phân tích vi sinh thực phẩm

Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TPHCM
Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm.

Đề tài: Quy trình định tính Salmonella và Vibrio
cholerae.
Nhóm 4
TPHCM, ngày 6 tháng 3 năm 2019
1


Nội dung.

1. Ngộ độc do

2. Đặc điểm của vi

3. Quy trình định

vi khuẩn.

khuẩn.

tính.

2


Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella.
 Nguồn: phủ tạng động vật, thịt gia cầm, cá, sò,
ốc, trứng, thịt xay, thịt băm nhỏ….

 Điều kiện:
 Thức ăn

bị nhiễm một lượng đủ lớn vi

khuẩn Salmonella.

 Vi khuẩn Salmonella vào cơ thể phải phóng
ra một lượng độc tố đủ lớn.

Hình 1: Nguồn thực phẩm chứa Salmonella gây ngộ độc.
3


Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella.

4


5


Đặc điểm nuôi cấy.
 Phát triển được trong môi trường nuôi
cấy thông thường. Trên môi trường
thích hợp sẽ phát triển sau 24h.

 Có thể mọc trên các môi trường có chất
ức chế chọn lọc như DCA và XLD.

 Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella
trên môi trường là tròn, lồi, trong suốt,
có tâm đen...

Hình 2: Hình dạng vi khuẩn Salmonella
6


Đặc điểm của vi khuẩn.

1

2

Lên mên

Không lên men

glucose và

saccharose và

mannitol sinh

lactose, không

acid.

sinh indol, không
phân giải ure.

3

Có thể tiết ra 2
loại độc tố:

•

Ngoại độc
tố.

•

Nội độc tố.

7


Nội dung.

1. Ngộ độc do

2. Đặc điểm của vi

3. Quy trình định

vi khuẩn.

khuẩn.

tính.

8


Quy trình định tính.
 Mục đích và ý nghĩa của quy trình định tính:


Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích
tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có sự hiện diện của Salmonella trong
mẫu.



Để khẳng định được tên chủng phân lập được cần gửi chúng đến các phòng thí
nghiệm chuyên định danh vi sinh vật



Salmonella chứa dòng bệnh rất nguy hiểm nên cần các biện pháp an toàn khi làm
việc.

9


Quy trình định tính.


Salmonella có thể được phát hiện bằng quy trình truyền thống gồm 5 bước.

2. Tăng sinh chọn lọc.
1. Tiền tăng sinh.

3. Phân lập.

Quy trình.

5. Khẳng định.

4. Phục hồi.
10


Môi trường và hóa chất
Dung dịch Buffered Pepton Water (BPW)
Canh Rappaport-Vassiliadis SoyaPepton (RVS)

Mục đích
Tăng sinh sơ bộ
Tăng sinh chọn lọc

Xylose LysineDesoxycholate (XLD)
Hektoen Entric Agar ( HE )

Môi
trường và

Tryptone Soya Agar (TSA)

Phân lập

Phục hồi

Kliger Iron Agar (KIA) / ( TSI)
Rustigian-Stuart Urea Broth (RSU)

hóa chất.

Voges-Proskauer (VP)
Lysine Decacboxylase broth (LDC)

Thử nghiệm sinh hóa

o-Nitrophenyl  b-D-galactopyranosit (ONPG)
Tryptone Water (TW)
Thuốc thử Kovac’s
Phenol Red
α-napthol
KOH 40%

Thuốc thử
11


Quy trình phân tích.

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường
0
tăng sinh BPW, ủ ở 37±3 C, 18h±3h giờ

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho
Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua
đêm

Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh
0
chọn lọc RVS và MKTTn, ủ tối đa 42,5 C, 24±3h giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn
0
lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 37 C, 24 giờ

Thử nghiệm sinh

Thử nghiệm hiện tượng ngưng kết kháng

hóa

huyết thanh.

Kết luận.

12


Các bước tiến hành.
Bước 1: Tiền tăng sinh.

Tên môi trường

Thành phần
Pepton: 10g
NaCl : 5g

BPW (Buffered Pepton Water)

Na2HPO4: 3.5g
KH2PO4: 1.5g

Ngoài ra còn có thể sử dụng một số môi trường:
- Môi trường dịch thể Tryptic soy broth (TSB).
- Môi trường dịch thể lactose.
13


Các bước tiến hành.
Thí nghiệm mô tả.
0
ủ ở 37 ± 3 C,
18h±3h giờ

25g mẫu.

Đồng nhất mẫu bằng

25g mẫu +

máy stomacher

225ml

trong 60s.

