Góp phân nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 166 28

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

SOUTTHIDA VONGSAVATH

GÓP PHẦN NGHIÊN CƢ́U LÊN MEN TỔNG
HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES
166.28

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TÊ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

SOUTTHIDA VONGSAVATH

GÓP PHẦN NGHIÊN CƢ́U LÊN MEN TỔNG
HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES
166.28
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
PGS – TS. Cao Văn Thu
Nơi thƣ̣c hiên:
̣
Bô ̣ môn Vi sinh - Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nôị

HÀ NỘI - 2013


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 2
1.1 Đại cương về kháng sinh .................................................................................. 2
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ............................................................... 2
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh ............................................................................ 2
1.1.3 Phân loại kháng sinh ............................................................................... 3
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.............................................................. 3
1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh ................................................................. 4
1.2 Đại cương về xạ khuẩn..................................................................................... 5
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................................ 5
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces .............................................. 6
1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh ............................................................... 8
1.4 Tuyển chọn , cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn ................................... 9
1.4.1 Chọn lọc ngẫu nhiên ............................................................................... 9
1.4.2 Đột biến cải tạo giống ............................................................................. 9
1.4.3 Bảo quản giống ....................................................................................... 9
1.5 Lên men tổng hợp kháng sinh ....................................................................... 10
1.5.1 Đại cương ............................................................................................... 10
1.5.2 Các phương pháp lên men...................................................................... 10

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ....................................... 12
1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ........................................ 12
1.6.2

Các phương pháp chiết tách ............................................................ 12

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ..................................................... 13
1.7.1 phổ tử ngoại – khả kiến ( UV-VIS) ....................................................... 13
1.7.2 Quang phổ hồng ngoại (IR) ................................................................... 13


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

1.7.3 phổ khối ( MS) ....................................................................................... 13
1.8 Một số nghiên cứu liên quan . ....................................................................... 13
1.8.1 Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những13
chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày.............. ……….13
1.8.2 Tối ưu hóa môi trường lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh
vancomycin ……..…………………...………………………………..…………14
CHƢƠNG II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... ..15
2.1 Nuyên liệu và thiết bị ..................................................................................... 15
2.1.1 Chủng xạ khuẩn ..................................................................................... 15
2.1.2 Ví sinh vật kiểm định ............................................................................. 15
2.1.3 Các môi trường ...................................................................................... 15

2.1.4 Dung môi............................................................................................... 17
2.1.5 Một số dụng cụ , máy móc. ................................................................... 18
2.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 18
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ......................................................................... 19
2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh............................................................. 19
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ................... 19
2.3 Phương pháp thực nghiệm ............................................................................ 19
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ........................................................... 19
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ............. 20
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên .............................................................................. 21
2.3.4 Đột biến bằng ánh sáng UV ................................................................. 21
2.3.5 Phương pháp đột biến hoá học ............................................................. 23
2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ..................................................... 23
2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ................... 24
2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ............ 24
2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay .................................. 25


2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ............................................ 26
2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được................................... 26
CHƢƠNG III : KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHÂN XÉT .................... 27
3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................. 27
3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1. ........................................................ 28
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2. ........................................................ 29
3.4 Kết quả đột biến hóa học........................................................................... 30
3.5 Kết quả chọn môi trường lên men. .......................................................... 31
3.6 Kết quả lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh ...................................... 32
3.7 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi ............................................. 33
3.8 Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột. ............................................ 33
3.9 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết ........... 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 39


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS -TS
Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh – Sinh học người đã tâ ̣n tình hướng dẫn tôi từ những bước
đầ u tiên cho đế n khi tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ , kỹ thuật viên giảng dạy ,
công tác ta ̣i Bô ̣ môn Vi sinh - Sinh ho ̣c, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Viê ̣n vê ̣ sinh dich
̣ tễ
Trung ương, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã
giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dip̣ này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đế n Ban giám hiê ̣u cùng toàn thể các thầ y
cô giáo trường Đa ̣i ho ̣c Dươ ̣c Hà Nô ̣i đã da ̣y dỗ và ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i cho tôi trong
thời gian tôi ho ̣c tâ ̣p ta ̣i trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên

, giúp đỡ tôi

trong suố t thời gian thực hiê ̣n khóa luâ ̣n.
Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu, khóa

luâ ̣n này còn có nhiề u thiế u sót . Tôi rấ t mong nhâ ̣n đươ ̣c sự góp ý của các thầ y cô , bạn bè để
khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013.
Sinh viên

