến đổi gen.
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu
hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi
các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm
tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương) [8, 15]
Đặc biệt, hiệu quả của đột biến UV chịu tác động của các nhân tố: khoảng thời
gian giữa lúc chiếu xạ và lần sao chép tiếp theo của ADN, mức độ tổn thương ADN,
hoạt tính enzyme sửa chữa trong tế bào xạ khuẩn [15]
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến
bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các
gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.[3]
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn


9

Bảo quản giữ giống VSV là công việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa, nhầm
lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học [3].
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: cấy

chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2°C, định kỳ cấy chuyền sang môi
trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng),
đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu
đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp) [8]
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ
khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh ở
2°C và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần [3].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật
nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất
trung gian cho chúng [3].
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá
trình sinh trưởng củavi sinh vật, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng.

Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.
1.4.1. Các phương pháp lên men


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
10

- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay
thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô

hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi
hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng
môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men
bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[3]
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3
chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi
hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn. [3], [7]
1.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
-pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp
của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác
dụng gián tiếp.
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng
oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút
ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh
trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy
lớn nên thông khí mạnh là tốt.[3]
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất
cho sinh tổng hợp chất mong muốn.[3], [7]
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên
men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường
thấp.[3], [12]


11

1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng

-Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ không đồng tan:chuyển kháng sinh
cần tách (đang hòa tan trong dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ.
- Tinh chế sản phẩm với mục đích thu lấy KS tinh khiết. Phương pháp sắc ký:
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả
năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất
hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ.Đại
lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân
bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm
phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi
vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh [13], [20]
1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức năng
lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa cấu trúc hóa
học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ
(Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp thụ càng chuyển về
bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên
hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS.
1.6.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái năng
lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử [2].
Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử.Mỗi bước
sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.
1.6.3. Phân tích khối phổ


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai

tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
12

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo
thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện tử có năng
lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Các tín

6

hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ
khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ [6].
Dựa vào khối phổ có thể định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định
cấu trúc và định lượng các chất [2].
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hiện nay là kỹ thuật ưu việt và triệt để nhất trong phân
tích, biện giải toàn bộ phổ [13]
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ
thuộc cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số µ của từ trường biến thiên. Biện
giải phổ phụ thuộc các yếu tố sau: độ chuyển dịch hóa học (vị trí tín hiệu cộng hưởng),
tương tác spin – spin và độ dịch chuyển dưới tín hiệu.
1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh. [24]
Sự biểu hiện của các cụm gen chuyển hóa thứ cấp trong Streptomycetes được điều
khiển bởi gen hoạt hóa. Tăng số lượng bản sao làm tăng sản xuất kháng sinh hoặc kích
hoạt các cụm gen câm. Đặc tính này đã được sử dụng cho các nhân bản của abaA,
afsQ1/Q2, afsR từ Streptomycescoelicolor và afsR2from Streptomyces lividans làm
tăng sinh tổng hợp KS. Để tạo ra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064

(NRRL3585) thư viện gen của 2.400 cosmids (kích thước trung bình là 33 kb, ~ 10
gen) trong Escherichia coli và sau đó chuyển các bản sao trực tiếp đến S. lividans để
kiểm tra khả năng sinh kháng sinh. Ngoài ra, đưa pUZ8002 plasmid vào vi khuẩn E.
coli XL1-Blue MR để sản xuất dòng XLUZ. pUZ8002 huy động oriT-plasmid có hiệu
quả từ E. coli. XLUZ như các máy chủ nhân bản để xây dựng các thư viện gen S.


