khảo sát hoạt tính kháng các loài nấm gây hại trong nuôi trông nấm rơm, kháng khuẩn của dịch chiết cây cỏ lào (chromolaena odorata)

1

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt

vấn đề

Việc sử dụng thực vật và các sản phẩm thực vật cho mục đích y học là một
thói quen lâu đời và đang trở nên nổi bật trên toàn cầu. Mặc dù hiện tại một số chế
phẩm và công thức dược phẩm có sẵn để chăm sóc và chữa trị vết thương, nhưng
vẫn cần tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả, vì một số công thức hiện tại
gây ra tác dụng phụ hoặc thiếu hiệu quả. Các hợp chất từ nhiều loại thực vật cho
thấy chúng có tác dụng tích cực đối với các giai đoạn khác nhau của quá trình chữa
lành vết thương thông qua các cơ chế khác nhau. Một số loại thuốc thảo dược đã
cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc chữa trị vết thương và các hợp chất tự nhiên khác
nhau đã xác minh tiềm năng chữa lành các vết thương do đó có thể được coi là
thuốc tiềm năng có nguồn gốc tự nhiên. Chromolaena odorata (L.) R.M. King và H.
Robinson được coi là một loại cỏ dại nhiệt đới. Tuy nhiên, nó được dùng để điều trị
vết thương, bỏng và nhiễm trùng da. Hơn nữa, nó cũng đã được chứng minh là có
tính chất chống ung thư, chống đái tháo đường, chống độc gan, chống viêm, kháng
khuẩn và chống oxy. Ở một số nơi trên thế giới Chromolaena odorata như một loại
thuốc truyền thống được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau.
Bên cạnh đó nước ta là một nước nông nghiệp trong đó ngành trồng nấm chiếm một
phần không nhỏ đặc biệt là nuôi trồng nấm rơm. Nhưng trong quá trình nuôi trồng
thì xuất hiện một số loài nấm gây hại làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng
của nấm đặt ra một vấn đề lớn là làm sao có thể tiêu diệt các loài nấm gây hại mà
không ảnh hưởng và gây hại đến nấm rơm. Trong cây cỏ lào có những chất có hoạt
tính kháng nấm nên chúng ta có thể ứng dụng thử vào việc kháng các loài nấm gây
hại trong nuôi trồng nấm rơm.
Để hiểu rõ hơn một phần nào đó về tính kháng khuẩn và kháng nấm của loài cây
này em xin thực hiện đề tài khảo sát hoạt tính kháng các loài nấm gây hại trong nuôi

trông nấm rơm, kháng khuẩn của dịch chiết cây cỏ lào (Chromolaena odorata).


2

1.2. Mục

tiêu đề tài

Mục tiêu của đề tài là phân lập một số loài nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm
và dùng dịch chiết của cây cỏ lào(Chromolaena odorata) khảo sát tính kháng
khuẩn, kháng nấm gây hại. Ngoài ra còn khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình tách chiết dịch và một số thành phần có trong cây cỏ lào.
1.3. Yêu

cầu

-

Phân lập một số loài nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm .
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách dịch chiết từ cây cỏ lào.
Khảo sát sự đối kháng của nấm rơm với một số loài nấm gây hại trong nuôi

-

trồng nấm rơm.
Khảo sát khả năng kháng một số loại nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm

-

của dịch chiết cây cỏ lào.
Khảo sát khả năng kháng một số loài vi khuẩn của dịch chiết cây cỏ lào.


3

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. Giới

thiệu về cây cỏ lào(Chromolaena odorata)

2.1.1. Vị trí phân loại thực vật
Phân loại khoa học
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Spermatophyta( Thực vật có hạt)
Lớp: Dicotyledonae (Thực vật hai lá mầm)
Bộ: Asterales (Cúc)
Họ: Asteraceae (Cúc)
Chi: Chromolaena (Thực vật có hoa)

Hình 2.1. Cây cỏ lào (Chromolaena odorata)
(Nguồn: www.vietnammoi.vn)

Loài: C. odorata
Tên khoa học: Chromolaena odorata (L.) RM King & H. Rob
Tên thường gọi: Cỏ Nhật, Cỏ Việt Minh, Cây Cộng sản, cây phân xanh, cây bớp
bớp...
2.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố
Cây cỏ lào là thực vật nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng Caribê và Bắc Mỹ, loài cây
này phát tán qua vùng nhiệt đới Châu Á, Tây Phi và một phần Úc. Ở Việt Nam cây

cỏ lào mọc khắp các vùng trung du, đồng bằng, và vùng đồi núi thấp.
2.1.3. Đặc điểm hình thái [14]
Là một loài cây mọc thành bụi, cây có nhiều thân chính, các thân chính có nhiều
nhánh, trên thân cây có các lông tơ, cây cao từ 1,5 m đến 2 m khi trưởng thành. Các
cánh già có màu nâu và hóa gỗ ở gốc cành. Chồi có màu xanh và mọng nước. Rễ
cây dạng chùm và mọc sâu khoảng 20 – 30 cm