Soutthida Vongsavath


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

ATCC

American Type Culture Collection

DM

Dung môi

ĐB

Đột biến

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr(+)

Gram dương

Gr(-)

Gram âm

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

ISP

International Streptomyces Project

(Chương trình Streptomyces quốc tế)
IR

Infrared ( hồng ngoại )

KS

Kháng sinh

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

MTth

Môi trường thích hợp

MC

Mẫu chứng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

UV

Ultra violet ( tử ngoại)


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên.
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS đột biến lần 1
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2.
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học
Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men chìm
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men
Bảng 3.7: Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Bảng 3.8: kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc kí lần 1.
Bảng 3.9: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2

Bảng 3.10: kết quả IR.
Bảng 3.11: Kết quả dự đoán từ phổ MS


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh
Hình 1.2: Khuẩn lạc xạ khuẩn
Hình 1.3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
Hình 1.4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
Hình 1.6: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
Hình P.1: Hình thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
Hình P.3: Hình thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch..
Hình P.3: Hình thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc
Hính P.4: Hình phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV
Hính P.5: Kết quả đo phổ UV của kháng sinh tinh khiết thu được
Hình P.6: Kết quả đo phổ IR của kháng sinh tinh khiết thu được
Hình P.7: Kết quả đo phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới , tỷ lệ bệnh nhiễm trùng trong cơ cấu
bệnh còn rất cao , vì thế kháng sinh là rất quan trọng do kháng sinh là một trong những
công cụ đắc lực của các bác sỹ , dược sỹ trong phòng và chữa bệnh, nhất là các bệnh
nhiễm khuẩn, nhiễm nấm , ngoài ra kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi , trông
trọt và công nghiệp thực phẩm .
Tuy nhiên trên thị trường dược phẩm nước ta hiện nay , hầu hết các kháng sinh
đều được nhập khẩu ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm , ngành công nghiệp sản
xuất kháng sinh chưa thực sự hình thành. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong các
nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới của tổ chức y tế thế giới ( WHO ) .
Do đó, đẩy mạnh nghiên cứu , sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị cao , độc
tính thấp và ít bị kháng thuốc là một yêu cầu tất yếu trong phát triển y tê.
Môi trường tự nhiên rất đa dạng của nước ta là một điều kiện thuận lới cho sự
sinh sôi , phát triển của hệ vi sinh vật , trong đó đáng chú ỳ là các xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh , đặc biệt là chi xạ khuẩn Streptomyces vì trong tất cả
các kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 60% nhuồn gốc từ xạ khuẩn và
55% trong số đó thuộc chi Streptomyces.
Nắm bắt được xu hướng này , chúng tôi lựa chọn dề tài “ Góp phần nghiên cứu
lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28” đề làm khóa luận tốt nghiệp
với các mục tiêu như sau:
 Nghiên cứu cải tạo giống đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của
chủng Streptomyces 166.28.
 Nghiên cứu điều kiện lên men , chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt nhất.
 Nghiên cứu 1 vài đặc tính của kháng sinh thu được


2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Đại cƣơng về kháng sinh

1.1.1 Lich sử nghiên cứu kháng sinh
Người đầu tiên đạt nền móng cho khoa học nghiên cứu chất kháng sinh là
Alexander Fleming – nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra tác dụng kháng sinh
vào tháng 10-1928 .[17]
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học
Anh, Mỹ, penicillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành “ một
loại thuốc thần kỳ” . Năm 1945, A.Fleming , E.Chain và H.W.Florey đã được nhận
giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên
mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.[17]
Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu kháng
sinh với hàng loạt chất kháng sinh mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin,
tiroxidin do Rene’Jules Dubos phát hiện năm 1939, Streptomycin do Waksman phát
hiện năm 1941, Erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952 … Cùng với việc phát hiện
ra các chất kháng sinh mới , công nghệ lên men sản xuất chất kháng sinh cũng ra đời
và dần được hoàn thiện [8]
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những hợp chất cón nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có tác dụng
ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh ( cũng như cả với các
tế bào ung thư ) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người ,
động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung. [9,15]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
3

