Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời vitamin a và vitamin e trong sữa bằng kỹ thuật HPLC

B ộ• GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
•
•

B ộ Y TÉ•

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
•

___

•

•

•

CAO CÔNG KHÁNH

NGHIÊN CỨU XÂY D ựN G QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
ĐÔNG THỜI VITAMIN A VÀ VITAMIN E
TRONG SỮA BẰNG KỸ THUẬT HPLC

LUẬN
VĂN THẠC
SỸ Dược
HỌC
•
•
•

•

HÀ NỘI - 2010

ỉtll

»'■■. ............—— ................... — s s b b s

s s b êbêêêb b s b êêM


B ộ YTÉ

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
•

•

•

TRƯỜNG ĐẠI HỌC
•

•

Dược HÀ NỘI
•

•

CAO CÔNG KHÁNH

NGHIÊN CỨU XÂY Dự NG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
ĐỒNG THỜI VITAMIN A VÀ VITAMIN E
TRONG Sữ A BẰNG KỸ THUẬT HPLC
•

LUẬN VĂN THẠC SỸ D ư ợ c HỌC
•

•

•

•

CHUYÊN NGÀNH: KIể M NGHIỆM THUỐC VÀ

Độc CHẤT

MÃ SỐ: 62 73 15 01

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Tường Vy
TR Ư Ơ N G ĐH ĐƯ ỢC HÀ N Ộ I

T H U ' V ỈỆ SM

HÀ N Ộ I-2 0 1 0

N gày........ th án g ..........’năm 20 .......í

SỐ3KCB:
........................... .......
Ịi
i

— ...........................

* “ ............ ....................................................


LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình của các
thầy cô, sự eiúp đỡ của các anh chị, gia đình và đồng nghiệp.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- TS. Nguvễn Tường Vy - Phòng sau đại học, Trường đại học Dược Hà Nội
người đã trực tiếp hướng dẫn chu đáo, nhiệt tình để tôi có được kết quả này. Xin
gửi tới Cô aiáo lời cảm ơn chân thành nhất.
Xin trân trọng cảm 077/
- Đảng uỷ, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học Trường đại học Dược Hà Nội.
- Thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa Phân tích đã dạy dỗ và
truyền đạt kiến thức cho tôi trong những năm tháng học tập tại trường.
Xin gửi lời cảm 07ĩ chân thành tới:
- Lãnh đạo Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phâm quốc gia đã tạo điều kiện
cho tôi học tập nâng cao kiến thức
- Labo Hóa độc thực phẩm - Viện KNATVSTPQG đã luôn giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện luận văn này.
Xim cảm ơn Cha mẹ, bạn bè, đồng nghiệp và những người thân đã dành tình cảm, sự
độnR viên khích lệ trong thời gian qua.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2010

Cao Công Khánh


MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Đặt vấn đề.......................................................................................................................... 1
Chương 1: Tổng quan....................................................................................................... 3
1.1. Đại cưong về vitamin A và vitamin E........................................................................ 3
1.1.1. Đặc điểm lý hóa............................................................................................................ 3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của vitamin A và vitamin E ......................................................... 5
1.2. Các phưong pháp xác định vitamin A và vitamin E trong sữa........................... 7
1.2.1. Tách chiết hai vitamin A và E ra khỏi mẫu thử.........................................................7
1.2.2. Các kỹ thuật định lượng vitamin Avàvitamin E ..................................................... 11
1.2.3. Phương pháp xác định đồng thời hai vitamin A và vitamin E bằng HPLC........... 13
Chưong 2: Đối tượng, nội dung, và phương pháp nghiên cứu.......................... 16
2.1. Đối tuọng nghiên cứu..................................................................................................16
2.1.1. Các loại sữa:................................................................................................................ 16
2.1.2. Cách lấy mẫu:..............................................................................................................16
2.2. Phưoug tiện nghiên cứu............................................................................................ 17
2.2.1. Thiết bị phân tích:....................................................................................................... 17
2.2.2. Dụng cụ phân tích....................................................................................................... 17
2.2.3. Hóa chất, thuốc thử.....................................................................................................18

2.3. Nội dung nghiên c ứ u .................................................................................................18
2.3.1. Xây dựng quy trình xác định đồng thời vitamin A và E trong sữa bằng HPLC.. 18
2.3.2. Thấm định quy trình đã xây dựng..............................................................................19
2.3.3. ứ n g dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng trong kiểm nghiệm thực phẩm............19


2.4. Phương pháp nghiên cứu:..........................................................................................19
2.5.. Phưong pháp xử lý số liệu.........................................................................................19
Chương 3: Kết quả nghiên cứ u....................................................................................21
3.1. Quy trình xác định đồng thòi vitamin A và E trong sữa bằng H P L C ..............21
3.1.1. Lựa chọn van bơm mẫu:............................................................................................ 21
3.1.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện...................................................................................21
3.1.3. Lựa chọn cột sẳc ký................................................................................................... 22
3.1.4. Lựa chọn thành phần pha động................................................................................. 22
3.1.5. Lựa chọn nhiệt độ buồng cột.....................................................................................23
3.1.6. Lựa chọn tốc độ pha động......................................................................................... 24
3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu.......................................................................... 25
3.2.1. Lựa chọn dung môi chiết........................................................................................... 25
3.2.2. Khảo sát thời gian thủy phân m ẫ u ........................................................................... 26
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ thủy phân mẫu..............................................................................26
3.2.4. Khảo sát nồng độ KOH trong ethanol...................................................................... 27
3.3. Thẩm định quy trình đã xây dựng........................................................................ 30
3.3.1. Độ chọn lọc.................................................................................................................30
3.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính:......................................................................................30
3.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng:............................................................. 36
3.3.4. Tính thích hợp của hệ thống:.....................................................................................37
3.3.5. Độ lặp lại của phương pháp.......................................................................................38
3.3.6. Độ đúng, độ thu hồi của phương pháp..................................................................... 39
3.3.7. Độ bền vững/on định của phương pháp................................................................... 42
3.4. ứng dụng quy trình đã xây dựng trong phân tích một số mẫu sữ a ............... 43

3.4.1. Kết quả phân tích mẫu thực t ế : .................................................................................43
3.4.2. Kết quả thử nshiệm liên phòng:............................................................................... 48
Chưong 4: Bàn luận.........................................................................................................51


4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật....................................................................................51
4.1.1. Các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC....................................................51
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu:...............................................................................................51
4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng........................................................................ 52
K ết luận và kiến n g h ị:.................................................................................................. 55
Tài liệu tham khảo..........................................................................................................57
Phụ lục............................................................................................................................... 60


AOAC :

(Association of Official Analytical Chemists)
Hiệp hội các nhà hóa học phân tích.