4

Lá mềm mỏng hình tam giác đến hình trứng, đầu lá nhọn, mọc đối xứng mép lá có
răng cưa, lá non thường chưa hình thành dạng răng cưa, trên bề mặt lá có lông
nhung. Trên lá có ba gân chính. Phiến lá dài từ 5 – 12 cm, rộng 3 -6 cm
Hoa hình ống mọc thành từng cụm từ 20 – 60 hoa một chùm, hoa có màu hồng nhạt
hoặc trắng, tràng hoa có màu xanh nhạt, nhị hoa mọc dài vươn ra khỏi tràng hoa.
Hạt màu nâu xám đến đen nhỏ năm cạnh và có lông.
2.1.4. Công dụng của cây cỏ lào [14], [15]
Trong cây cỏ lào chứa 2,65% đạm; 0,5% photpho và 2,48% kali, coumarine,
alkaloit, anthraquinone, glucoxide, saponin nhưng chủ yếu là tinh dầu và flavonoid
Toàn bộ cây từ rễ, thân, lá, hoa đều được sử dụng nhưng chủ yếu là lá.
Cây cỏ lào có chứa các chất kháng sinh, với tác dụng chống viêm và kháng khuẩn,
làm ức chế vi khuẩn gây mủ trên vết thương hở và đặc biệt có khả năng cầm máu
nhanh.
Công dụng chủ yếu:
Chữa lỵ trực khuẩn: 150 g lá và ngọn cỏ lào tươi 1 nắm to rửa sạch, cắt nhỏ, hãm
với nước nóng 800C (nước sôi để 5 phút trời lạnh, 10 phút trời nóng) trong 2 giờ với
500 ml nước, giữ ấm bên ngoài đảm bảo 80 0C hoặc sau 15 phút lại đun 2 phút. Rút
nước, vắt kiệt nước trong bã, lọc lấy nước thuốc rồi cô còn 150 ml. Thêm 30 – 50 g
đường, đun sôi cho tan. Người lớn uống mỗi lần 50 ml, 3 lần/ngày, liên tục đến khi
khỏi. Nếu đi lỏng mất nước cần cho uống nước cháo loãng (gạo + khoai lang 1 củ

nhỏ) pha muối mỗi ngày 500 – 600 ml nước cháo loãng.
Chữa lỵ trực trùng và ỉa chảy: dùng 12 g cỏ lào sắc lấy nước, pha thêm đường, chia
3 lần uống trong ngày.
Chữa vết thương mắt do xước hoặc loét giác mạc: ngọn cỏ lào và lá non 50 g rửa
thật sạch, giã nát trong cối chày sạch. Dùng 2 miếng gạc sạch chia thuốc gói thành 2
gói. Đặt vào bát sạch, cho vào nồi áp suất hấp (15 phút kể từ lúc thấy xì hơi). Nếu


5

không có nồi áp suất có thể hấp cách thuỷ 30 phút (kể từ lúc nước sôi đến lúc ngừng
đun). Mắt nạn nhân rửa sạch bằng nước muối 2% đun sôi để nguội, đắp gói thuốc
rồi băng lại để nạn nhân nằm ngửa. 12 giờ thay thuốc một lần. Nếu bệnh nhẹ thì 24
giờ là khỏi.
Phòng đỉa cắn: hái các bộ phận của cây cỏ lào giã vắt lấy nước bôi lên chân trước
mỗi lần xuống nước.
Chữa máu chảy không ngừng do bị đỉa, vắt cắn: lấy lá cỏ lào vò nát đắp vào vết bị
cắn.
Chữa viêm dạ dày: kết hợp các loại lá với tỷ lệ như sau: lá khôi 30 g, cỏ lào 20 g, dạ
cẩm 20 g, tam thất nam 5 g sắc nước uống hàng ngày. Cách dùng trên là kinh
nghiệm quý báu của đồng bào các dân tộc vùng cao Tây Bắc.
Chữa viêm đại tràng: cỏ lào khô 20 g, khổ sâm 10 g, bạch truật 25 g sắc nước uống
dùng hàng ngày
Hỗ trợ điều trị các vết thương phần mềm, bầm tím do tai nạn: lấy lá cỏ lào vò nát
đắp vào vết thương mỗi ngày một lần trong 3 – 4 ngày giúp giảm đau, chống sưng,
giúp vết thương nhanh lành rất tốt và hạn chế viêm nhiễm
Hỗ trợ điều trị bong gân : lá cỏ lào rửa sạch rồi giã nát, bó vào chỗ bị bong gân.
Chữa đau nhức xương: dùng cỏ lào 8 g tươi, dây đau xương 12 g, sao vàng, sắc
nước uống trong ngày
Ngoài công dụng chữa bệnh cỏ lào còn được sử dụng dùng làm phân xanh có tác

dụng diệt cỏ và làm giảm tuyến trùng ở trong đất hoặc bỏ lá đã vò nát xuống ruộng
1-2 ngày để trừ ấu trùng ký sinh trùng (thể xoắn ốc có móc câu ở đầu) phòng khi
xuống ruộng khỏi bị lây.
2.1.5. Các nghiên cứu liên quan đến cây cỏ lào
2.1.5.1. Các nghiên cứu trong nước