1.1.3 Phân loại kháng sinh
Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá
học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng...[15]
Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hoá học là chủ yếu, chia kháng sinh thành các
nhóm chất sau đây:
- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
- Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)
- Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (dactinomycin D).
- Các kháng sinh khác : rifampicin … [9,16]
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác
nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các
phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng
sinh tác dụng lên các đích khác nhau. [15]Có 6 kiểu chủ yếu:
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.[16]


4

Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh
1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh
+ Trong lĩnh vực y học:
Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh
nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm.[15]
+ Lĩnh vực khác:


Trong chăn nuôi: Bác sỹ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật
:Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò … kháng sinh còn
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc , gia cầm, giảm chi phí
thức ăn , tăng sản lượng trứng ở gà , vịt … [15]



Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây
trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin...[15]



Trong công nghiệp thực phẩm: Một số kháng sinh được dùng để bảo quản thực
phẩm tươi, đóng hộp; ví dụ: Subtilin, Nisin... [15]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien

mien phi
phi
5

1.2 Đại cƣơng về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng
rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam
đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi
sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng hợp
được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[15]
Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là
do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme
(amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[15]
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
- Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ
sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn
khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng
phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[5] (Hình 2)

Hình 1.2 : khuẩn lạc xạ khuẩn


6

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc trồi .
Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng,
xám… [5]
- Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3.[15]

Actinomycetes

Actinomycetales

Actinoplanaceae

Streptoverticulum

Streptomycetaceae

Streptomyces

VSV giống xạ khuẩn

Actinomycetaceae

…

Themostreptomyces

…

Hình 1.3 : sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có
cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces. (Tham khảo phụ lục 1) [7]
- Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty
khí sinh:

+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong
suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số
loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.[6]


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
7

+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau
một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ.[6]
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc
câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ
yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có
gai (sp) hoặc có tóc (sp). [20]
Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn.

`Hình 1.4 : Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để
phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng
lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành
nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là
25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[8,19]
- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố

melanoid .


8

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
Dưới dây giới thiệu sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh [4,9]
Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm
Nhân giố ng trong phòng thí nghiê ̣m
Nhân giố ng trên thiế t bi ̣nhân giố ng
Lên men tổng hợp kháng sinh
Dịch lên men
Lọc, ly tâm
Sinh khố i
Dịch lọc

Chiế t bằ ng dung môi hữu cơ

Dịch chiết sinh khối

Dùng cột trao đổi ion…
Dịch chiết
Cô, tinh chế
Sản phẩm tinh chế
Kiể m nghiê ̣m
Sản phẩm đã được kiểm nghiê ̣m
Đóng gói
Sản phẩm đóng gói

Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
9

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn
1.4.1. Chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết , có cả thể có HTKS tăng lên 20-30% so với những cá thể khác , phương pháp
này giúp tuyển chọn các cá thể có HTKS cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp [9]
1.4.2. Đột biến cải tạo giống
Trong thực tế việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất . Để thu được những chủng có khả
năng siêu tổng hợp kháng sinh người ta áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo.[9]
Có 3 nhóm tác nhân gây gây đột biến :
 Tác nhân hóa học : Hydroxylamin, ethylenimin, nitroso-guanidine, HNO2…
 Tác nhân vật lý : Ánh sáng UV, tia X, tia gamma hay electron… Khả năng gây
đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ bức xạ, khoảng cách chiếu
và thời gian chiếu .
 Tác nhân sinh học : Các yếu tố di truyền động transposan , phage Mu ..v..v..
Sau khi chiụ tác đô ̣ng của các tác nhân đô ̣t biế n , phầ n lớn các VSV chế t . Trong
số các biế n chủng số ng sót có biế n chủng có hiê ̣u suấ t sinh tổ ng hơ ̣p KS tăng (đô ̣t
biế n dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đô ̣t biế n âm). Cầ n cho ̣n lo ̣c ra những
biế n chủng có hiê ̣u suấ t sinh KS tăng để nghiên cứu tiế p . [12]

1.4.3 Bảo quản giống
Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật có thể kể đến như : bảo quản lạnh,
cấy chuyền, làm khô, đông khô, đông lạnh, ổn định trong đất …[13] Để giữ giống xạ
khuẩn trong phòng thí nghiệm , cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi
trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3-6
tháng cấy lại 1 lần [14]