BHA :

(Butylate HydroxyAnisole) - chất chống oxy hóa

BHT :

(Butylate HydroxyToluene) - chất chống oxy hóa

CA, Ce : Nồng độ vitamin A, vitamin E
FSV :

(Fat Soluble Vitamins) - các vitamin tan trong dau

GLC:

(Gas Liquid Chromatography) - sac ký khí lỏng.

m A- m E : hàm lượng trung bình của vitamin A, vitamin E
HPLC :

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IU :

(International Units) - đơn vị quốc tế

LOD :

(Limit of detection) - giới hạn phát hiện

LOQ :

(Limit of Quantitation) - giới hạn định lượng

mg% :

mg/100g

PA :

(Pure Analysis) - tinh khiết phân tích

PDA :

(Photo Diode Array) - mảng diod quang

ppm :

(part per million) - phần triệu

RDI :

(Recommended Daily Intake) - nhu cầu hàng ngày được khuyến

RSD :

(Relative Standard Deviation) - độ lệch chuẩn tương đối

STT :

Số thứ tự

Si :

Diện tích píc sắc ký

S :

Diện tích píc trung bình

TBHQ :

Ir ■

(tert-butylhydroquinone) - chất chống oxy hóa
thời gian lưu trung bình

ư v - VIS :

(Ultra Violet - Visible) - tử ngoại khả kiến.


TT
T ên bảng

T ra n g

b ản g
1.1

Liều khuyến cáo bo sung vitamin hàng neày

7

3.2

Chương trình gradient pha động

23,25

3.3

Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân mẫu

26

3.4
3.5

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân mẫu
Ảnh hưởng của nồng độ KOH trong quá trình xử lý mẫu:

27
28

3.6

Sự phụ thuộc của diện tích píc với nông độ vitamin A

31

3.7

Sự phụ thuộc của diện tích píc với nông độ vitamin E

32

3.8

Kêt quả kiêm tra đường chuân vitamin A

34

3.9

Kêt quả kiêm tra đường chuân vitamin E

35

3.10

Độ lặp lại vê thời 2 Ĩan lưu và diện tích píc của vitamin A

37

Độ lặp lại vê thời gian lưu và diện tích píc của vitamin E

38

3.12

Độ lặp lại khi phân tích vitamin A

38

3.13

Độ lặp lại khi phân tích vitamin E

39

3.14

Độ thu hồi của phương pháp cho vitamin A

40

3.15

Độ thu hồi của phương pháp cho vitamin E

41

3.11

3.16

Ket quả phân tích mẫu sữa trên hệ thống HPLC ban đầu

42

3.17

Kết quả phân tích mẫu sữa trên hệ thống thiết bị khác

42


TT
Tên hình

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của Retinol

4

1.2

Công thức cấu tạo của các vitamin E

4

3.3

Phô hâp thụ của vitamin A

21

3.4

Phô hâp thụ của vitamin E

22

3.5

Quy trình xử lý mâu tách 2 vitamin A và E từ sữa

29

3.6

Sự phụ thuộc của diện tích píc với nông độ vitamin A

31

3.7

Đường chuân biêu diên sự phụ thuộc tuyên tính

32

3.8

Sự phụ thuộc của diện tích píc với nông độ vitamin E

32

3.9

Đường chuân biêu diên sự phụ thuộc tuyên tính

33

3.10

Săc đô vitamin A tại nông độ 0,016 ppm

36

3.11

Sắc đồ vitamin E tại nồng độ 0,25 ppm

36

hình


ĐẠT VAN ĐE
Trong cuộc sống hàng ngày, nhu cầu về dinh dưỡng của cơ thể con người là
vô cùng quan trọne và thiết yếu. Nó CU112 cấp nguồn năng lượng và các yếu tố vi
chất cần thiết khác siúp con người tồn tại và phát triển, đặc biệt là trẻ nhỏ. Trong số
đó, không thể thiếu được các vitamin. Vitamin là phân tử hữu cơ cần thiết cho hoạt
độna, chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật. Chúng thuộc nhóm chất có hoạt
tính sinh học cao nhưng cơ thể hầu như không thể tự tổng họp được mà phải đưa từ
bên ngoài vào theo thức ăn. Vì đây là các yếu tố vi lượng nên cơ thể con người chỉ
cần một lượng nhỏ các vitamin trong các loại thực phẩm thường ngày hay trong các
loại thực phẩm bổ sune. Có nhiều loại vitamin và chúng khác nhau về bản chất hoá
học lẫn tác dụng sinh lý.
Vitamin A có nhiều chức năng quan trọng đổi với cơ thể neười, đặc biệt là về
thị giác. Ngoài ra vitamin A còn ảnh hưởng để sự sinh trưởng và phát triến của các
mô, các tể bào và xương trong cơ thể. Nó có tác dụng làm tăng chức năng miễn dịch
và cần thiết cho sự sinh sản và phát triển của thai nhi. Tuy nhiên, khi dùna quá liều,
vitamin A gây độc: tăng áp lực nội sọ, chóng mặt, chứng nhìn đôi, trẻ em bị lồi
thóp, co giật, viêm da tróc vảy và có thể tử vong.
Vitamin E là một chất chổng oxy hoá tốt do cản trở phản ứng có thể sây hại
của các 2 ốc tự do trên các tế bào của cơ thể. Nó có thể ngăn ngừa sự lão hóa. làm
chậm phát sinh một số bệnh ung thư và làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh tim

mạch. Nsoài ra, vitamin E còn có thể kích thích hệ thống miễn dịch duy trì hoạt
động bình thường. Thiếu vitamin E có thể gây bệnh thần kinh ngoại biên, mất điều
hòa, viêm võng mạc. Ngược lại, nếu dùng vitamin E liều cao (trên 3000 IU mỗi
ngày) có thể gây rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, đầy hơi, đi lỏng, viêm ruột hoại tử).
Có rất nhiều nguồn thực phẩm cung cap vitamin A và E cho cơ thế. Tron^
đó, các loại thực phẩm có nguồn sốc động vật thườne phong phú hơn các loại thực
phẩm có nguồn gốc thực vật. Trong các loại thực phẩm trên thì sữa là nguồn cung
cấp vitamin A và E quan trọng. Nhu cầu hàng ngày của con người về các vitamin đã