6

Năm 2001, Nguyễn Kim Phi Phụng và Nguyễn Ngọc Sương (Đại học Quốc Gia
Thành Phố Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu về cách tách chiết và cô lập các hợp chất
hữu cơ từ cây cỏ lào đã xác định được các hợp chất: ceryl alcohol, β-amyrine, βsitosterol, odoratin,...
Năm 2004, Lê Văn Hạc, Nguyễn Thị Thanh Hoài, Nguyễn Xuân Dũng đã nghiên
cứu về thành phần hóa học của tinh dầu của cây cỏ lào ở Nghệ An và Hà Tĩnh đã
phát hiện được 60 chất trong đó đã định danh được khoảng 37 chất như: gecmacren,
β-caryophyllene, geijerence,..
Năm 2005, Nguyễn Đức Cường, Nguyễn Minh Chính đã đánh giá độ ổn định và
xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc mỡ Eupolin từ cao lá cỏ lào kết quả đã điều
chế được thuốc mỡ.
Năm 2006, Ngô Quốc Luân , Lâm Thanh Phong và Nguyễn Ngọc Hạnh đã thực
hiện nghiên cứu một số kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu và
flavonoid trong cây cỏ lào cho kết quả cao chiết có khả năng kháng Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus,
Aspergillus niger, Fusarium oxyporum, Candida albicans, Saccharomyces
cerevisiae.
Năm 2010, Đào Thị Vân Trang, Đào Hùng Cường đã khảo sát điều kiện thích hợp
để chiết flavonoid từ cây cỏ lào với tỉ lệ nước với ethanol là 1:1, tỉ lệ nguyên liệu
với dung môi là 1:25, ở 850C trong 3 giờ.
2.1.5.2. Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 2000, Taiwo Oludare B. và các cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm, hạ

sốt và chống co thắt cơ trơn của cao chiết MeOH của lá cỏ lào trên loài chuột với
liều lượng 50 – 200 mg/kg thì có hiệu quả.
Năm 2001, Bouda H. và các cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng tinh dầu từ lá cỏ lào,
cỏ cứt lợn, cây trâm trên tỷ lệ chết của mọt thóc. Kết quả tinh dầu của cây cỏ lào
làm chết mọt thóc với tỷ lệ 6,78%.


7

Năm 2002, Zhang Maoxin đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng
nấm và côn trùng của tinh dầu cỏ lào. Kết quả tinh dầu cỏ lào kháng một số loài:
Pyricularia grisea, Phytophthora nicotianae, Fusarium axysporum.
Năm 2004, Apichart Suksamrarn và các cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu
hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh lao phổi và độc tính tế bào của các hợp chất
flavonoid từ hoa cỏ lào.
Năm 2005, Owoyele V.B., Adediji J.O. và Soladoyele A.O. đã khảo sát hoạt tính
kháng viêm của cao chiết cỏ lào trên chuột. Cho thấy với liều lượng 200mg/kg thì
có khả năng kháng nấm đến 80,5%.
2.2. Giới

thiệu các chủng nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm

2.2.1. Coprinus ephemeroides [17]
Giới:

Fungi

Ngành:

Basidiomycota

Lớp:

Agaricomycetes

Bộ:

Agaricales

Họ:

Psathyrellaceae

Chi:

Coprinus

Loài:

Coprinus ephemeroides

Hình 2.2. Nấm Coprinus ephemeroides

Mũ nấm nhỏ, khi non hình gần cầu, khi già mũ nấm bung dù trải phẳng và cuối
cùng cuộn vào phía trong mũ nấm. Đỉnh mũ nấm màu nâu vàng, xung quanh phủ
dày đặc hạt màu trắng và các hạt này sẽ chuyển sang màu nâu nhạt khi nấm già.
Giai đoạn đầu mũ nấm có màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu nhạt và cuối
cùng màu đen. Kích thước mũ nấm 0,4 – 0,6cm đường kính. Hệ sợi phiến nấm có
thành tương đối dày, trong suốt, không có vách ngăn ngang. Đường kính 3,0 –
3,3µm.

8

Cuống nấm màu trắng đục, dễ nát, rỗng giữa, có lông màu trắng rất mịn, cao 2,8 –
3,0 cm. Có vòng nấm tại vị trí giữa cuống nấm. Hệ sợi cuống nấm có thành mỏng,
có vách ngăn ngang. Đường kính 6,6 – 9,9 µm. Phiến nấm tự do, khi non màu trắng,
khi già lại có màu đen và tạo thành những đường dọc màu đen dưới mặt mũ nấm.
Hệ sợi phiến nấm có thành tương đối dày,không có vách ngăn ngang. Đường kính
3,0 – 3,3 µm. Bào tử đa số hình cầu, ít khi dạng elip, màng dày, màu nâu tối.
2.2.2. Lentinus squarrosulus [18]
Giới:

Fungi

Ngành:

Basidiomycota

Lớp:

Agaricomycetes

Bộ:

Polyporales

Họ:

Polyporaceae

Chi:

Lentinus

Loài:

Lentinus squarrosulus

Hình 2.3. Nấm Lentinus squarrosulus

Lentinus squarrosulus là một loài nấm ăn được thuộc nhóm nấm hoại sinh thối
trắng thường được tìm thấy ở vùng có khí hậu nhiệt đới. Sợi nấm phát triển tốt nhất
trên gelatin sucrose khoai tây với độ pH 6,5 − 7,0 được nuôi cấy trong điều kiện
sáng và tối xen kẽ ở khoảng 31 – 32 0C. Loài này có một số đặc điểm như tăng
trưởng sợi nấm nhanh chóng, và do đó có tiềm năng được sử dụng làm thực phẩm,
thực phẩm chức năng và dược phẩm. Theo các Nghiên cứu cho thấy Lentinus
squarrosulus chứa các hợp chất chống oxy hóa mạnh. Trong nấm chứa hàm lượng
protein cao (57,6%) và tổng chất béo thấp (0,5%) và cũng giàu magiê (0,4%), kali
(3,8%) và vitamin B3 (0,2%).


9

2.2.3. Paecilomyces formosus [16]
Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Sordariomycetes

Bộ:

Hypocreales

Họ:

Clavicipitaceae

Chi:

Paecilomyces

Loài:

Paecilomyces formosus

Hình 2.4. Nấm Paecilomyces formosus

Paecilomyces formosus là một loài nấm kí sinh cơ hội và hiện diện phổ biến trong
tự nhiên cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới. Các loài Paecilomyces dễ dàng được tìm
thấy ở đất tơi xốp, xác bã hữu cơ, thức ăn, tàn dư thực vật và trong các sản phẩm
thực phẩm. Loài này thường kí sinh trên các loài côn trùng. Ban đầu tơ nấm màu
trắng xong dần chuyển sang màu vàng nâu.

2.2.4. Vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans [3], [20]
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Lactobacillales

Họ:

Streptococcaceae

Chi:

Streptococcus

Loài:

Streptococcus mutans

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình 2.5. Vi khuẩn Streptococcus mutans
(nguồn: a/benh-sau-rang/1628-vikhuan-nao-gay-benh-sau-rang.html)


10

Streptococcus mutans là một giống của các cầu khuẩn Gram dương. Trái ngược với
sự phân chia của tụ cầu theo nhiều hướng khác nhau và tạo ra hình thể như chùm
nho của tế bào. đường kính khoảng 0,6 - 0,8 μm, xếp liên tiếp với nhau thành từng
chuỗi, dài ngắn khác nhau và có thể đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám.
Liên cầu, không có lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (+).
2.2.2.2 Đặc tính sinh hóa
Liên cầu, hiếu khí, kỵ khí tùy tiện và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều
chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường... Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều
kiện khí trường có thêm 5 - 10% CO 2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37 0C, một số
phát triển được ở 10 - 400C như liên cầu đường ruột.
Không có enzym catalase, không bị ly giải bởi muối mật, chuyển hóa nhanh đường
thành acid lactic và các acid hữu cơ khác.
2.2.2.3 Độc tố

2.2.2.4 Khả năng gây bệnh


11

Streptococcus mutans được xem là tác nhân chính gây ra sâu răng. Vi khuẩn này lên
men carbohydrate tạo ra acid, làm pH giảm xuống < 5, sự giảm pH liên tục có thể
đưa đến sự khử khoáng trên bề mặt răng, làm mất vôi ở các mô cứng của răng, khởi
phát quá trình sâu răng.

2.2.5. Salmonella typhi [3], [20]
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Grmmaproteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Salmonella

Loài:

Salmonella typhi

Hình 2.6. Vi khuẩn Salmonela typhi

(nguồn: />
2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

2.2.1.2 Đặc tính sinh hóa
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu
khí, chúng có thể sống ở nhiệt độ từ 5 – 460C và pH từ 3,7 – 9,5 nhưng phát triển tốt
nhất ở 370C và pH từ 6,8 – 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh
dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch
BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ.
Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfua nhưng không lên men lactose
(trừ Salmonella arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và


12

glucose. Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất: Brilliant green,
sodium lauryl sulfate, selenite,...
2.2.1.3 Sức đề kháng
Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 500C trong 1 giờ, 700C trong 15 phút, 1000C trong
5 phút. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10 0C trong 115
ngày, sống từ 4 – 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 120C.
Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng Salmonella tồn tại
khoảng 2 – 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống 1 – 2 tháng. Ánh sáng
mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước đục
sau 9 giờ. Salmonella bị diệt bởi clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3%
trong 15 – 20 phút.
2.2.1.4 Độc tố
Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố.
Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố
ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. Nội độc tố thường là lipopolysaccharide

(LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện
độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các
receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.
Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao và chỉ hình thành trong
điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố chủ yếu tác động vào thần kinh và
ruột.
2.2.1.5 Khả năng gây bệnh
Khi xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng đến niêm mạc ruột rồi đến hạch
lympho và phát triển ở đó. thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 - 48 giờ. Sau khi tăng
sinh, một số tự ly giải, phóng thích nội độc tố, số khác theo hệ lympho vào máu gây
nhiễm trùng máu. Triệu chứng ban đầu là sốt kèm theo lạnh run, sốt tăng dần kéo


