Tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ne
an
dP

ha
r

NGUYỄN HUY HOÀNG

ma
c

y,

KHOA Y DƢỢC

ed

ici

TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG
PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG
THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

ho
ol

of
M

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA

Co
p

yri

gh
t@

Sc

KHÓA 2012-2018

Hà Nội - 2018


VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ne
an
dP

ha

r

NGUYỄN HUY HOÀNG

ma
c

y,

KHOA Y DƢỢC

ed

ici

TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG
PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG
THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

ho
ol
of
M

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA
KHÓA 2012-2018

ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
TS. BS. Trần Quốc Hùng

Co
p

yri

gh
t@

Sc

Ngƣời hƣớng dẫn:

Hà Nội - 2018


VN
U

LỜI CÁM ƠN

y,

Tôi xin đặc biệt gửi lời cám ơn đến ThS. Phạm Thị Hồng Nhung đã trực
tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và

ma
c

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin gửi lời cảm tạ sâu sắc nhất tới TS. BS.
Trần Quốc Hùng, Khoa ung bướu Bệnh viện 198 Bộ Công an đã tạo điều kiện giúp

ha
r

tôi thu thập số liệu nghiên cứu và cho tôi những góp ý chuyên môn vô cùng giá trị.

ne
an
dP

Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Khoa Y
Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CS.15.09. Tôi cũng xin bày tỏ
lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Bộ môn
Y dược học cơ sở, Khoa Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn ủng hộ và
nhiệt tình giúp đỡ cho tôi có điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu khoa
học tại đây.

ici

Tôi xin cảm ơn các bạn sinh viên Bùi Xuân Nhật, Nguyễn Thùy Linh và
Kiều Hồng Nhung đã hỗ trợ tôi thực hiện các nghiên cứu và cho tôi những góp ý
chân thành khi viết khóa luận.

Co
p

yri

gh
t@

Sc

ho
ol
of
M

ed

Để có được sự thành công của khóa luận này, tôi xin cảm ơn gia đình đã
quan tâm động viên, khuyến khích giúp tôi vững vàng vượt qua những khó khăn
trong quá trình học tập và nghiên cứu.


Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid)

bp
CN1

Cặp bazơ nitơ (Base pair)
Hội chứng Crigler – Najar type 1

CN2
dNTP
DHPLC

Hội chứng Crigler – Najar type 1
Deoxyribo Nucleic triphosphat
Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high perfomance liquid

chromatography)

EDTA

Axit ethylene diamine tetraacetic (Ethylene Diamine Tetra Acetic
Acid)

HRM

Kĩ thuật phân tích phân giải cao nhiệt độ nóng chảy (High resolution
melt)

kb
NCBI

Kilobazơ (=1000 bp)
Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc Gia – Mỹ (National
Center for Biotechnology Information)

OD
PCR
UDP
UGT
UGT1A1

Mật độ quang học (Optical density)
Phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction)
Uridine 5’ diphosphat
Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase
Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1

UGT1A1
RFLP

Gen mã hóa cho Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1
Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length
polymorphism)
Đa hình di truyền đơn nucleotit (Single nucleotide polymorphism)
Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation
polymorphism)

yri

ma
c

ha
r

ne
an
dP

ici

ed

ho
ol
of

M

Sc

gh
t@

TAE

y,

ADN

SNP
SSCP

Co
p

VN
U

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Đệm Tris base/ axit acetic/ EDTA


VN
U

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

ma
c

y,

Bảng 1. Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến ...................................................... 4
Bảng 2. Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu mô đúc paraffin bằng phương pháp đo
mật độ quang OD ......................................................................................... 22

ha
r

Bảng 3. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................................... 25
Bảng 4. Đa hình vùng promoter của UGT1A1 ở 38 bệnh nhân nghiên cứu ............. 27

Co
p

yri

gh
t@

Sc

ho

ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

Bảng 5. Chỉ định xét nghiệm UGT1A1*28 khi sử dụng một số loại thuốc .............. 30