được Viện hàn lâm khoa học Hoa Kỳ tiêu chuẩn hóa và được FDA (Hoa Kỳ) lấy
làm thông tin để lựa chọn bổ suns vi chất dinh dưỡng hiện nay. Vì vậy các công ty
sản xuất sữa thường lấy đó để bổ sung lượng vitamin A và E cần thiết trong các sản
phẩm sữa. Tuy nhiên, vì vitamin A và E không bền vững, dễ bị phân hủy nên trong
các quá trình sản xuất, tồn trữ và phân phối, có một sổ nguyên nhân làm cho lượng
hai vitamin trên trong sản phẩm không còn đúng như với công bố ban đầu của nhà
sản xuất. Điều này ảnh hưởng đến lượng vitamin A và E bổ sung dẫn tới ảnh hưởna
tới sức khỏe neười tiêu dùng.
Sữa là loại thức uống đặc biệt, cung cấp nhiều chất dinh dưỡng và có mùi vị
thơm ngon. Sữa được sử dụns rộng rãi khắp thế giới. Đời sổng neày một nâng cao,
uống sữa cũng dần trở thành một thói quen hàne neày của người dân. Nhu cầu về
sữa càng đặc biệt quan trọng đối với trẻ nhỏ, phụ nữ có thai và cho con bú, người
tập thể thao hoặc lao động nặne, người bị stress, người tiếp xúc với môi trường ô
nhiễm, người suy nhược cơ thể hay bị bệnh. Vì vậy, chất lượng các sản phấm sữa
phải đạt yêu cầu đổi với các đối tượng sử dụng như công bố của nhà sản xuất.
Hiện nay, tại Việt Nam. chưa có nhiều phương pháp định lượng vitamin A và
E trong lĩnh vực kiểm nghiệm thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng. Nhu cầu
đặt ra là phải có được một phương pháp đáp ứng yêu cầu thực tế. Nó phải có độ
chính xác cao, đơn giản, dễ áp dụns, và phải phù họp với các điều kiện hiện có của
các phòng thí nghiệm trone nước. Mục đích của đề tài này là góp phần kiểm soát

chất lượng sữa, giúp mọi người có được neuồn dinh dưỡng hợp lý, đủ về số lượng
và đảm bảo về chất lượng.
Vì vậy, luận văn này thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trìn h xác
định đồng thòi hai vitamin A và E trong sữa bằng HPLC” với hai mục tiêu sau:
-

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin A và E trong sữa bột

-

ứ n g dụng quy trình đã xây dựng cho phân tích một số mẫu sữa trên thị
trường Việt Nam.


CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN
1.1. Đ ại cư ong về vitam in A và vitam in E:
1.1.1. Đặc điếm lý hỏa:
*

Vitamin A:
Quá trình phật hiện ra vitamin A có nguồn gốc từ nghiên cứu vào khoảng

năm 1906, trong đó chỉ ra rằng các yếu tố không phải là các carbonhydrat, protein,
chất béo cũne là cần thiết để giữ cho bò khỏe mạnh. Vào năm 1917, một trong các
chất này đã được Elmer McCollum tại Đại học Wisconsin-Madison và Lafayette
Mendel cùng Thomas Osbome tại Đại học Yale phát hiện ra độc lập với nhau. Do
"yểu tố hòa tan trong nước B" (Vitamin B) cũng mới được phát hiện gần khoảng
thời gian đó, nên các nhà nghiên cứu chọn tên gọi "yếu tố hòa tan trong dầu A"
(vitamin A).
Vitamin A không phải là một chất mà là tên chung để chỉ nhiều chất có hoạt

tính sinh học tương tự nhau. Tất cả các dạng vitamin A đều có vòng Beta-ionon và
Sắn vào nó là chuỗi isoprenoid. Trong thực phẩm có nguồn gốc độns vật, dạng
chính của vitamin A là retinol, nhưng cũng có thể tồn tại dưới dạng aldehyd là
retinal, hay dạng acid là acid retinoic. Các tiền chất của vitamin A tồn tại trong thực
phẩm nguồn gốc thực vật gồm 3 loại là a,p.y - caroten có trong một vài loài cây
thuộc họ hoa tán. Chất thường được gọi là vitamin A là Retinol, có phân tử gam là
286,45. Vì Retinol có hoạt tính sinh học quan trọng nhất và là dạng chủ yếu chiếm
đa số nên trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ nghiên cứu về Retinol (sau đây gọi
tắt là vitamin A) [2],
Vitamin A là những tinh thể hoặc bản mỏng màu vàng nhạt, nóng chảy ở
63°C-64°C, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và một số dung môi
hữu cơ. Do có hệ nối đôi liên hợp nên vitamin A dễ bị oxy hóa, không bền vững
trong không khí, ánh sáng, nhiệt độ cao hay khi có mặt của các chất béo dễ bị hoặc
đã bị oxy hóa. Vì vậy, phải bảo quản vitamin A ở chỗ nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng,


trong chai lọ thủy tinh màu vàne, bao bì kín, thêm chất chống oxy hóa. Đe điều chế
Vitamin A, có thể phân lập từ dầu 2 an cá hoặc tổng họp hóa học [3],

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Retinol
*

Vitamin E:
Vitamin E là một nhóm các họp chất thuộc dẫn chat tocopherol hoặc

tocotrienol có tác dụng dược lí giống nhau. Các vitamin E và ester của chúng là chất
lỏng sánh như dầu, màu vàng sáne, hầu như không mùi, khône vị; không tan trong
nước, tan trong ethanol, các dung môi hữu cơ và các dầu béo (riêng dạng muối
succinat là bột màu trắng). Do trong phân tử có các carbon bất đối nên vitamin E có
các done phân quang học. Các đồng phân hữu truyền (dạna d) thường có hoạt tính

mạnh hơn các đồng phân tả truyền (dạng 1). Các Tocopherol trong tự nhiên ở dạng
d, loại tổng hợp dạng racemic. Các vitamin E dễ bị oxy hóa với các tác nhân: tia tử
ngoại, chất béo đă bị ôi, một số kim loại nặng và môi trường kiềm. Vì vậy, cần phải
bảo quản vitamin E trong chai lọ kín, đổ đầy, thủy tinh màu vàng, để chỗ nhiệt độ
thấp, tránh ánh sáng [2], [3],
S .J

