Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ streptomyces 184 225

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM OANH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM OANH
MÃ SINH VIÊN: 1301314

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS. TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

thầy giáo PGS.TS. Cao Văn Thu – người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, hết
lòng truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em từ
những ngày đầu tiên nghiên cứu khoa học tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng dạy
công tác tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học
Dược Hà Nội, Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà
Nội, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô
giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận
lợi cho em trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, em dành lời cảm ơn đến gia đình thân thương, bạn bè đã luôn quan
tâm, ủng hộ, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện
khóa luận này.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như điều kiện nghiên cứu và kiến thức bản
thân có hạn, khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được
sự đóng góp ý kiến từ thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Kim Oanh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN .....................................................................................2

1.1.

Đại cương về kháng sinh .................................................................................2

1.1.1.

Định nghĩa kháng sinh .......................................................................................2

1.1.2.

Phân loại .............................................................................................................2

1.1.3.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh.........................................................................2

1.1.4.

Vấn đề đề kháng kháng sinh ..............................................................................2

1.2.

Đại cương về xạ khuẩn ....................................................................................3

1.2.1.

Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces .................................................3

1.2.2.

Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn .....................................................................4

1.2.3.

Một số khóa phân loại của xạ khuẩn..................................................................4

1.2.4.

Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng ........................................................................4

1.2.5.

Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 ......................................4

1.3.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .........................................5

1.3.1.

Mục đích ............................................................................................................5

1.3.2.

Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên........................................5

1.3.3.

Đột biến cải tạo giống ........................................................................................5

1.3.4.

Bảo quản giống xạ khuẩn ...................................................................................6

1.4.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ................................................................6

1.4.1.

Khái niệm lên men .............................................................................................6

1.4.2.

Phương pháp lên men ........................................................................................6

1.4.3.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ...............................................7

1.5.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men .......................................7

1.5.1.

Phương pháp chiết xuất......................................................................................8

1.5.2.

Các phương pháp tinh chế .................................................................................8

1.6.

Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .....................................................................9

1.6.1.

Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS) ....................................................................9

1.6.2.

Phổ hồng ngoại (IR) .........................................................................................10


1.6.3.

Phổ khối lượng (MS) .......................................................................................10

1.6.4.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ...............................................................11

1.7.

Các nghiên cứu liên quan ..............................................................................11

1.7.1.

Nghiên cứu về chủng Streptomyces flavogriseus NJ-4 – chủng mới cho sản

xuất actimomycin D và holomycin (2017) ....................................................................11
1.7.2.

Hợp chất nhóm actinomycin mới từ chủng Streptomyces sp. RAB12 - tiềm

năng kháng khuẩn cao (2018)........................................................................................12
CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................14

2.1.

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................14

2.2.

Nguyên vật liệu và thiết bị .............................................................................14

2.2.1.

Nguyên vật liệu ................................................................................................14

2.2.2.

Máy móc, thiết bị, dụng cụ ..............................................................................16

2.3.

Nội dung nghiên cứu ......................................................................................16

2.3.1.

Chọn lọc, cải tạo giống ....................................................................................16

2.3.2.

Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh .........................................................16

2.3.3.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh ....................................................................16

2.3.4.

Xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được .....................16

2.4.

Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................17

2.4.1.

Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ......................................................................17

2.4.2.

Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ........................17

2.4.3.

Nguồn hydrat carbon tốt nhất cho môi trường nuôi cấy ..................................18

2.4.4.

Phương pháp cải tạo giống...............................................................................18

2.4.5.

Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh .........................................................20

2.4.6.

Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ...............................21

2.4.7.

Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cô quay chân không ..........................21

2.4.8.

Tách, tinh chế kháng sinh thô bằng phương pháp sắc ký ................................22

2.4.9.

Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết ..............................................23

2.4.10.

Xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được ........................................23

CHƯƠNG 3:
3.1.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ..............................24

Cải tạo giống nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng

Streptomyces 184.225 ...................................................................................................24
3.1.1.

Kết quả chọn nguồn hydrat carbon tốt nhất cho môi trường nuôi cấy ............24


3.1.2.

Kết quả sàng lọc chọn chủng có HTKS cao nhất ............................................24

3.1.3.

Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng

Streptomyces 184.225 ...................................................................................................25
3.2.

Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh ................................................27

3.2.1.

Chọn môi trường lên men chìm tốt nhất ..........................................................27

3.2.2.

Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất ...............................................28

3.3.

Chiết kháng sinh từ dịch lọc dịch lên men...................................................29

3.4.

Tinh chế chất kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ ..........................29

3.4.1.

Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký ...............................................................29

3.4.2.

Kết quả kết tinh ................................................................................................32

3.5.

Kết quả phổ ....................................................................................................33

3.5.1.

Kết quả phổ của kháng sinh 2 ..........................................................................33

3.5.2.

Kết quả phổ của kháng sinh 1 ..........................................................................37

3.5.3.

Kết quả phổ kháng sinh 3.................................................................................38

3.6.

Bàn luận ..........................................................................................................39

CHƯƠNG 4:

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT..............................................................40

4.1.