10

1.5 Lên men tổng hợp kháng sinh
1.5.1 Đại cƣơng .
Lên men là quá trình phân giải hydrocacbon trong điều kiện thích hợp ( hiếu
khí hay kị khí ) và kháng sinh là một trong những sản phẩm quan trọng của quá trình
lên men sử dụng xạ khuẩn.[9] Cụ thể hơn , kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai,
được tạo thành gần váo lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn ,thường vào
gần hoặc vào chính pha cân bằng [15]
Hình 6: giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4
giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn.[15]

Hình 1.6 : Đƣờng cong sinh trƣởng phát triển của xạ khuẩn
1.5.2 Các phƣơng pháp lên men
 Lên men bề mặt.
Lên men bệ mặt là thực hiện nuôi cấy VSV trên bề mặt MT dịch thể hoặc rắn,
bán rắn . VSV hấp thụ các chất của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề
mặt MT dinh dưỡng [4]


Ket-noi.com

Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
11

+ Ưu điểm : đơn giản , dễ thực hiện, chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp.
+ Nhược điểm : hiệu suất thấp, tốn diện tích , khó cơ giới hóa , tự động hóa.
 Lên men chìm.
Vi sinh vật được nuôi cấy trong MT dịch thể , phát triển trong không gian 3
chiều của môi trường lỏng . [4]
+ Ưu điểm : sử dụng MT dịch thể tốt nhất , đáp ứng nhu cầu sinh lý của VSV.
Hiệu suất sử dụng không gian cao . các thiết bị dễ cơ giới , tự động hóa, tiết kiệm mặt
bằng , nhân công, cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận
lợi. [13]
+ Nhược điểm: chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn . [13]
 Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men
với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc
quá trình, người ta thu lấy sản phẩm. [4]
+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường
dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả sử
dụng bình lên men. [4]
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời
bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình. [4]
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những

khoảng thời gian nhất định. [4]


12

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá
trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men
thường thấp. Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản
phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn tinh
chế sẽ góp phần quyết định tới giá thành của sản phẩm.[9]
1.6.2 Các phƣơng pháp chiết tách
- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc (hoặc
bông), bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suất trên và
dưới lớp lọc. [1]
- Ly tâm: là phương pháp tách các chất có khối lượng riêng khác nhau, thường
là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm. [1]
- Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan trong
dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ. [11]
- Các phương pháp sắc ký:
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả
năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất
hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại
lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf. [2]
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân
bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm
phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được
nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. [11]

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
13

1.7 Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.7.1 phổ tử ngoại – khả kiến ( UV-VIS)
Các phân tử chất nghiên cứu hấp phụ năng lượng các bức xạ vùng UV-VIS làm
thay đổi mức năng lượng điện tử .[1] giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có
quan hệ chặt chẽ , chỉ những phân tử có điện tử dễ bị kích thích hấp phụ năng lượng
ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái bị kích thích . Phương pháp này
thường được sử dụng phối hợp với các phương pháp khác như quang phổ hồng ngoại,
phổ cộng hưởng từ hạt nhân trong việc xác định cấu trúc . [18]
1.7.2 Quang phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hấp thụ hồng ngoại của một chất là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường
độ hấp thụ bức xạ IR của chất đó vào số song hoặc bước sóng. [18]
Trong phân tử một chất , khi có một nhóm nguyên tử hấp phụ năng lượng và thay
đổi trạng thái dao động thì xuất hiện một dải hấp phụ trên phổ IR . Các dải hấp phụ
đặc trưng cho các nhóm chức là cơ sở để phân tích cấu trúc phân tử bằng phổ IR [18]
1.7.3 phổ khối ( MS)
Khối phổ ( mass spectrometry – MS ), khác với các kỹ thuật quang phổ , không
dùng bước xạ điện tử . Đây là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và diện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu . Các
ion được tạo thánh trong buồng ion hóa , được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận tích
khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị chân không.

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ
khác nhau tập hợp lại thánh một khối phổ đồ hoặc phổ khối [1]
1.8 Một số nghiên cứu liên quan .
1.8.1 Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những
chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày [21].
Việc tìm kiếm những kháng sinh mới là rất cần thiết , góp phần giảm thiểu tình
trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang tiếp diễn .