13

dài trong 2 tuần. Tình trạng này làm bệnh nhân suy nhược, biếng ăn, mệt mỏi, gan
lách to, xuất huyết ngoài da, lượng bạch cầu giảm. Sau 3 tuần bệnh sẽ giảm. Trước
khi có kháng sinh biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và lủng ruột, tử vong
10 – 15%. Các biến chứng khác là viêm màng não, viêm tủy xương.
2.3. Cơ

chế đối kháng của các loại nấm

Cơ chế kháng của các loại nấm được chia làm ba loại: tiết kháng sinh làm chết loại
nấm cạnh tranh, cạnh tranh chất dinh dưỡng, kí sinh.
•

Tiết kháng sinh: chúng tiết ra một số chất có hoạt tính tương tự như chất
kháng sinh làm chết loại nấm đối kháng với nó. Sau khi giết chết loài nấm
đối kháng chúng có thể tiếp tục tiết ra một số chất để chuyển hóa chất dinh

dưỡng từ xác loài nấm đối kháng. Mỗi loại kháng sinh chỉ tác động vào một

loài nhất định.
• Cạnh tranh chất dinh dưỡng: các loài nấm khi phát triển trong cùng một môi
trường sống, sử dụng chung một nguồn dinh sẽ cạnh tranh về mặt dinh
dưỡng và không gian sống với nhau. Trong các loài cạnh tranh với nhau
thường sẽ có một loài phát triển mạnh hơn và lấn át các loài còn lại làm hạn
chế hoặc làm cho loài còn lại không thể phát triển và tiêu diệt luôn loài còn
lại. Trong mối quan hệ cạnh tranh này các loài đều bị ảnh hưởng bất lợi.
• Kí sinh: Một số loài có khả năng xâm nhập và kí sinh trên một loài khác để
hút chất dinh dưỡng hoặc nhờ vào loài nấm khác để tổng hợp và hấp thu chất
dinh dưỡng hoặc kí sinh và giết chết loài nấm khác để chúng có thể sinh
sinh trưởng tốt hơn. Loài nấm kí sinh tiết ra tác nhân kích thích hóa học hấp
dẫn nấm đối kháng sau đó nhận dạng đăc hiệu và xâm nhập vào loài nấm đối
kháng sau đó tơ nấm sẽ quấn quanh và tiết ra chất làm chết nấm đối kháng.


14

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Thời

gian và địa diểm nghiên cứu

Thời gian: 10/2018 – 2/2019
Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Phòng thí nghiệm chuyên đề 3 trường Đại học Tôn
Đức Thắng.
3.2. Vật

liệu nghiên cứu

Lá của cây cỏ lào (Chromolaena odorata) ở Tỉnh Bình Phước được thu hái vào
tháng 10.
3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
3.2.1.1. Hóa chất
Thuốc thử Folin, Na2CO3, lactophenol, Cồn 700 và 900, FeCl3 5%, chloroform +
H2SO4đđ, Pb(CH3COO)2 10%, NaOH 10%
3.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị: Bể điều nhiệt, nồi hấp, tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, bếp điện từ, microwave.
Dụng cụ: micropipet, pipet, becher, erlen, ống nghiệm, đĩa petri, giấy lọc, đầu tip,
đũa thủy tinh, bóp cao su, bông không thấm.
3.2.2. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và nấm
3.2.2.1. Tryptone casein soy agar (TSA)
Thành phần trong 1 L môi trường:
- Tryptone : 15 g
- Papaic digest of soybean meal: 5 g
- Sodium chloride: 5 g
- Bacteriological agar: 15 g
- pH của môi trường hoàn chỉnh ở 25 °C : 7,3 ± 0,2.
3.2.2.2. Môi trường Potato Glucose Agar (PGA)


15

Thành Phần Trong 1 L môi trường:
- Khoai tây: 200 g
- Glucose: 20 g
- Agar: 20 g
Cách pha: khoai tây thái nhỏ 1×2×1 cm bổ sung thêm nước đun sôi 30 phút lấy dịch
chiết. Bổ sung glucose, agar đun lên hòa tan hết đường và agar sau đó định mức

bằng nước cất đến 1000 mL. Đem đi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong vòng 30
phút.
pH khoảng 5,5 - 6
3.2.2.3 Môi trường Brain heart Infusion (BHI)
Thành Phần Trong 1 L môi trường:
- Brain heart infusion solids: 3,5 g
- Pancreatic digest of casein: 10 g
- Dextrose: 2 g
- Special peptone mixture: 12 g
- Yeast extract: 2 g
- Sodium chloride: 5 g
- pH khoảng 7,3
Bổ sung thêm 20 g agar/Lit để làm môi trường rắn.
3.3. Phương

pháp thí nghiệm

3.3.1. Chuẩn bị mẫu
Lá cây cỏ lào sau khi thu hái được loại bỏ lá hư, vàng và được rửa sạch sau đó đem
sấy ở nhiệt độ 500C đến khi độ ẩm của lá còn 11%. Lá sau khi sấy được đem đi xay
nhỏ (tăng hiệu suất tách chiết).
3.3.2. Sơ đồ quy trình tách dịch chiết