Cí-tocotnenol, Rị =

= R.Ị = CH3

fi-tocopherol. Rì = R 3 = CHj, R>> = H
iMccccrisnof, R« = R 3 = CH*; R2 = H

-f-tecetne-noi. R« = Rj = CH3 Rj = H
Mocop~e;ol. R, = R2 = Rj = H
Mocaừíenol, R, = Rj = R3 = H

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của các vitamin E


Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol
và 4 tocotrienol. Tất cả đều có vòng chromanol, với nhóm hydroxyl có thể cung cấp
nguyên tử hydro để khử các gốc tự do và nhóm R (phần còn lại của phân tử) kỵ
nước để cho phép chúng thâm nhập qua các màng sinh học dễ dàng. Các tocopherol
và tocotrienol đều có dạng alpha (a), beta (P), gamma (y) và delta (ô), được xác
định theo số lượng và vị trí của các nhóm methyl trên vòng chromanol. Mỗi dạng có
hoạt tính sinh học khác nhau chút ít. Dạng a-Tocopherol có công thức phân tử là
C 79H 50O 7 và phân tử lượng là 430,71 (g/mol) chiếm chủ yếu trong tự nhiên và có
hoạt tính quan trọng nhất, vì vậy nó thường được lấy tên chung là vitamin E. Trong

phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ nghiên cứu dạng đồng phân a-Tocopherol. v ề
điều chế, có thể phân lập từ các nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên dưới dạng dung
dịch đậm đặc. Ngày nay, vitamin E được điều chế chủ yểu bằng phương pháp tổng
họp hóa học [1], [18].
1.1.2. Giá tri dinh dưỡng của vitamin A và E:
*

Vai trò của vitamin A trong cơ thế:
Vitamin A có nhiều tác dụng quan trong trên nhiều bộ phận của cơ thế[l][3]:

- Thị giác: mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamin A. Nó được hấp thụ bởi
luồng thần kinh được vận chuyển nhờ dây thần kinh thị eiác. Trong bóng tối, retinal
kết hợp với opsin (là một protein) để cho rhodopsin là sắc tố nhạy cảm với ánh sáng
ở võng mạc mắt, giúp võng mạc nhận được các hình ảnh trong điều kiện thiếu ánh
sáng. Sau đó, khi ra sáng rhodopsin lại bị phân huỷ cho opsin và trans-retinal, rồi
trans-retinal vào máu đế cho trở lại cis-retinol. Vì vậy sự có mặt của vitamin A là
một phần không thể thiểu đối với việc đảm bảo thị giác của con người.
- Các mô: Vitamin A kích thích quá trình phát triển và phân chia tể bào biểu mô;
rất cần thiết cho việc phát triển của xương, sự sinh sản và phát triển của bào thai.
Vitamin A mà chủ yếu là acid retinoic còn là chất cần thiết cho hoạt động của biếu
mô, làm bài tiết chất nhày và ức chế sự sừng hóa. Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến
da, kích thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá.


- Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người,
nên vitamin A là yếu tổ khôns thể thiếu đối với sự phát triển của phôi thai và trẻ
em. Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamin A làm
xươns mềm và mảnh hơn bình thườna, quá trình vôi hoá bị rôi loạn.
- Hệ thống miễn dịch: do các hoạt động đặc hiệu lên các tế bào của cơ the, vitamin
A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật của con người.

- Chốne lão hoá: vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do naăn chặn sự phát triến của
các gốc tự đo. Chống ung thư: hoạt độns kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng
dẫn đến ngăn chặn được một số bệnh ung thư.
Liều dùng vitamin A thường được biểu diễn bằng các đơn vị quốc tể (IU) hay
đương lượng retinol (RE-retinol equivalent), với 1 IU = 0,3 microgam retinol. Nhu
cầu hàng ngày được khuyển cáo (RDI) về vitamin A theo nhu cầu tham chiếu ăn
uống của Hoa Kỳ là: khoảng 900 microgam (tương đương 3.000 IU) đối với nam
giới và khoảng 700 microgam (tương đương 2.300 IU) đối với nữ giới [2].
*

Vai trò của vitamin E trong cơ thế:
Vitamin E thể hiện vai trò quan trọng của nó với nhiều tác dụng:

- Ngăn ngừa lão hoá: do vitamin E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hoá
bằng cách ngăn chặn các sốc tự do mà. Nó bảo vệ các acid béo chửa nhiều dây nổi
đôi ở màng và các tổ chức khác của tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do và
bảo vệ cho hồng cầu khỏi tan vỡ. Thiếu vitamin E có thể gây bệnh thần kinh ngoại
biên, mất điều hòa, viêm võng mạc [1].
- Ngăn ngừa ung thư: kết họp với vitamin c tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm
sự phát sinh của một số bệnh ung thư. Tác dụng trên hệ thống miễn dịch: kích thích
hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằng việc bảo vệ các tế bào. Vitamin E
làm tăng chức năng thực bào, làm tăng khả năng sinh kháng thể của cơ thể, làm
giảm prostaglandin (một chất giống như hormon có liên quan đến chức năng miễn
dịch của cơ thể).


- Neăn nsừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu (LDL) và làm
tăng sự tuần hoàn máu nên làm giảm neuy cơ mac các bênh tim mạch. Vì vậy,
vitamin E thường được điều trị hỗ trợ chứng san nhiễm mỡ, tăng cholesterol máu.
- Đối với phụ nữ mane thai, vitamin E góp phần thuận lợi cho quá trình mang thai,