14

Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra một nguồn giàu tiềm năng cho việc phát
hiện các kháng sinh mới là những loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên các côn trùng
thuộc bộ Hymenoptera. Để chứng minh điều này , các nhà khoa học ở bộ môn vi sinh
vật học , trường Đại học Madison – Wisconsin, Mỹ đã nghiên cứu trên hai loài ong
bắp cày Sceliphron caementarium và Chalybion californium. Họ tiến hành phân lập
làm giàu phân lập từ 33 con ong bắp cày và thu được hơn 200 chủng xạ khuẩn thuộc
chi Streptomyces . Nghiên cứu 15 loài trong số những xạ khuẩn phân lập được , phát
hiện 11 chất chuyển hóa bậc hai có cấu trúc khác nhau , trong đó có một chất chứa
vàng lactam chưa bão hòa gọi là sceliphrolactam . Đồng thời , họ cũng nghiên cứu
hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của kháng sinh do 15 loài xạ khuẩn này sinh ra.
Các loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên ong bắp cày giúp bảo vệ loài ong này khỏi
các vi sinh vật gây bệnh , và chúng có thể là nguồn cung cấp những kháng sinh tự
nhiên mới mà các nhà nghiên cứu dược phẩm quan tâm.
1.8.2 Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh
vancomycin [20]
Hiện nay vancomycin được sản xuất bởi xạ khuẩn Streptomyces Orientalis theo
quy mô công nghiệp nhưng hiệu suất còn thấp . Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục
đích tối ưu điều kiện nuôi cấy để nâng cao sản lượng sinh khối và tăng cường tích lũy
kháng sinh của Streptomyces Orientalis . Nghiên cứu này sử dụng chủng Streptomyces

Orientalis 4912. Xạ khuẩn được nuôi cấy trên một số môi trường khác nhau trong 120
giờ ở 28oC rồi định lượng sinh khối thu được để chọn ra môi trường nhân giống và
môi trường lên men thích hợp .
Kết quả MT48 được chọn làm môi trường nhân giống và MT11 được chọn làm
môi trường lên men . Trên cơ sở môi trường 11 , nghiên cứu ảnh hưởng của các thành
phần chính là carbon và nitơ . Kết quả thu được: nguồn carbon tốt nhất cho sự sinh
tổng hợp kháng sinh là sử dụng đường saccaroza , nguồn nitơ tốt nhất là nitơ hữu cơ
như pepton. Khi nuôi cấy trên MT đã được tối ứu hóa , chất kháng sinh tăng 38,7%,
sinh khối tăng 46,6% so với khi nuôi cấy trên MT gốc.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
15

CHƢƠNG II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nuyên liệu và thiết bị
2.1.1 Chủng xạ khuẩn
Chủng Streptomyces 166.28 đã qua phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh cao , phổ tác dụng rộng , do bộ môn Vi sinh – Sinh học , trường
Đại học Dược Há Nội cung cấp

2.1.2 Ví sinh vật kiểm định
Các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược

Há Nội cung cấp
Chủng Gr (+) : Bacillus cereus ATCC 9946
Chủng Gr (-) : Shighella flexneri DT 112.

2.1.3 Các môi trƣờng
 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định : được trình bày ở bảng 1

Bảng 2.1: Môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định
NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước

%

%

%

%

(ml)

MT canh thang

0,5

0,3

0,5

0

MT thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,8

Thành phần

100

pH

7,0-7,4

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định đều
được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút

16

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn : các môi trường được ký hiệu từ MT1 đến MT3
được trình bày ở bảng 2
Bảng 2.2: Các môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần

Đơn vị

MT1

MT2

Tinh bột

g

2

2

Lactose

g

Glucose

g

Saccarose

g

Cao ngô

g

Bột đậu tương

g

Cao thịt

g

Pepton

g

KNO3

g

KCl

g

0,05

NaNO3

g

0,2

NH4NO3

g

0,2

CaCO3

g

0,3

(NH4)2SO4

g

FeSO4.7H2O

g

0,01

K2HPO4

g

0,05

0,1

0,1

MgSO4.7H2O

g

0,05

0,05

0,15

NaCl

g

0,05

Cao nấm men

g

Thạch

g

1,8

2

2

Nước

ml

100

100

100

pH

MT3

3,0

0,5

0,1

6,8-7,2