16

Lá tươi

Làm sạch

Sấy(độ ẩm 11%)

Xay nhỏ

Dung môi

Chiết dịch

Lọc

Dịch chiết

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách dịch chiết
3.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol có trong
dịch chiết
•

Chỉ tiêu theo dõi:

Hiệu quả của quá trình tách dịch chiết được thể hiện qua tổng hàm lượng
polyphenol
Cách xác định tổng hàm lượng polyphenol:
Công thức: PP =
PP: Tổng hàm lượng polyphenol (mgGAE/gdw)
X: Nồng độ acid gallic theo đường chuẩn (mg/mL)
V: Thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu (mL)
K: hệ số pha loãng


17

m: Khối lượng mẫu dùng để chiết dịch
W: độ ẩm mẫu
V: Thể tích dịch chiết dùng (mL)
Khảo sát các yếu tố: Loại dung môi, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi, thời gian
tách chiết, nhiệt độ thích hợp.
Chuẩn bị: Cân chính xác 1g mẫu cho mỗi nghiệm thức.
•

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi.

Mục đích: Xác định dung môi tối ưu để tách dịch chiết.
Thực hiện: Khảo sát trên hai loại dung môi nước và Ethanol (90%). Các yếu tố còn
lại được cố định. Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10, thời gian 30 phút, ở 50 0C.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol.
•

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu và dung môi.

Mục đích: Xác định tỷ lệ tối ưu để tách dịch chiết.
Thực hiện: Sau khi xác định được dung môi thích hợp, ta sử dụng dung môi đó cho
thí nghiệm này và tiếp tục cố định yếu tố nhiệt độ ở 50 0C, thời gian chiết là 30 phút
chỉ thay đổi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết lần lượt là 1:10, 1:15, 1:20. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại ba lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol.
•

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian.

Mục đích: Xác định thời gian tối ưu để tách dịch chiết.
Thực hiện: Sau khi xác định được dung môi và tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi
thích hợp ta sử dụng các yếu tố đó cho thí nghiệm này và tiếp tục cố định yếu tố


18

nhiệt độ ở 500C chỉ thay đổi thời gian chiết là 30 phút, 45 phút, 60 phút. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại ba lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol.
•

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.

Mục đích: Xác định nhiệt độ tối ưu để tách chiết.
Thực hiện: Sau khi xác định được dung môi, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi,
thời gian thích hợp ta sử dụng các yếu tố đó cho thí nghiệm này và chỉ thay đổi
nhiệt độ chiết là 500C, 600C, 700C. Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol.
3.3.4. Định tính sơ bộ một số hợp chất trong cây cỏ lào [6]
3.3.4.1. Flavonoid
Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cộng với vài giọt FeCl 3 5%. Xuất hiện kết tủa
lục, xanh đen hoặc nâu là có sự hiện diện của flavonoid.
3.3.4.2. Steroid vàTerpenoid
Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cộng thêm 1 mL chloroform sau đó cho thêm
1 mL H2SO4đđ xuất hiện màu đỏ đậm, xanh tím là có sự hiện diện của steroid và
terpenoid.
3.3.4.3. Tanin
Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cộng với vài giọt Pb(CH3COO) 2 10%. Xuất
hiện kết tủa là có sự hiện diện của tanin.

3.3.4.3. Coumarine
Cho vào ống nghiệm 1mL dịch chiết thêm 1 mL nước cất lắc đều, cho thêm vài giọt
NaOH 10% . Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng.


19

3.3.5. Phân lập nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm
Thu nhận các mẫu nấm từ một cơ sở trồng nấm rơm ở Huyện Bình Chánh
3.3.5.1. Nấm có quả thể
Quả thể sau khi thu nhận được cắt loại bỏ phần thừa và phần bề mặt được làm sạch
bằng cách lấy bông gòn thấm cồn 700 lau bề mặt ngoài của nấm.
Chuẩn bị môi trường PGA trước đó, lưỡi dao, đèn cồn, cồn khử trùng và cồn 960.
Ta thực hiện phân lập nấm trong tủ cấy
Phương pháp thực hiện:
Lau sạch tủ cấy hoặc nơi sẽ thực hiện phân lập, đốt đèn cồn ta tiến hành tách đôi
quả thể nấm dùng dao cấy đã được đốt khử trùng bằng cồn 96 0 để nguội tách lấy
phần thịt nấm ở giữa để mẫu tránh bị nhiễm. Đặt phần thịt nấm vừa mới được lấy ra
khỏi quả thể nấm đặt vào môi trường PGA trong đĩa petri đã được chuẩn bị trước
đó. Để ở nhiệt độ phòng 3 - 4 ngày.
Sau khi nấm mọc lên ta cấy chuyền sang môi trường PGA mới và tiếp tục cấy
chuyền đến khi tạo được giống thuần.
3.3.5.2. Nấm dạng sợi hoặc nấm mốc
Cân 10 g mẫu chứa nấm hoàn với 90 mL nước muối sinh lí, bỏ vào máy dập mẫu để
trộn đều mẫu với nước cất trong vòng 30 giây, ta thu được mẫu có nồng độ 10 -1. Từ
đó hút ra 1 mL dịch mẫu pha loãng với 9 mL nước muối sinh lí thu được mẫu có
nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-8. Hút 0,1 ml dịch cho vào đĩa PGA
đã chuẩn bị trước đó và tiến hành cấy trang. Để ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày.
Sau khi nấm mọc lên ta cấy chuyền sang môi trường PGA mới và tiếp tục cấy
chuyền đến khi tạo được giống thuần.