sự phát triển của thai nhi và siảm được tỷ lệ sẩy thai hoặc sinh non do đã trung hòa
hoặc làm mất hiệu lực của gốc tự do trong cơ thể. Ngoài ra vitamin E còn sóp phần
cải thiện tình dục, giúp noãn (trứna) và tinh trùng phát triển tốt hơn, nâng cao kết
quả điều trị vô sinh.
- Khi cơ thể bị thiểu vitamin E có thể gặp các triệu chứng như: Rối loạn thần kinh,
yếu cơ, rung giật nhãn cầu, giảm nhạy cảm về xúc giác, dễ tốn thương ở da, dễ vỡ
hồng cầu, dễ gây tổn thương cơ quan sinh dục, có thể gây vô sinh [3], [12],
Đơn vị hoạt tính của vitamin E được tính theo quy ước của đơn vị quốc tế
(IU). Đây cũne là cơ sở để xác định lượng vitamin E cần thiết bổ xung hàng ngày.
Theo quy ước thì 1 m2 a-Tocopherol tương đương 1,1 IU và 1 mg a-Tocopheryl
acetat tương đương 1 IU. Nhu cầu hàng ngày được khuyến cáo (RDI) về vitamin E
theo nhu cầu tham chiếu ăn uống của Australia là: khoảng 10 miligam a-Tocopherol
đối với nam giới và khoảng 7 miligam a-Tocopherol đối với nữ giới. Với một số đối
tượng sử dụne đặc biệt hơn, Viện hàn lâm khoa học Mỹ và FDA nghiên cứu và ban
hành thành tiêu chuẩn [2].
Bàng 1.1: Liều khuyến cáo bổ sung vitamin hàng ngày
Vitamin

Dưói 1 tuổi

Từ 1-4 tuổi

Trên 4 tuổi

Có thai

A (IU)

1,500

2,500

5,000

8,000

E (IU)

5

10

30

30

1.2. Các phương pháp xác định vitam in A và E trong sữa:
1.2.1. Tách chiết hai vitamin trên ra khỏi mẫu thủ’ :
Vitamin A và E tự nhiên có trong thực phẩm thường ở trạng thái liên kết với
hợp chất lipoprotein. Vì vậy, liên kết này cần phải được phá vỡ và giải phóng các
vitamin ra khỏi các dạng phức hợp. Các dạng vitamin được bô xung vào trong thực


phẩm thì thường được chứa tron 2 một nền gelatin bảo vệ. Do đó, nhiệm vụ đầu tiên
là phải tách được các vitamin sử dụng một quy trình chiết xuất phù hợp. Trước khi
được đem phân tích bàng HPLC, cần phải làm sạch, loại bỏ các hợp chất khác đi
kèm trong quá trình chiết như các lipid, các sterol, các carotenoid để loại bỏ ảnh
hưởng của chúng đến kết quả phân tích [28], [29].
* Xà phòng hóa (saponification-alkaline hydrolysis):
Đây là phương pháp thực sự hiệu quả để loại bỏ các glycerid thường có rất

nhiều trong thực phẩm ra khỏi mẫu phân tích. Xà phòns hóa cũng là phương pháp
đơn giản và kinh tế để thủy phân một lượng lớn các chất cần phân tích. Phản ứng
thủy phân (hydrolysis) sẽ tấn công vào các vị trí có liên kết ester và giải phóng các
acid béo ra khỏi các glycerol bán glycerid, các phospholipid, và các ester sterol. Các
ester của vitamin A và vitamin E được thủy phân tạo thành các dạng alcol tương
ứng của chúng. Phản ứng cũng bẻ gãy một lượng lớn các sắc tố và các hợp chất
khác. Điều này khá quan trọng vì nó làm giảm các tạp chất trên trong mẫu phân
tích. Các sản phẩm thực phẩm có thể được xà phòng hóa trực tiếp. Tuy nhiên, cũng
có thể cần phải xử lý mẫu phân tích trước khi đem xà phòng hóa và chiết xuất. Các
mẫu thực phẩm có nhiều tinh bột có thể được thủy phân trước với enzym
takadiastase để tránh tạo vón cục trong dung dịch thủy phân [11], [21],
Thông thường, quá trình xà phòng hóa được thực hiện bằng cách lắc mẫu
phân tích đã được xử lý sơ bộ phù hợp với từng đối tượne mẫu với dung dịch KOH
trong ethanol và có thêm chất chống oxy hóa trong 30 phút. Nên thổi khí nitơ vào
trong bình thủy phân tại thời điếm bắt đầu và khi kết thúc quá trình thủy phân.
Không cần thiết phải thổi khí nitơ trong quá trình lắc bởi vì lúc đó đã bão hòa alcol,
ngăn cản sự oxy hóa của không khí. Lượng dung dịch KOH trong ethanol thì phụ
thuộc vào lượng chất béo có chứa trong mẫu. Nói chune, thông thường cần phải sử
dụng 5 ml dung dịch KOH 60% trong nước và 15 ml ethanol cho 1 gam chất béo.
Các chất chống oxy hóa thường được sử dụng trong quá trình xử lý mẫu là:
pyrogallol, BHA (butyl hydroxy anison), BHT (butyl hydroxy toluen), TBHQ (tert
butyl hydroxyquinon). Tuy nhiên, pyrogallol thường bị biến đổi trong quá trình thủy


phân tạo thành pyrogallin. Sản phẩm này cũns được chiết đồng thời vào các dung
môi hữu cơ cùng với các phần không bị xà phòng hóa. Điều này có thể làm tăng
nhiễu đường nền trong các phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang.
Retinol thì khá ổn định trong các dung dịch kiềm và có nshiên cứu cho thấy
nó ổn định ít nhất 1 tuần trong duns dịch KOH trong ethanol có chứa pyrogallol.
Thông thường, quá trình xà phòng hóa diễn ra tại nhiệt độ sôi của hỗn hợp thủy

phân. Điều này loại bỏ đáng kể các xanthophyll, các epoxy đặc biệt của các
carotenoid như violaxanthin và neoxanthin. Một tiện ích khác là nó cũng loại bỏ
được các xanthophyll bất hoạt giúp xác định các provitamin A (các caroten) được
tốt hơn (trong khi đó các caroten lại không bị 2 Ĩảm đáng kể trong quá trình xà
phòng hóa). Tuy nhiên, nếu yêu cầu cần phải xác định cả các xanthophyll và các
caroten, cần phải thực hiện kỹ thuật xà phòng hóa tại nhiệt độ phòng và kéo dài
thêm thời gian thủy phân [28], [29].
Độ thu hồi của a-Tocopherol được định lượng gần như hoàn toàn sau khi xà
phòng hóa ở nhiệt độ cao, tuy nhiên có sự giảm sút đáng ke của các tocotrienol mặc
dù có mặt của các chất chống oxy hóa. Các yếu tố ảnh hưởne đến sự giảm sút này
là: nồng độ của dung dịch kiềm, nhiệt độ xà phòng hóa và khoảng thời gian diễn ra
quá trình thủy phân. Sự đóng góp của các tocotrienol cho tổng hoạt tính của vitamin
E trong thực phẩm nói chung là nhỏ, vì vậy sự mất các tocotrienol trong mẫu phân
tích ảnh hưởng không đáne kể đến hầu hết các mục tiêu thực hiện .
*