13

clavuligerus. Sử dụng pJTU2554 tích hợp (attP φC31) cos oriT vector làm vector nhân
bản. Các dòng vô tính của thư viện di truyền có thể được huy động vào S. lividans trực
tiếp, mà không có một bước chuyển đổi DNA bổ sung.Các chủng vi khuẩn E. coli có
chứa các clavuligerus cosmids S. được nuôi cấy. Trong đó, tìm thấy exconjugants 4%
đã được kích hoạt bởi các dòng vô tính cosmid giới thiệu. Tất cả 105 cosmids lại được
đưa vào S. lividans bằng cách tiếp hợp, và xác nhận rằng sản xuất kháng sinh là do
cosmids mà không phải do đột biến tự phát.
1.8. Quá trình tiến hoá của một protein nhị nguyên (Dps) cảm ứng có tính thấm
trong chi Streptomyces. [25]
Protein nhị nguyên(Dps) có mặt ở hầu hết trong hệ gen vi khuẩn, và hiện tại người ta
đánh giá cao sự phản ứng đa dạng của chúng khi bị kích thích. Nghiên cứu trước đây
chỉ ra rằng nhóm protein này tạo thành các dodecamer (thể nhị thập) và cấu trúc bậc 4
có chức năng quan trọng.
Hơn nữa, tỷ lệ Dps trong toàn bộ hệ gen có thể thay đổi, thậm chí ở các loài có
mối quan hệ chặt chẽ, song chi tiết này vẫn chưa được lí giải thoả đáng.Hình 1.8 phần
phụ lục đưa ra bản đồ vị trí Dps trong số 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales. Chúng tôi
xây dựng lại lịch sử tiến hoá có thể nhất của Dps trong hệ gen Streptomyces. Thông
thường các vi khuẩn mã hoá cho nhiều hơn một gen Dps. Sự thay đổi về số lượng của
Dps có thể do lặp đoạn, mất đoạn hay thêm đoạn. Nghiên cứu cho rằng bộ gen của
S. coelicolor mã hoá cho 3 Dps bao gồm một Dps không đuôi. Thí nghiệm invivo cho
thấy một Dps kém phát triển hơn hai Dps còn lại, không dễ nhận ra oligomerise. Các

vùng khởi động (promoter) biểu hiện gen nhân đôi Dps cho thấy cặp gen paralogous là
khác biệt, sự tương quan này chỉ ra sự xuất hiện của các vùng khởi động sigB. Cuối
cùng, chúng tôi tìm ra một nhóm mới của Dps và đại diện của các protein này trong S.
coelicolor với cấu trúc bậc 4 dodecamer tính ổn định cao.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 156.11do Bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ mẫu đất trồng trọt tại miền Bắc.
 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được trình
bày ở bảng 2.
Bảng 2: Các vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gr(+)

Vi khuẩn Gr(-)

Bacillus subtilis ATCC 6633

Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường
-Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở bảng 3.
- Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng
loại bỏ thạch.
- Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần các MT được trình bày ở bảng 4.
Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định đều
được tiệt trùng ở 118 – 120°C trong 30 phút
Bảng 3: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần

Đơn vị

MT1

MT2

MT5

Tinh bột

g

2

2

2,4

Glucose

g

1

Cao thịt

g

0,3

Pepton

g

0,3

KNO3

g

KCl

g

0,05

NaNO3

g

0,2

0,1


15

CaCO3

g

0,4

FeSO4.7H2O

g

0,01

K2HPO4

g

0,05

0,1

MgSO4.7H2O

g

0,05

0,05

NaCl

g

0,05

Thạch

g

1,8

2

2

Nước

ml

100

100

100

pH

6,8 – 7,2
Bảng 4: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

%

%

%

%

MT canh thang

0,5

0,3

0,5

0

MT thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,8

Thành phần

 Dung môi: Bảng 5 giới thiệu các dung môi sử dụng trong nghiên cứu.
Bảng 5: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi
Aceton

Khối lượng riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (°C)

0,79

56

Acetonitril

0,782 – 0,783

80 – 82

n – butanol

0,81

116 – 118

Butylacetat

0,880 – 0,885

117 – 118

Cloroform

1,470 – 1,480

60 – 62

1,32

40

Ethanol

0,789 – 0,791

78,3

Ethylacetat

0,889 – 0,901

70,4

Diclorometan

NH4OH 25%
Methanol

0,880
0,791 – 0,793

64,5

pH

7,0 – 7,4