3.3.5.3. Phương pháp định danh


20

Sau khi phân lập tạo dược các giống nấm thuần. Các giống nấm được đem đi định
danh tại công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân
Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7, Tp.HCM. Kết quả định danh này dựa trên
phương pháp giải trình tự vùng ITS bằng kỹ thuật PCR, sau đó đem đi so sánh với
cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST để phân loại từng chủng nấm.
3.3.6. Khảo sát khả năng kháng nấm rơm của các loại nấm gây hại
Chuẩn bị:
Phân lập nấm rơm và các loại nấm gây hại, nuôi nấm đến khi tạo bào tử, dùng 5 mL
nước muối sinh lí đã hấp khử trùng hòa vào đĩa nấm đã tạo bào tử. Từ đĩa đó hút 1
mL sang ống nghiệm có 9 mL nước muối sinh lí đã chuẩn bị trước đó pha loãng
được nồng độ 10-1 tương tự ta pha loãng các nồng độ 10-2, 10-3,... Ta lấy dịch của các
nồng độ pha loãng đem đi đếm trên buồng đếm hồng cầu và chọn ống có nồng độ
đạt khoảng 108 CFU/mL.
Phương pháp thực hiện:
Trên cùng một đĩa môi trường PGA một bên ta đục lỗ hút 100 µL dịch nấm rơm có
nồng độ 108 CFU/mL cho vào lỗ, một bên là 100 µL dịch của các loài nấm gây hại
cũng có nồng độ 108 CFU/mL rồi đem đi ủ ở 300C cho tơ nấm phát triển. Xem kết
quả sau 4 – 5 ngày.
Mẫu đối chứng ta chỉ cấy tơ nấm rơm và cũng đem ủ ở 300C.
3.3.7. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây cỏ lào
Chuẩn bị:
Môi trường: Pha môi trường TSA và PGA hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút, sau
đó đổ đĩa, để nguội ở nhiệt độ phòng, mỗi đĩa khoảng 15 ml.
Đĩa giấy lọc: Cắt giấy lọc thành các đường tròn có đường kính 6 mm, đem hấp khử
trùng ở 121oC trong 15 phút.

21

Dịch khuẩn: Dùng que cấy vòng lấy một lượng sinh khối vi khuẩn được nuôi cấy
trên môi trường phân lập hòa vào 5 ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng ở
121oC, lắc đều rồi đem so độ đục với ống Mc.Farland (có độ đục tương đương 10 8
CFU/ml). Nếu chưa đạt độ đục ta tiếp tục pha loãng đến khi ống nghiệm chứa dịch
khuẩn có độ đục cùng với ống Mc.Farland.
Phương pháp thực hiện:
Cấy vi khuẩn lên môi trường: Dùng micropippet hút 0,1 ml dịch vi khuẩn bơm vào
đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Dùng que cấy trang, trang đều vi khuẩn trên mặt
thạch, tiếp tục cho đến khi mặt thạch khô.
Dùng kẹp vô trùng gấp các đĩa giấy đã thấm dịch chiết, đặt cố định lên trên bề mặt
thạch, sau đó úp ngược đĩa đem ủ ở 37oC, ghi nhận kết quả sau 24 giờ.
Đối chứng âm là đĩa giấy thấm nước cất.
Lưu ý:
- Không đặt các đĩa kháng sinh quá sát nhau và phải cách thành đĩa petri 1 cm.
- Đối chứng âm là mẫu nước cất.
Quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính nhạy cảm của
chất thử, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của dịch chiết. Mức độ kháng khuẩn
được đánh giá theo T.Johnson và cộng sự (1995) như sau:
d ≤ 11 mm: kháng khuẩn thấp
11 ≤ d ≤ 15 mm: kháng khuẩn trung bình
d ≥ 16 mm: kháng khuẩn cao
3.3.8. Khảo sát khả năng kháng nấm gây hại của dịch chiết từ cây cỏ lào
Chuẩn bị:
Môi trường: Pha môi trường PGA hấp khử trùng 121 0C trong 15 phút, sau đó đổ
đĩa, để nguội ở nhiệt độ phòng, mỗi đĩa khoảng 15 mL.