Quá trình chiết các phần không xà phòng hóa :
Các sterol, các carotenoid, các vitamin tan trong dầu (FSV),...đều không bị

xà phòng hóa nên có thể được chiết ra khỏi hỗn họp sau khi thủy phân bằng kỹ
thuật chiết lỏng - lỏng sử dụng các dung môi hữu cơ không hòa tan với nước. Các
acid béo được kết tủa dưới dạng muối của chúng (xà phòng) và glycerol thì không
thể chiết được trong môi trường kiềm. Lặp lại quá trình chiết nhiều lần là cần thiết
để chuyển được tối đa lượng vitamin có trong mẫu phân tích sang pha duns môi
hữu cơ. Trone quá trình chiết cần thận trọng tránh làm phân hủy các vitamin bằng


cách sử dụng các dụng cụ thủy tinh mầu tối, loại khí oxy trong các dung môi bằng
cách sục khí nitơ và cho thêm các chất chống oxy hóa vào trong các duns môi chiết.
Khi sử dụng các dung môi hydrocarbon như hexan hoặc ether dầu hỏa, điều

quan trọng là phải đảm bảo tỉ lệ cân bàng tối ưu của nước và ethanol trong quá trình
chiết. Để chiết hiệu quả retinol và các tocopherol khi sử dụng hexan, nồng độ
ethanol phải dưới 40%. Các chất bị xà phòng hóa được chiết ra khỏi hỗn họp sau
khi thủy phân không đáng kể. Chúng chuyển sang lóp hexan rất ít nhưng một lượng
lớn của chúng có các đặc tính sơ nước (hydrophobic) so với hỗn hợp ethanol-nước
và sự cho thêm nước vào sẽ ít ảnh hưởng đến quá trình chiết tách. Bởi vậy, cần phải
nghiên cứu để số lần chiết là ít nhất và độ thu hồi của các vitamin không bị ảnh
hưởng bởi lượng chất béo có chứa trong mẫu thực phẩm cần phân tích [26], [28]..
Vitamin A và vitamin E là các họp chất rất ít phân cực nên sẽ được chiết ra
khỏi hỗn họp sau khi thủy phân bằng cách sử dụng các dung môi ít phân cực như
diethyl ether, ether dầu hỏa/diethyl ether (1:1), ether dầu hỏa/diisopropylether (3:1),
10% ethyl acetat trong hexan và hexan/diethyl ether (85:15). Việc rửa dịch chiết
diethyl ether được thực hiện nhiều lần với nước cất để loại bỏ phần kiềm còn dư sau
quá trình xà phòng hóa. Các nhũ tương có thể được tạo ra khi các chất đã bị xà
phòng hóa, nước, và các dung môi sơ nước được lắc trộn với nhau khi khône có mặt
của ethanol. Vì vậy, giai đoạn rửa cần phải được thực hiện lắc xoáy nhẹ nhàng.
Dịch sau khi chiết được loại bỏ nước bằng cách cho qua natri sulfat khan và được
làm khô cẩn thận bằng hệ thống cất quay chân không. Trong quá trình cất quay,
bình cất quay luôn được làm đầy bởi các dung môi cất quay. Tuy vậy, giai đoạn
cuối nên cho dòng khí nitơ thổi vào. Cặn còn lại có thể được hòa tan trong một dung
môi thích họp để chuyển sang quá trình làm sạch mẫu tiếp theo hoặc có thế tiến
hành phân tích ngay trên hệ thống HPLC [29].
* Kết

tủa các sterol:
Phần không bị xà phòng hóa trong sữa nói chung thường chiếm khoảng 0,3-

0,45% khối lượng của tổng lượng chất béo và chiếm chủ yếu trong số đó là các
sterol gồm có: đa số là cholesterol và các sterol khác. Phần lớn chúng có thế được

loại bỏ ra khỏi phần không bị xà phòng hóa bans cách kết tủa với dung dịch
methanol ở nhiệt độ lạnh và sau đó tiến hành lọc lấy riêng phần dịch lọc trong để
đem đi phân tích [28],
1.2.2. Các kỹ thuât đinh lương vitamin A và E:
*

Quang phố hấp thụ tử ngoại [1]:
Vitamin A có cấu tạo phân tử với hệ thống 5 dây nối đôi liên họp nên có khả

năng hấp thụ bức xạ tử ngoại rất lớn. Vì vậy, phương pháp đo quang phổ tử ngoại
thường được dùng để định lượng vitamin A. Dung dịch vitamin A có phổ hấp thụ tử
ngoại rất đặc trưng, nhưng khi có mặt chất khác, đặc biệt là sản phẩn phân hủy của
vitamin A thì phổ hấp thụ bị biển dạng. Vì vậy, theo Dược điển Việt Nam III, tùy
theo đặc điểm của vitamin A trong các thuốc và nguyên liệu làm thuốc, có 2
phương pháp để định lượng. Vitamin A rất dễ bị oxy hóa nên điều kiện tiến hành
chung là phải nhanh chóng, tránh ánh sáng và sử dụng kèm chất chổng oxy hóa.
Phương pháp đo quang trực tiếp được áp dụng cho các nguyên liệu vitamin
A dạng ester (retinyl acetat, retinyl palm itat,...) và các dầu hoặc nang mềm chứa
vitamin A dạng ester với hàm lượng lớn (trên 5000 IU/g). Phương pháp này sử dụng
dung môi cyclohexan để hòa tan chế phẩm và làm mẫu trắng. Còn phương pháp đo
quang sau khi chiết tách vitamin A thì được áp dụng cho đa số các dạng thuốc chứa
vitamin A như: viên nang, viên nén, thuốc bột, thuốc m ỡ,...). Phương pháp này sử
dụng isopropanol làm dung môi hòa tan cắn trước khi đem đo và làm mẫu trắne.
* Sắc

kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC):
HPLC có một số lợi thế quan trọng hơn so với GLC và các kỹ thuật sắc ký

khác khi phân tích các vitamin trong thực phẩm nói chung. Bởi vì HPLC có thể phát

hiện các vitamin khá chọn lọc, quá trình xử lý mẫu không quá phức tạp, và ít khi
cần dẫn xuất hóa. Do không phá hủy các chất tự nhiên sau khi tách nên HPLC còn
được sử dụng như phương pháp điều chế và định lượng. Với những lý do trên, so
với những kỹ thuật khác, đế xác định các vitamin tan trong dầu nói chung với một