Kết luận ...........................................................................................................40

4.2.

Đề xuất ............................................................................................................40

PHỤ LỤC .....................................................................................................................45


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

COSY

Corelation Spectroscopy – Phổ NMR tương quan

D̅

Đường kính trung bình

DMHC

Dung môi hữu cơ

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer – Phổ tăng
cường không biến dạng nhờ chuyển giao phân cực

ĐBHH

Đột biến hóa học

ĐBUV

Đột biến UV

Gr (-)

Gram âm

Gr (+)

Gram dương

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coleration – Phổ tương quan đa
liên kết dị nhân

HR-MS

High Resolution Mass Spectrometry – Phổ khối hiệu năng cao

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence – Phổ kết hợp lượng tử
đơn dị nhân

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Infra red – Hồng ngoại

ISP

International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces
quốc tế

KS

Kháng sinh

MS

Mass spectrometry – Phổ khối

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NMR

Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

s

Sai số có hiệu chỉnh

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

UV-VIS

Ultraviolet-visible spectroscopy – Phổ tử ngoại-khả kiến

V

Thể tích

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Tên các vi khuẩn kiểm định
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy VK kiểm định
Bảng 2.3. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)
Bảng 2.4. Dung môi sử dụng
Bảng 2.5. Các hóa chất sử dụng
Bảng 3.1. Kết quả thử HTKS với các nguồn hydrat carbon khác nhau
Bảng 3.2. Kết quả chính thử HTKS sau SLNN
Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 1
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 2
Bảng 3.5. Kết quả thử HTKS sau ĐBHH

Bảng 3.6. Kết quả chọn môi trường lên men
Bảng 3.7. Kết quả lên men chìm các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt
Bảng 3.8. Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.9. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.10. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng 3.12. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 3
Bảng 3.13. Khối lượng kháng sinh tinh khiết và hiệu suất tinh chế
Bảng 3.14. Các đỉnh hấp thụ và nhóm chức đặc trưng của KS2
Bảng 3.15. Bảng so sánh đặc trưng phổ NMR của KS2 với nhóm phenoxazone
Bảng 3.16. Bảng so sánh các đặc điểm phổ NMR của chất KS2 và actinomycin D
Bảng 3.17. Các đỉnh hấp thụ và nhóm chức đặc trưng của KS1
Bảng PB.1. Kết quả thử HTKS sau SLNN
Bảng PB.2. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 1
Bảng PB.3. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 2
Bảng PB.4. Kết quả thử HTKS sau ĐBHH


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của actinomycin D.
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của actinomycin X2.
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của actinomycin F4.
Hình PH.1. Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Hình PH.2. Hình ảnh xạ khuẩn cấy zigzac trên đĩa Petri và khuẩn lạc sau ĐBUV1.
Hình PH.3. Thử HTKS bằng 3 phương pháp: khối thạch, giếng thạch, khoanh giấy lọc.
Hình PH.4. Bình chứa dịch lên men.
Hình PH.5. Hình ảnh chạy sắc ký cột và bản mỏng sau chạy SKLM (lần 1).
Hình PH.6. Hiện hình bằng VK.
Hình PH.7. Kháng sinh 2 sau kết tinh lại.
Hình PH.8. Hình ảnh kháng sinh 1, kháng sinh 2, kháng sinh 3 tinh khiết (theo thứ tự).
Hình PH.9. Phổ tử ngoại của kháng sinh 1.

Hình PH.10. Phổ tử ngoại của kháng sinh 2.
Hình PH.11. Phổ tử ngoại của kháng sinh 3.
Hình PH.12. Phổ hồng ngoại của kháng sinh 1.
Hình PH.13. Phổ hồng ngoại của kháng sinh 2.
Hình PH.14. Phổ khối lượng của kháng sinh 1.
Hình PH.15. Phổ khối lượng của kháng sinh 2.
Hình PH.16. Phổ khối lượng của kháng sinh 3.
Hình PH.17. Phổ cộng hưởng từ của kháng sinh 2.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc kháng sinh đã được nghiên cứu và sử dụng trong gần 90 năm qua để điều
trị cho những bệnh nhân mắc các bệnh truyền nhiễm. Từ những năm 1940, những loại
thuốc này đã làm giảm đáng kể bệnh tật và tử vong do những bệnh nhân có cơ hội
sống thấp. Tuy nhiên, thuốc kháng sinh đang được sử dụng rộng rãi và khó kiểm soát ở
nhiều nước đang phát triển, cùng với sự gia tăng đề kháng của vi khuẩn theo cơ chế
mới là mối đe dọa lớn tới việc điều trị các bệnh truyền nhiễm thông thường, dẫn đến
bệnh tật kéo dài, tàn tật và tử vong. Nếu không có kháng sinh hiệu quả để phòng ngừa
và điều trị nhiễm trùng, các thủ thuật y tế như cấy ghép nội tạng, hóa trị ung thư, quản
lý bệnh tiểu đường và những phẫu thuật lớn trở nên rất nguy hiểm. Do vậy, vấn đề
khám phá và nghiên cứu kháng sinh mới đang ngày càng được coi trọng hơn trước sự
gia tăng đề kháng của vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh.
Trong số tất cả các chất kháng sinh được sản xuất, chi Streptomyces chứa khá
nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học và góp phần sản xuất khoảng hai phần ba số thuốc
kháng sinh trên thị trường[31]. Khám phá chi Streptomyces đã và đang thu hút sự chú
ý của các nhà nghiên cứu cho việc tìm ra và phân lập các chủng xạ khuẩn mới có hoạt
tính kháng khuẩn cao.
Trước tình trạng đa kháng thuốc hiện hành, cùng với việc nhận ra vai trò quan
trọng của việc sản xuất kháng sinh mới, tôi quyết định tiến hành đề tài:
“Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.225” với các mục tiêu sau:

1. Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng
sinh của chủng giống Streptomyces 184.225.
2. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh.
3. Chiết xuất và tinh chế kháng sinh.
4. Xác định sơ bộ một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được.

1


CHƯƠNG 1:
1.1.

TỔNG QUAN

Đại cương về kháng sinh

1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những chất chuyển hóa vi sinh vật hay chất tương đồng bán tổng
hợp, tổng hợp; hoặc chất tổng hợp không liên quan đến những chất thiên nhiên, ở liều
nhỏ các chất này ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc sự phát triển và sống sót của vi sinh
vật mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật.[2-4,
17, 19]
1.1.2. Phân loại
Các kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học, từ đó chúng có chung
một cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn tương tự.
Một số họ (hoặc nhóm) kháng sinh chính:
- Nhóm  lactam (các penicillin và các cephalosporin)
- Nhóm aminosid hay aminoglycoside: Streptomycin, gentamicin,…
- Nhóm phenicol: chloramphenicol
- Nhóm tetracyclin: Tetracyclin, doxycyclin

- Nhóm macrolid và lincosamid: Erythromycin, clarithromycin,…
- Nhóm quinolone: Ciprofloxacin, ofloxacin,…
- Nhóm 5 – nitro – imidazol: Metronidazol,…
- Nhóm sulfonamid
- Nhóm peptid: Vancomycin, polymycin,…[2, 16, 19]
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Có 5 cơ chế chính: [3, 16, 19] (Hình PH.1)
- Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: -lactam, vancomycin,..
- Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: polyen, amphotericin,…
- Ức chế tổng hợp ADN của vi khuẩn: actinomycin, antracyclin,…
- Ức chế chuyển hóa: Trimethoprim, Sulfonamid,…
- Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: macrolid,…
1.1.4. Vấn đề đề kháng kháng sinh
Có 2 kiểu kháng thuốc của vi sinh vật: kháng thuốc tự nhiên và kháng mắc
phải.[3, 24]

2


- Vi khuẩn đã có tính kháng từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh, như sản xuất
 lactamase, cấu trúc của thành vi khuẩn không thấm với kháng sinh, dạng này gọi là
kháng thuốc tự nhiên.
- Kháng mắc phải: vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh, sau một thời gian
tiếp xúc, trở thành không nhạy cảm nữa, do đột biến nhiễm sắc thể hoặc kháng qua
plasmid. Loại kháng mắc phải thường là do dùng kháng sinh không đúng liều hoặc
lạm dụng thuốc, đang gây một trở ngại rất lớn cho việc điều trị.[16]
Theo WHO, trong năm 2016, có 490.000 người đã phát triển bệnh lao kháng đa
thuốc trên toàn cầu và kháng thuốc đang bắt đầu làm phức tạp cuộc chiến chống HIV
và sốt rét.
Kháng kháng sinh là một vấn đề phức tạp ảnh hưởng đến tất cả xã hội và được

thúc đẩy bởi nhiều yếu tố kết nối. Chính vì vậy, cần có sự đổi mới và đầu tư lớn hơn
trong nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng khuẩn mới, vắc-xin và các công cụ
chẩn đoán.[26]
1.2.

Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự

nhiên, là các vi khuẩn G (+), có tỷ lệ G + C > 55%.
Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân
nhánh. Trong số hơn 15.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 66%
là do xạ khuẩn tạo ra.[3, 5]
1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces
Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Tập
hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn lạc xạ
khuẩn khá đặc biệt, không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô
ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que
cấy không di chuyển được khuẩn lạc.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,2 – 1,0µm đến 2 –
3µm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc
khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: màu da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng,
xám,…
Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì dài ra trong không
khí thành những khuẩn ty khí sinh.
3


Đối với xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ
xuất hiện chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái
cơ bản như: thẳng, uốn cong, móc câu – đơn hoặc kép, và xoắn lò xo. Bào tử trần