BPW.

14


Các bước tiến hành.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc.

y
Lấ

1m
,
0

l

10ml môi
trường
RVS.

0
Ủ ở 41,5 ± 1 C trong 24
± 3h.

25g mẫu +

225ml BPW.
Lấy 1ml

10ml môi
trường
MKTTn

0
Ủ ở 37 ± 1 C trong 24 ±
3h.
15


Các bước tiến hành.



Môi trường chọn lọc tốt nhất.

Tên môi trường

Thành phần

- Môi trường cơ bản (tryptone, NaCl,
RVS
(canh Rappaport – Vassiliadis
Soya pepton)

K2PO4, nước cất)
- Dung dịch MgCl2

- Dung dịch Malachitegreen oxalate

Canh RV ức chế vi khuẩn khác nhờ MgCl2 bằng cách tác động lên tế bào vi khuẩn và nhờ màu
xanh Malachite ức chế các vi khuẩn Gr(+)
16


Các bước tiến hành.

 Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển
của Salmonella.



Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau để tăng khả
năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella cần dùng ít nhất hai loại môi
trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu.

17


Các bước tiến hành.
Bước 3: Phân lập.



Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập
khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc RVS và
MKTTn lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng
cho Salmonella như XLD và HE

18


Các bước tiến hành.



Kết quả thu được:



Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu
hồng trong suốt, có hay không có tâm
đen. Một số dòng Salmonella có thể
có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm
gần hết khuẩn lạc.

Hình 3: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD.


Các bước tiến hành.
Tên môi trường

Thành phần
Cao nấm men: 3g
L-lysine: 5g
Xylose: 3.75g
Lactose: 7.5g

XLD
(Xylose Lysine Desoxycholate)

Sucrose: 7.5g
Sodium deoxycholate: 2.5g
Ferric ammonium citrate: 0.8g
Sodium thiosulfate: 6.8g
NaCl: 5g Agar:15g
Phenol red: 0.08g

20


Các bước tiến hành.



Kết quả thu được:

 Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella
có màu thay đổi từ xanh dương đến màu
xanh lục, có hay không có tâm đen. Một
số dòng Salmonella có thể có tâm đen
bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn
lạc.

Hình 4: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường HE
21

Các bước tiến hành.
Tên môi trường

Thành phần
- Proteose Peptone: 12.0g
- Yeast Extract: 3.0g
- Bile Salts: 9.0g
- Lactose: 12.0g
- Saccharose: 12.0g

HE (Hektoen Entric Agar)

- Salicin: 2.0g
- Sodium Chloride: 5.0g
- Sodium Thiosulfate: 5.0g
- Ferric Ammonium Citrate: 1.5g
- Agar: 14.0g
- Bromthymol Blue: 65.0mg
- Acid Fuchsin: 0.1g

22


Các bước tiến hành.
Bước 4: Phục hồi.



Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn
0

lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc NA/TSA. Ủ ở 37 C trong 1824 giờ.



Giả thuyết kết quả xảy ra 2 trường hợp:



TH1: khuẩn lạc 1 có kết quả thử sinh hóa phù hợp => có Salmonella
trong mẫu.



TH2: nếu khuẩn lạc 1 không phù hợp thì tiến hành thử 4 khuẩn lạc còn
lại. Một trong bốn khuẩn lạc còn lại có kết quả thử phù hợp => có
Salmonella trong mẫu, và ngược lại.

23


Các bước tiến hành.
Bước 5: Khẳng định.

 Các khuẩn lạc xuất hiện sau khi hồi phục trên môi trường NA/TSA được sử dụng cho các thử
nghiệm sinh hóa như sau:

6 thử nghiệm sinh hóa.

Thử
nghiệm

sinh H2S
trên môi
trường

Thử

Thử

Thử

Thử

nghiệm

nghiệm

nghiệm

nghiệm

urea

VP

ONPG

LDC

Thử
nghiệm

khả năng
sinh indol

KIA

24


Thử nghiệm sinh H2S (+)

Môi trường

•

Thạch
TSI/ KIA

Nguyên tắc

•

Xác định khả

•

Cấy ria trên bề

năng sử dụng

mặt nghiêng

nguồn

của thạch và

carbohydrate,

cấy đâm sâu

có hoặc không

xuống đáy.

có sinh hơi và
H2S.

Biểu hiện khi

Cách lấy mẫu

•

0
Ủ ở 37 C trong

có Salmonella

•

Thạch có màu

vàng.

•
•

Nứt thạch .
Xuất hiện vạch
đen.

24h

25