độ chính xác và độ lặp lại chấp nhận được thì HPLC là một phương pháp được lựa
chọn hiện nay [12], [18], [25].
Trong số các dạng retinoid thông thường được tìm thấy trong thực phẩm nói
chung, chỉ có dạng all-trans-retinol, một lượng nhỏ 13-cis-retinol và dạng ester của
chúns thì thường có mặt với lượng đáng kể. Trong thực phẩm bo suns với dạng
retinyl acetat, HPLC thuận tiện cho việc tách phân biệt phần bổ sung và phần có ban
đầu (retinyl palmitat), đồng thời xác định được tổng lượng vitamin A có trong mẫu
thực phẩm. Trong phân tích các loại rau quả, HPLC có thể tách được bốn dạng
provitamin A thường gặp nhất (đó là các carotenoid: a-, Ị3-, y-caroten và P'
cryptoxanthin), thậm chí có thể tách được cả dạng đồng phân cis và trans của mỗi
chất đó. Các carotenoid hoạt tính cũne có thể tách ra khỏi các carotenoid bất hoạt.
Hàm lượne ban đầu của vitamin E trong những thực phẩm có chất béo
thường khoảng mg/1002, trong khi đó hàm lượng ban đầu của vitamin A chỉ khoảng
mcg/100a. Vì vậy, trong thực tế, vitamin E có thể được xác định bằng HPLC mà
không cần tinh chế mẫu kéo dài. v ề mục đích dinh dưỡng, giá trị của vitamin E có
thể được đánh giá bàng cách sử dụng các hệ số thích họp dựa trên cơ sở tương quan
với hoạt tính sinh học. Trong các thực phẩm bổ sung, HPLC cũng thường có khả
năng xác định đồng thời cả a-tocopherol acetat bổ sung và tổng lượng a-tocopherol.
*

Sắc ký khí lỏng (Gas-liquid chromatographic methods-GLC) [27]:
Một số dạng sắc ký thì bắt buộc sử dụng để xác định các các vitamin tan

trong dầu nói chung trong thực phẩm, trong đó có sắc ký lóp mỏng, sắc ký khí lỏng

(GLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Trong những năm 1960, trước khi
HPLC phát triển, GLC đã được ứng dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong
dầu có trong thực phẩm. Sau đó, với việc chuyển từ công nghệ cột nhồi (packed
column) sang cột mao quản (capillary column) thì hiệu quả ứng dụng của kỹ thuật
GLC phát triển mạnh mẽ. Một quá trình chuẩn bị mẫu kéo dài là yêu cầu đế loại bỏ
các phần lipid, các sterol và một số tạp chất khác ra khỏi nền mẫu. Thêm vào đó,
điều cần thiết là phải dẫn xuất các vitamin này đế tăng khả năng bay hơi và tăng độ


bền vững của chúng trong nhiệt độ cao. Vitamin A và Vitamin E có thể được dẫn
xuất tại các vị trí nhóm -O H của chúng tạo các dạng tri methyl silan (TMS) ether.
* Phương pháp

sinh học (Biological methods)[28]:

Với mục đích xác định hoạt tính sinh học của các vitamin trong thực phẩm
nói chung người ta đã thực hiện kỹ thuật mang tính truyền thống, trong đó sử dụng
một sinh vật thử nghiệm cho một đáp ứng sinh lý đặc biệt. Các thử nghiệm sinh học
xác định hoạt tính của một vitamin có trong thực phẩm được tính toán kết hợp với
các dạng cấu trúc tương tự (vitamers), các provitamin, các previtamin và các chất
chuyển hóa của chúng vẫn còn có tác dụng. Các thử nghiệm sinh học mất rất nhiều
thời gian và tốn nhiều chi phí để thực hiện như một kỳ thuật thường quy, vì vậy
thường được thay thế bằng các phương pháp hóa lý. Tuy vậy, các thử nghiệm sinh
học vẫn được sử dụne để xác định hiệu lực sinh học của các dẫn xuất vitamin mới
và các đồng phân của chúng, đồng thời cũng để phê chuẩn các phương pháp mới.
1.2.3. Phương pháp xác định đồng thời hai vitamin A và E bằng HPLC:
* Khả

năng xác định đồng thời hai vitamin A và E:
Trong một nghiên cứu sần đây, các tác giả M. Kuhn, s. Nakib ... đã xác

định đồng thời hai vitamin A và vitamin E trong thực phẩm. Quy trình phân tích
gồm có các giai đoạn sau: loại protein bang ethanol, thủy phân bằng dung dịch
KOH 3,6M trong một bể runs; siêu âm tại 65°c với thời gian là 30 phút. Sau đó
thêm đệm phosphat và chiết 3 lần bằng dung môi n-Hexan. Hệ dung môi pha động
gồm có acetonitril/methanol/H20 thay đổi theo gradient, tốc độ dòng cũng được
thay đổi theo thời gian phân tích, sử dụng cột sắc ký Cg (25cm

X

0,46cm; 5|im).

Bước sóng xác định vitamin A là 325nm và vitamin E là 292nm. Tuy nhiên, thời
gian cho một lần phân tích khá dài (khoảng 30 phút) [24],
Khi phân tích xác định vitamin A và E trong các loại sữa dành cho trẻ nhỏ,
Soledad Albala-Hurtado và các cộng sự cũng sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu
năng cao pha đảo với cột sắc ký C]8 (25cm X 0,46cm; 5|iin). nhưng chỉ tiến hành
thủy phân mẫu phân tích tại nhiệt độ phòng và sau đó chiết bằng dung môi n-Hexan.