(conidiospore) của họ xạ khuẩn này có các hình dạng: hình cầu, hình ellipsoid – bầu
dục, hình que, hình trụ,… là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn này. Bề mặt
bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông, … [1, 3, 5, 8, 13, 15]
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Cấu tạo tế bào xạ khuẩn chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào
chất. Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia làm 4 nhóm,
trong đó xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I, có chứa L–DAP (Ldiaminopimelic acid) và glycin. [3]
1.2.3. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn
Có khá nhiều khóa phân loại được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển như:
khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Krassilnhikov (Nga), khóa phân loại
của Gauze,…
Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế do
Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) đã được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các
đặc trưng được sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố
melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử và khả năng tiêu thụ
các nguồn hydratcarbon. [3]
1.2.4. Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy
phân các hợp chất như gelatin, casein, chúng có thể khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích 22 – 32°C, pH
tối thích 6,8 – 7,5. Streptomyces có khả năng sinh nhiều loại sắc tố khác nhau: sắc tố
hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.[2,
3, 5, 9, 23]
1.2.5. Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225
Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 184.225 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
4

Chủng xạ khuẩn phát triển tốt trên môi trường MT2.
Trong khóa luận của Ngô Thanh Huyền thực hiện năm 2015, tác giả tiến hành
nuôi cấy xạ khuẩn trên MT ISP2 sau 14 ngày cho kết quả hình ảnh chuỗi bào tử và bề
mặt bào tử xạ khuẩn Streptomyces 184.225: khuẩn ty khí sinh có màu vàng, có sắc tố
hòa tan, chuỗi bào tử thẳng hơi cong, bề mặt bào tử nhẵn.[11]
Trong khóa luận của Trần Thị Huế thực hiện năm 2016, tác giả lựa chọn dung
môi chiết xuất là Ethylacetat tại pH = 7. Sau quá trình tinh chế, kết tinh thu được 3
kháng sinh tinh khiết, trong đó KS1 là chất chính. Bước đầu sơ bộ xác định cấu trúc
các kháng sinh: KS1 dự kiến là actinomycin X2, KS2 dự kiến là actinomycin D.[9]
1.3.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1. Mục đích
Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có hoạt
tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi
phải cải tạo giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy
thích hợp nhằm: [4, 12]
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên
men, tạo ít bọt hơn.
- Chỉ sinh tổng hợp một sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới.
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20 – 30% những cá thể khác. Cần chọn
lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp để tiến hành nghiên cứu
ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất.[2, 4, 12]
1.3.3. Đột biến cải tạo giống

Cho các VSV chịu tác động của các tác nhân gây đột biến mạnh như tác nhân
hóa học: dimethylsulphat, ethylenimin, HNO2, … tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia
X,… phần lớn các VSV bị giết chết. Trong số các cá thể sống sót xuất hiện nhiều dạng
đột biến do thay đổi nhiễm sắc thể làm thay đổi tính trạng dẫn đến làm mất (giảm) khả
năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh kháng sinh (đột biến
dương tính).
5


Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu
tính và dung hợp tế bào trần.[2, 5, 22]
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị
biến đổi và không bị nhiễm tạp bởi các VSV lạ.
Các phương pháp bảo quản chủng VSV: bảo quản trong tủ lạnh 2 – 4°C (định
kỳ cấy truyền trong môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm
khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi
đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản
được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).
Trong phòng thí nghiệm để giữ giống xạ khuẩn thường nuôi cấy xạ khuẩn trên
môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2°C và định
kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.[1, 4, 17]
1.4.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là sự chuyển hóa carbonhydrat và một vài hợp chất hữu cơ khác thành
những chất mới dưới tác dụng của enzym do VSV gây ra, mục đích chính là chuyển

hóa cơ chất trong môi trường dinh dưỡng thành các sản phẩm cần thiết nhờ VSV.[15]
1.4.2. Phương pháp lên men
Có 2 phương pháp lên men nuôi cấy vi sinh vật:
 Phương pháp lên men bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt dựa trên cơ sở nuôi cấy mốc trên các lớp môi
trường mỏng tiếp xúc tốt với không khí.
- Ưu điểm: tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối môi trường, tốn ít điện năng,
dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, điều kiện vô trùng không cần tuyệt đối.
- Nhược điểm: khó cơ giới hóa, tự động hóa do đó năng suất thấp, tốn nhiều lao
động thủ công, cần diện tích nuôi lớn.[2, 15, 17]
 Phương pháp lên men chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong các bình lên men với môi trường lỏng vô
khuẩn, khuấy cùng cấp khí vô trùng liên tục. Môi trường lỏng bao gồm các nguồn
carbon, nguồn nitơ vô cơ, hoặc nitơ hữu cơ, các chất khoáng, các chất sinh trưởng.
6