22

Dịch nấm dại: Ta nuôi trên môi trường PGA thạch nghiêng đến khi nấm tạo bào tử
ta lấy 5 mL nước muối sinh đã được hấp khử trùng ở 121oC cho vào ống nghiệm lắc
đều rồi đem so độ đục với ống Mc.Farland (có độ đục tương đương 10 8 CFU/ml).
Nếu chưa đạt độ đục ta tiếp tục pha loãng đến khi ống nghiệm chứa dịch có độ đục
cùng với ống Mc.Farland.
Phương pháp thực hiện:
Cấy nấm lên môi trường: Dùng micropippet hút 0,1 ml dịch chứa bào tử nấm bơm
vào đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Dùng que cấy trang, trang đều nấm trên mặt
thạch, tiếp tục cho đến khi mặt thạch khô. Đem ủ ở 300C trong 2 ngày.
Dùng kẹp vô trùng gấp các đĩa giấy đã thấm dịch chiết, đặt cố định lên trên bề mặt
thạch, sau đó úp ngược đĩa đem ủ ở 300C, và ghi nhận kết quả.
Đối chứng âm là đĩa giấy thấm nước cất.
Quan sát và ghi nhận đường kính vòng kháng nấm để xác định tính nhạy cảm của
chất thử. Mức độ kháng nấm được đánh giá theo T.Johnson và cộng sự (1995) như
sau:
d ≤ 11 mm: kháng nấm thấp
11 ≤ d ≤ 15 mm: kháng nấm trung bình
d ≥ 16 mm: kháng nấm cao
3.3.9. Phương pháp thống kê
Các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA. Số liệu
được phân tích thống kê bằng ANOVA (Duncan test với alpha = 0,05) bằng phần
mền SAS 9.0.


23

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1. Kết

quả khảo sát khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hàm lượng

polyphenol có trong dịch chiết
4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến tổng hàm lượng
polyphenol trong dịch chiết
Nghiệm thức

Loại dung môi

1
2

Nước
Ethanol (96%)

Tổng hàm lượng polyphenol
(mgGAE/gdw)
28,73 ± 0,63
14,29 ± 0,36

Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến dịch chiết cây cỏ lào

Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của dung môi đến tổng hàm
lượng polyphenol trong dịch chiết
Nhận xét: kết quả khảo sát cho thấy loại dung môi ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng
polyphenol trong quá trình chiết dịch. Với dung môi là nước thì hàm lượng
polyphenol thu được là 28,73 ± 0,63 (mgGAE/gdw), ethanol (96%) là 14,29 ± 0,36
(mgGAE/gdw). Qua kết quả cho thấy trong cùng điều kiện về nhiệt độ và thời gian

tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu thì với dung môi là nước ta sẽ thu được dịch chiết
có hàm lượng polyphenol tốt hơn. Do đó ta sử dụng nước cất làm dung môi là thích
hợp nhất.


24

4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi đến tổng hàm
lượng polyphenol trong dịch chiết
Nghiệm thức

Tỷ lệ (g/mL)

1
2
3

1:10
1:15
1:20

Tổng hàm lượng polyphenol
(mgGAE/gdw)
28,73 ± 0,63
31,94 ± 0,73
41,46 ± 0,41

Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến dịch chiết
cây cỏ lào

Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu với dung
môi đến tổng hàm lượng polyphenol trong dịch chiết
Nhận xét: Trong cùng điều kiện, khi ta thay đổi tỉ lệ nguyên liệu với dung môi lần
lượt là 1:10, 1:15, 1:20 thì hàm lượng polyphenol ở tỉ lệ 1:20 là cao nhất với hàm
lượng là 41,46 ± 0,41 (mgGAE/gdw), ở tỉ lệ 1:15 thì hàm lượng polyphenol là 31,94
± 0,73 (mgGAE/gdw) và thấp nhất ở tỉ lệ 1:10 với hàm lượng là 28,73 ± 0,63
(mgGAE/gdw).Vì ở tỉ lệ 1:10 và tỉ lệ 1:15 không đủ lượng dung môi để hòa tan các
hợp chất có trong mẫu. Như vậy ta sử dụng tỉ lệ 1:15 để chiết dịch là thích hợp nhất.


25

4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến tổng hàm lượng polyphenol
trong dịch chiết
Nghiệm thức
1
2
3

Thời gian
(phút)
30
45
60

Tổng hàm lượng polyphenol
(mgGAE/gdw)
41,46 ± 0,41
67,67 ± 0,84
60,84 ± 0,87

Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của thời gian đến dịch chiết cây cỏ lào

Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến tổng hàm
lượng polyphenol trong dịch chiết
Nhận xét: Ở cùng điều kiện khi ta thay đổi thời gian chiết thì hàm lượng polyphenol
ở 45 phút với hàm lượng là 67,67 ± 0,84 (mgGAE/gdw), ở 60 phút thì hàm lượng
thu được là 60,84 ± 0,87 (mgGAE/gdw) tổng polyphenol ở 45 phút và 60 phút đều
tăng với hàm lượng thu được ở 30 phút là 41,46 ± 0,41 (mgGAE/gdw). Vì Chiết ở
thời gian là 30 phút có thể không đủ thời gian để tách các hợp chất, còn ở 60 phút
thì các hợp chất khi được li trích ra mà để ngoài môi trường thì hoạt tính sẽ bị giảm.
Nên ta chọn thời gian thích hợp để tách chiết là 45 phút.
4.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hàm lượng polyphenol
trong dịch chiết
Nghiệm thức

Nhiệt độ (0C)

Tổng hàm lượng polyphenol