Pha động làm việc theo

chế

độ

isocratic với hỗn họp

dung môi là

acetonitril/methanol/H20 (1:95:4). Khoảne tuyến tính của phương pháp này là khá
hẹp: từ lppp - lOppm đổi với vitamin A (tại bước sóng 323nm) và từ lOppm đến
lOOppm đối với vitamin E (tại bước sóng 292nm) [23].
Phương pháp phân tích vitamin A và E của Charlotta Turner và Lennart
Mathiasson có độ thu hồi rất cao (99% cho vitamin A và 96% cho vitamin E). Tác
giả cũng sử dụng cột tách sắc ký C]8 (25cm X 0,46cm; 5|im) v à hệ dung môi pha
động chỉ có methanol và nước (96:4), rửa giải isocratic, tốc độ dòng là 1 ml/phút.
Thời gian cho một lần phân tích sắc ký hết khoảng 30 phút. Tác giả cũng thực hiện
giai đoạn xà phòng hóa bằng KOH/ethanol để loại bỏ chất béo và chuyển các dạng
ester của các vitamin về thành dạng alcol tương ứng của chúng. Điểm đặc trưng của
phương pháp này là hai tác giả đã sử dụng kỹ thuật chiết lỏng siêu tới hạn
(supercritical fluid extraction) để làm sạch mẫu. Đây là kỹ thuật mới, đòi hỏi người
thực hiện phải có những hiểu biết nhất định và rất tốn kém. Chính vì vậy kỹ thuật
này chưa được áp dụng phố biến [33].
A. Escriva với các cộng sự đã phát triển phương pháp xác định đồng thời các
vitamin tan trong dầu trên các đối tượng là thực phẩm nấu chín, sữa và các sản
phẩm từ sữa. Nghiên cứu này cũng có giai đoạn thủy phân mẫu trong KOH và sử
dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để chiết tách các vitamin tan trong dầu với dung
môi chiết là diethyl ether (chiết lặp 4 lần). Trong nghiên cứu sử dụng cột tách sắc ký
C]8 và hệ dung môi pha động cũng chỉ có methanol và nước (96:4). Bước sóng để
xác định vitamin A là 325nm và vitamin E là 294nm. Thời gian cho một lân phân
tích sắc ký hết khoảng hơn 20 phút với độ lặp lại khá cao (RSD là 5,24% đối với
vitamin A và 6,99% đối YỚi vitamin E) [20].
*

ứng dụng của HPLC xác định đồng thời hai vitamin A và E:
Vitamin A và vitamin E đều thuộc nhóm các vitamin tan trong dầu (fat

soluble vitamins - FSV). Chúng rat ít phân cực, độ phân cực của hai vitamin trên
khác nhau không nhiều. Bởi vậy, cả hai chế độ sắc ký lỏng hiệu năng cao là sắc ký

pha thường (normal phase) và sắc ký pha đảo (reverse phase) đều có thể được sử


dụng cho phân tích vitamin A và vitamin E. Bản thân khi phân tích từng vitamin
hoặc kết họp cả hai vitamin có thể chạy sắc ký đẳng dòng (isocratic). Khi tiến hành
phân tích HPLC đồng thời hỗn họp nhiều vitamin thì phức tạp hơn, có thế cần phải
có một chương trình rửa giải gradient. Sự lựa chọn chế độ sắc ký nào sẽ phụ thuộc
vào bản chất của mẫu cần phân tích. Trong các kỹ thuật xác định từng loại vitamin
A hay vitamin E riêng lẻ cũng đều phải tiến hành các giai đoạn thủy phân mẫu,
chiết tách chất cần phân tích ra khỏi mẫu thử sau khi thủy phân, làm sạch mẫu rồi
thực hiện phân tích trên hệ thống HPLC. Cả hai loại vitamin A và E đều có các liên
kết đôi trong công thức cấu tạo, bởi vậy chúng có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại.
Do đó có thể sử dụng detector u v để phát hiện hai vitamin này.
Với những phân tích và nhận định ở trên, chúng tôi thấy rằng khả năng xây
dựng một phương pháp định lượng được đồng thời hai vitamin A và E là hoàn toàn
có thể. Nó giúp giảm bớt được thời gian kiểm nghiệm mẫu, tiết kiệm được dung
môi và hóa chất phân tích. Phương pháp này có thể làm tăng hiệu quả kinh tế (đặc
biệt trong thời đại hiện nay), tăng năng suất lao động mà vẫn đảm bảo được chât
lượng công việc. Ngoài ra, xây dựng được một phương pháp xác định đồng thời hai
vitamin A và E trong các mẫu sữa bằng HPLC với các bước thực hiện nhanh gọn,
kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện sẽ tạo thuận lợi cho việc áp dụng phương
pháp này tại các phòng thí nghiệm khác trong cả nước, đặc biệt là các phòng thí
nghiệm tuyến dưới, phục vụ tốt công tác kiểm nghiệm thực phẩm nói chung.


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ
PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN c ứ u
2.1. Đ ối tượng nghiên cứu:
2.1.1. Các loai sữa:
Sữa là nguồn thực phấm rất quan trọng. Nó không chỉ chứa nhiều chất đạm,

lipid cung cấp năng lượng mà còn giàu các vitamin, khoáng chất và một số chất đặc
biệt khác giúp phát triển cơ thể, phòng tránh và hỗ trợ điều trị một số bệnh. Các loại
sữa được nghiên cứu trong đề tài này:
- Sữa bột (Powdered milk/formula): được đóng gói trong các hộp kim loại kín, khối
lượng từ 300g đến 500g, 2 ồm các nhãn hiệu: Nestle, Friso, Enfa grow.
- Sữa tươi (Fresh milk): được đóng trone các lon kín bằng kim loại nhãn hiệu
Ensure với thể tích thực là 300ml.
Sữa bột và sữa tươi là hai loại quan trọng nhất và được sử dụng phổ biến.
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định
hàm lượng vitamin A và vitamin E bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
trên hai loại đối tượng trên
2.1.2. Cách lấy mẫu:
*

Sữa và sản phâm sữa lỏng:

- Khuấy trộn đều bàng các dụng cụ khuấy hoặc trộn tất cả các chất lỏng bằng cách
đảo chiều, khuấy và rót từ vật này sang vật khác có cùng dung tích cho đến khi
đồng nhất. Cỡ mẫu lấy không nhỏ hon 100ml.
- Neu mẫu là sản phẩm đựng trong vật chứa là sản phẩm bán lẻ thì mẫu cần lấy là
những sản phẩm bán lẻ còn nguyên vẹn, chưa mở.
- Mau sữa lỏng sau đó được xử lý sơ bộ (lắc đều cho đồng nhất) rồi lấy một lượng
chính xác đem đi phân tích. Lưu ý: trước mỗi lần lấy phải luôn lắc đều để có được
sự đồng nhất cao nhất giữa các lần phân tích.