- Ưu điểm:
+ Tiết kiệm diện tích sản xuất.
+ Dễ cơ giới hóa, loại bỏ được lao động thủ công, tạo năng suất cao.
+ Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường, tránh được sự lãng phí
chất dinh dưỡng nằm lại trong khối môi trường rắn mà VSV không sử dụng được.
+ Đảm bảo được điều kiện vệ sinh và vô trùng.
- Nhược điểm: giá thành cao, tốn điện năng do cần sục khí liên tục, dễ xảy ra sự
nhiễm trùng toàn bộ khối môi trường.
- Có 4 kiểu lên men chìm: lên men mẻ (lên men có chu kỳ), lên men có bổ sung,
lên men liên tục, lên men bán liên tục.[2, 15, 17]
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp
của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc tác

dụng gián tiếp.
- Nhiệt độ: Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng mà còn
ảnh hưởng đến kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất và nhu cầu dinh dưỡng của VSV.
Nhiệt độ thấp, VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao VSV bị biến tính protein và
kể cả ARN. Thiết bị lên men cần có bộ phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ
sinh trưởng tối thích cho VSV.
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy đáp ứng tốc độ sử
dụng oxy của VSV.
Trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình
lên men để tìm điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tổng hợp chất mong
muốn.[4, 9, 12]
1.5.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Các chủng sau khi được lên men làm tăng tốc độ tích tụ sản phẩm hay định

hướng tổng hợp ra những kháng sinh khác nhau cần phải có phương pháp chiết tách và
tinh chế thích hợp để tạo ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao, chất lượng theo yêu cầu
và hạ giá thành sản phẩm. Do vậy, có thể ứng dụng một số phương pháp để chiết tách
kháng sinh như:

7


- Phương pháp chiết: được ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách,
phân ly làm giàu các chất, đặc biệt cần tách một lượng nhỏ hoạt chất ra khỏi một lượng
lớn các chất khác.[14]
- Phương pháp sắc ký: được tiến hành để tách phân ly, phân tích nhiều hợp chất
khác nhau, vô cơ cũng như hữu cơ.[14]

1.5.1. Phương pháp chiết xuất
Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa
tan trong một pha lỏng (thường là nước) vào một pha lỏng khác không hòa lẫn với nó
(thường là dung môi hữu cơ).[14]
Một số phương pháp chiết:
 Chiết lỏng – lỏng
- Chiết đơn (chiết một lần): Trong phòng thí nghiệm thường tiến hành chiết
trong những bình gạn, lắc bằng tay hay máy lắc.
- Chiết lặp (chiết nhiều lần): Sau khi chiết một lần, trong dung dịch còn lại một
lượng chất tan đáng kể thì thường người ta thêm một lượng dung môi chiết mới và
chiết tiếp một hay nhiều lần nữa.
- Chiết ngược dòng: phương pháp này dựa trên nguyên tắc cho dung môi chiết
và dung dịch cần chiết chạy ngược chiều nhau. Đây là một quá trình chiết liên tục.
Trong chiết lỏng – lỏng, người ta thường dùng một pha nước và một pha dung
môi hữu cơ. Có thể dùng DMHC để chiết nhiều chất dưới dạng phân tử bình thường,
các phân tử phức chelat kim loại và các cặp ion của nhiều ion hữu cơ.
 Chiết lỏng – rắn: Dùng pha lỏng để chiết lấy các mẫu là pha rắn.
 Chiết pha rắn: Là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau
đó rửa giải bằng dung môi thích hợp. [10]
1.5.2. Các phương pháp tinh chế
Phương pháp sắc ký: là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào
sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh.[14]
Nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký là sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp
phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh.[14]
Một số phương pháp sắc ký thường dùng:

8


1.5.2.1.

Sắc ký lớp mỏng

 Nguyên tắc: tách hỗn hợp các chất thành những phần riêng rẽ khi cho pha động
di chuyển qua pha tĩnh.
Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc
phân tử hay phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế phụ thuộc vào tính chất của chất làm
pha tĩnh và dung môi pha động. Trong SKLM, cơ chế hấp phụ chiếm ưu thế nhất.
Pha tĩnh: thường sử dụng là silicagel, nhôm oxit, xenlulozơ, nhựa trao đổi
ion,… có chiều dày khoảng 0,2 – 0,5mm.
Pha động: sử dụng các dung môi là các chất lỏng, đây là hệ sắc ký lỏng – rắn.
 Ưu điểm:
- Các dụng cụ và thiết bị đơn giản.
- Thời gian phân tích nhanh, việc tách các cấu tử có thể tiến hành dễ dàng.
- Có thể tổ hợp với 1 phương pháp phân tích công cụ làm tăng độ nhạy, độ chọn
lọc của phương pháp.
 Ứng dụng:
- Tách và phân tích các chất hữu cơ: các chất kháng sinh, vitamin, dược phẩm,
thực phẩm và độc chất, …
- Tách và phân tích các ion vô cơ: cation kim loại kiềm, kiềm thổ, một số kim
loại khác, …[7, 10, 14]
1.5.2.2.

Sắc ký cột

Nguyên tắc: Mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ (thường là
silicagel, nhôm oxyd). Dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột (pha
tĩnh) sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử có độ phân cực khác nhau
nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải
hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau.[10]

1.6.

Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

1.6.1. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS)
Phổ hấp thụ UV-VIS do sự tương tác của các electron hóa trị ở trong phân tử,
nhóm phân tử của chất với chùm tia sáng kích thích thích hợp (chùm có năng lượng
trong vùng UV-VIS) tạo ra. Nó là phổ của tổ hợp sự chuyển mức năng lượng của các
electron hóa trị trong liên kết σ, π và đôi electron n, cùng với sự quay và dao động của
phân tử.
9


Phổ này chủ yếu nằm trong vùng sóng 190-900 nm, nên được gọi chung là phổ
hấp thụ UV-VIS.
Ứng dụng: Phương pháp UV-VIS có độ nhạy, độ chính xác và độ chọn lọc cao,
dùng để xác định nhanh, thuận lợi, thiết bị đơn giản và dễ dàng tự động hóa, vì vậy
được dùng rộng rãi để nghiên cứu khoa học và phân tích tại các nhà máy. [7, 10]
1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR là tập hợp các vạch phổ biểu diễn sự phụ thuộc độ truyền quang T% vào
số sóng 𝜈̅ : T = f(𝜈̅ ).
Trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất hữu cơ thường chỉ sử dụng vùng phổ có
số sóng từ 4000 đến 400 cm-1. [6]
Do sự phức tạp về các kiểu dao động của nguyên tử trong phân tử nên phổ hấp
thụ IR ghi nhận được là những đám vạch rất phức tạp về hình dạng. Khi phân tích phổ
IR người ta thường phân phổ IR thành 3 vùng: vùng nhóm chức, vùng “dấu vân tay”
và vùng nhân thơm. Vùng có số sóng 1300 – 910 cm-1 rất phức tạp, tuy nhiên rất đặc
trưng cho từng phân tử nên được gọi là vùng “dấu vân tay”.
Ứng dụng: Phổ IR được ứng dụng rộng rãi trong định tính các chất tinh khiết,
có thể dùng để định lượng một số chất chọn lọc. [7, 10]

1.6.3. Phổ khối lượng (MS)
Máy phân tích khối phổ (Mass Spectrometry, MS) dựa trên sự đo lường trực
tiếp tỷ lệ khối lượng theo thế điện tích (ký hiệu là m/z) của những ion trong pha khí
của chất phân tích.
Những ion của chất phân tích – được sinh ra từ nguồn ion của máy – được gia
tốc và rồi tách ra bởi bộ phận phân tích trước khi đến bộ phận phát hiện. Tất cả quá
trình này xảy ra trong một buồng có hệ thống bơm chân không sâu, đạt từ 10-3 đến 10-6
Pa.
Khối phổ đồ thu được chỉ ra sự tương quan giữa số lượng các ion có giá trị m/z
theo giá trị m/z. Vì đa số các ion đều mang điện tích dương +1 nên tỷ lệ m/z tương
đương với m (do đó thường gọi là khối phổ). m tính theo đvC hay theo đơn vị daltons
(Da).
Thông tin từ khối phổ đồ cho phép định tính (dựa vào khối lượng phân tử, cấu
trúc phân mảnh) và định lượng mẫu phân tích.[10]

10


1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là phương pháp vật lý phổ biến và quan
trọng được ứng dụng trong hóa học. Một số phổ cộng hưởng từ phổ biến:
- Phổ 1H: cho biết các tín hiệu 1H có trong mẫu phân tích.
- Phổ 13C-NMR: cho biết các tín hiệu 13C có trong mẫu phân tích. Phổ này cho
nhiều thông tin cấu tạo phân tử hơn phổ 1H-NMR.
- Phổ DEPT: trong phổ này tín hiệu của nhóm CH3 và CH nằm ở phía trên còn
tín hiệu của nhóm CH2 quay xuống phía dưới, nguyên tử C bậc 4 không cho tín hiệu
trên phổ.
- Phổ COSY: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều COSY hay HHCOSY chỉ ra
sự tương tác của các proton ở hai nguyên tử C cạnh nhau.
- Phổ HSQC thể hiện mối liên quan giữa tín hiệu của proton 1H trên một trục

với tín hiệu của nguyên tử 13C trên trục khác.
- Phổ HMBC thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở một nguyên tử 13C
với tín hiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2, 3 liên kết do đó có tên là tương tác
xa, khác với phổ HMQC.[20] [25]
1.7.

Các nghiên cứu liên quan

1.7.1. Nghiên cứu về chủng Streptomyces flavogriseus NJ-4 – chủng mới cho sản
xuất actimomycin D và holomycin (2017)
Các chủng xạ khuẩn NJ-4 phân lập từ đất của Đại học Nông nghiệp Nam Kinh
được xác định là S. flavogriseus. Loài S. flavogriseus này được tìm thấy lần đầu tiên để
sản xuất hai hợp chất kháng khuẩn được xác định là actinomycin D và holomycin.
Hai hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn được tách ra từ dịch chiết thô kháng
khuẩn của Sephadex LH-20. Hợp chất đầu tiên với hoạt tính kháng khuẩn được phân
lập dưới dạng bột màu đỏ cam và được tinh chế thêm bằng HPLC với thời gian lưu
HPLC là 14,8 phút. Thành phần đầu tiên với hoạt tính kháng khuẩn có phổ UV-VIS
điển hình trong methanol với đỉnh hấp thụ cực đại ở 241 nm và 443 nm, tương tự như
actinomycin D. Phổ IR (KBr) cho biết có nhóm –C=O (1746.23 cm-1 và 1646.91 cm-1)
và –NH (3445.21 cm-1 và 3273.57 cm-1). Có các dải ở 2874,38 cm-1 và 2965,02 cm-1
tương ứng với C-H đối xứng và không đối xứng của nhóm –CH2. Phổ khối ESI-MS
của hợp chất đầu tiên với hoạt tính kháng khuẩn cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân

11


tử ở m/z 1255,22 [M + H]+ và 1277,38 [M + Na]+, trùng với kết quả quan sát được của
actinomycin D.
Actinomycin D thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ chống lại tất cả các
chủng B. pumilus, S. aureus, Escherichia coli, F. moniliforme, F. graminearum và A.

niger. Holomycin thể hiện các hoạt động đối kháng mạnh mẽ chống lại B. pumilus, S.
aureus và E. coli và có hoạt tính kháng nấm chống lại F. moniliforme và F.
graminearum nhưng không có hoạt tính kháng nấm chống lại A. niger. Holomycin
biểu hiện hoạt tính độc tế bào đối với A549 tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư dạ dày
BGC823 và tế bào ung thư biểu mô gan HepG2. Năng suất của actinomycin D từ S.
flavogriseus NJ-4 là 960 mg/l.
Nghiên cứu này chỉ ra rằng S. flavogriseus NJ-4 thể hiện một khả năng riêng
biệt và có tiềm năng công nghiệp để sản xuất ra một lượng lớn actinomycin D trong
điều kiện không được tối ưu hóa. [30]
1.7.2. Hợp chất nhóm actinomycin mới từ chủng Streptomyces sp. RAB12 - tiềm
năng kháng khuẩn cao (2018)
Streptomyces sp. RAB12 có tiềm năng tạo ra các hợp chất nhóm actinomycin
mới được phân lập từ các mẫu đất được thu thập từ CSIR - Viện Công nghệ hóa học
Ấn Độ, Hyderabad, Ấn Độ. Chiết xuất tế bào của dòng chủng mới này tìm ra hai chất
có hoạt tính sinh học, RSP 01 và RSP 02.
Phân tích phổ khối phân giải cao (HR-MS) cho pic ion phân tử [M – H]+ với
m/z của 2 chất lần lượt là 1269.6156 và 1271.6313 g/mol. Phân tích phổ proton 1H, 13C
NMR, phổ NMR 2 chiều và phổ khối cho thấy “dấu vân tay” tương tự với actinomycin
D đó ngoại trừ một đỉnh ở δH3.59 J (1H NMR) và δ 208.88 (13C NMR) của hợp chất
RSP 01 chứng tỏ sự có mặt của nhóm -C=O ở vị trí 5-oxo trên phần prolin vắng mặt
trong actinomycin D. Tinh sạch RSP 02 mô tả sự giống nhau với RSP 01 ngoại trừ một
đỉnh trong NMR proton 1H ở phổ δH 3.81 J . Từ đó tìm ra các công thức phân tử cho
RSP 01 và RSP 02 là C62H84N12O17 và C62H86N12O17, tương ứng. Hai hợp chất phân
lập được (RSP 01 và RSP 02) xuất hiện dưới dạng bột vô định hình màu cam, có nhiệt
độ nóng chảy lần lượt là 244°C và 280°C.
Hai chất này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chống lại các chủng vi khuẩn
(Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Salmonella
typhi và Bacillus subtilis) và Candida albicans so với actinomycin D. MIC và MBC
12

chuẩn cho RSP 01 quan sát được là 0,0039 và 0,0078 ( μg/ml) đối với C. albicans,
trong khi với actinomycin D là 0,031 và 0,62 (μg/ml), hiệu lực cao hơn gấp mười lần.
Năng suất lên men của actinomycin RSP 01 mới từ chủng Streptomyces sp. RAB12 là
200 mg/10 L, của RSP 02 là 127 mg/10 L trong khi tài liệu báo cáo chủng
Streptomyces padanus JAU4234, chỉ sản xuất 800 mg/200 L.
Do đó, các tác giả kết luận rằng chủng phân lập hiện tại có tiềm năng lớn cho
sản xuất quy mô công nghiệp của actinomycin RSP 01 mới, ngăn ngừa nhiễm khuẩn
và nấm hiệu quả so với thị trường hiện có actinomycin D.[31]

13


CHƯƠNG 2:
2.1.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu
- Chủng xạ khuẩn: Chủng giống xạ khuẩn Streptomyces 184.225 có HTKS

mạnh nhất được lưu giữ lại sau đề tài nghiên cứu năm 2016 do Bộ môn Vi sinh và
Sinh học cung cấp.
2.2.

Nguyên vật liệu và thiết bị

2.2.1. Nguyên vật liệu
 Giống VK kiểm định: chủng giống VK do bộ môn Vi sinh – Sinh học trường
Đại học Dược Hà Nội cung cấp. (Bảng 2.1)

Bảng 2.1. Tên các vi khuẩn kiểm định
Đặc trưng

Tên VK kiểm định

Tên viết tắt

VK Gram (+)

Bacillus subtilis ATCC 10241

B. subtilis

VK Gram (-)

Proteus mirabilis BV 108

P. mirabilis

 Môi trường nuôi cấy VK kiểm định: Bảng 2.2
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy VK kiểm định
NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước

(g)

(g)

(g)

(g)

(ml)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

0

100 (vđ)

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,6 – 1,8

100 (vđ)

Thành phần
Môi trường

pH
7,0 – 7,5

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: Bảng 2.3
Bảng 2.3. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)
Thành phần

MT2

MT5

MT6

Tinh bột

2

2,4

2

Bột đậu tương

1,5

Pepton

0,3

Cao thịt

0,3

KCl

0,05

NaNO3

0,2

NH4NO3

0,4

CaCO3

0,2
14


K2HPO4

0,1

MgSO4.7H2O

0,05

NaCl

0,1

Thạch

2

2

2

Nước

100

100

100

pH

6,8 – 7,2

7,0 – 7,2

7,0 – 7,2

 Các môi trường dịch thể (MTdt) sử dụng để lên men chìm: Thành phần tương
ứng như MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
 Dung môi sử dụng: Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Dung môi sử dụng
Dung môi

Xuất xứ

Khối lượng riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (°C)

Aceton

Trung Quốc

0,79

56

Butylacetat

Trung Quốc

0,880 – 0,885

117 – 118

n-Hexan

Merck - Đức

0,6548

69

Ethanol

Việt Nam

0,789 – 0,791

78,3

Ethylacetat

Merck - Đức

0,902

70,4

Methanol

Trung Quốc

0,791 – 0,793

64,5

Triethylamin

Trung Quốc

0,726 – 0,728

89,5

 Hóa chất đã sử dụng: Bảng 2.5.
Bảng 2.5. Các hóa chất sử dụng
Hóa chất

Xuất xứ

Đóng gói

Hóa chất

Xuất xứ

Đóng gói

Tinh bột

Việt Nam

Túi 1kg

NaNO3

Trung Quốc

Lọ 500g

Glucose

Trung Quốc

Lọ 500g

NH4NO3

Trung Quốc

Lọ 500g

Bột đậu tương

Việt Nam

Lọ 500g

CaCO3

Trung Quốc

Lọ 500g

Lactose

Trung Quốc

Lọ 500g

K2HPO4

Trung Quốc

Lọ 500g

Saccarose

Việt Nam

Lọ 500g

MgSO4.7H2O

Nga

Lọ 500g

Bột ngô

Việt Nam

Lọ 500g

NaCl

Trung Quốc

Lọ 500g

Bột mỳ

Việt Nam

Lọ 500g

Thạch

Việt Nam

Gói 50g

Pepton

Trung Quốc

Lọ 500g

NaOH

Trung Quốc

Lọ 500g

15


Cao thịt

Đức

Lọ 500g

HCl 35,5%

Trung Quốc

Lọ 500 ml

KCl

Trung Quốc

Lọ 500g

NaNO2

Trung Quốc

Lọ 500g

2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ
-

Đèn UV (λ = 254 nm), nguồn phát Toshiba 15W, điện thế 220V.

-

Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030.

-

Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121S.

-

Tủ ấm Menmert, Binder, Trung Quốc. Tủ lạnh Deawoo, Sanyo.

-

Tủ cấy vô trùng Aura VF 48, tủ sấy SL Shellab.

-

Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf.

-

Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt, máy đo UV – VIS Hitachi U-1900, máy
đo phổ MS-Xevo TQMS, máy đo phổ IR Impact 410-NicoLet-USA.

-

Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm.

-

Đĩa Petri, ống nghiệm, patuyn, kim mũi mác, pipet, bình nón, cốc có mỏ, que
cấy, que chang, đèn cồn, đũa thủy tinh, ống đục thạch, giấy lọc, giấy thử pH,
bông, buret, …

2.3.

Nội dung nghiên cứu

2.3.1. Chọn lọc, cải tạo giống
-

Sàng lọc ngẫu nhiên lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất.

-

Đột biến bằng ánh sáng UV, tác nhân hóa học HNO2 để nâng cao HTKS của
Streptomyces 184.225.

2.3.2. Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh
-

Chọn MT lên men chìm tốt nhất từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất.

-

Từ các dạng chủng và biến chủng thu được qua các lần đột biến, lựa chọn dạng
chủng, biến chủng có khả năng lên men chìm cho kháng sinh mạnh nhất. Tiến
hành lên men chìm tổng hợp kháng sinh.

2.3.3. Chiết tách và tinh chế kháng sinh
-

Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ bằng sắc ký cột và sắc
ký lớp mỏng.

2.3.4. Xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được
-

Đặc điểm vật lý: Màu sắc, hình dạng bột kháng sinh, nhiệt độ nóng chảy.

-

Đo phổ IR, phổ UV-VIS, phổ MS, phổ NMR.
16