VN
U

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

ma
c

y,

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các protein UGT .................................................. 2
Hình 1.2 Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT ................................................ 3
Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 ở người ...................................................................... 3

ha
r

Hình 1.4 Tỉ lệ mắc và tử vong của 10 ung thư phổ biến nhất năm 2012 .................... 9
Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan .......................... 10
Hình 1.6 Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến kiểu

ne
an
dP

gen UGT1A1 .............................................................................................. 11
Hình 1.7 Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 ............... 15
Hình 1.8 Kết quả điện di của kiểu gen (TA)6/(TA)7 và (TA)6/(TA)8 sử dụng gel
agarose 3% ................................................................................................. 15
Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica đơn giản ................................... 17
Hình 2.2 Quy trình PCR ........................................................................................... 19
Hình 3.1 Điện di trên gel agarose 0.7% sản phẩm tinh sạch ADN từ mẫu máu ..... 21

ed

ici

Hình 3.2 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi PCR
nhân vùng promoter của UGT1A1 ............................................................ 23
Hình 3.3 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nồng độ ADN

ho
ol

of
M

PCR nhân vùng promoter của UGT1A1 .................................................... 24

Co
p

yri

gh
t@

Sc

Hình 3.4 Điện di trên gel agarose 1.5% sử dụng quy trình PCR tối ưu nhân vùng
promoter của UGT1A1 chạy với 10 mẫu bệnh nhân ................................. 24
Hình 3.5 Kết quả giải trình tự kiểu gen đồng hợp (TA)6/(TA)6 ............................... 25
Hình 3.6 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 ................................................ 26
Hình 3.7 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6................................................ 26
Hình 3.8 Tần số các alen UGT1A1*28, UGT1A1*36 và UGT1A1*6 ở một số quần
thể ............................................................................................................... 28


VN
U

MỤC LỤC

Co

p

yri

gh
t@

Sc

ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

ha
r

ma
c

y,

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................2
1.1. Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 ......................2
1.2. Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A ..............................................5
1.2.1 Hội chứng Gilbert ...........................................................................................5
1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar ..............................................................................6
1.3. Đa hình di truyền UGT1A1*28 ......................................................................7
1.4. Ung thƣ đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình di
truyền UGT1A1*28....................................................................................................8
1.5. Các phƣơng pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 ....................11
1.5.1 Giải trình tự ADN .........................................................................................11
1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation
polymorphism - SSCP): .........................................................................................12
1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis): ...............................................13
1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length
polymorphism – RFLP) .........................................................................................13
1.5.5 Real – time PCR ...........................................................................................14
1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy ..........................................................................14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................16
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................16
2.2. Hóa chất .........................................................................................................16
2.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu ..................................................................16
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................17
2.4.1. Tách chiết ADN tổng số...............................................................................17
2.4.2. Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số ................................18
2.4.3. Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1 ............................18
2.4.4. Xác định kiểu gen UGT1A1*28 bằng phương pháp giải trình tự ................20
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................21
3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số .......................................................................21

3.3 Kết quả giải trình tự kiểu gen UGT1A1*28 ....................................................25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


VN
U

MỞ ĐẦU

Co
p

yri

gh
t@

Sc

ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

ha
r

ma
c

y,

Ung thư hiện đang ảnh hưởng rất nhiều tới sức khỏe và chất lượng cuộc
sống. Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư đứng hàng thứ 2 trong các nguyên nhân tử
vong, với khoảng 14 triệu người mắc mới vào năm 2012 và tiếp tục có xu hướng
tăng lên. Ung thư đại trực tràng là một trong những ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ
mắc mới đứng hàng thứ tư và tỉ lệ tử vong cao thứ năm ở cả hai giới [33]. Mặc dù
đã có các tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị, tuy nhiên tỉ lệ bệnh nhân ung thư
đại trực tràng tiến triển đến giai đoạn muộn (giai đoạn IV) vẫn còn cao. Một trong
các thuốc điều trị chính ở giai đoạn muộn là Irinotecan, nhưng việc điều trị còn gặp
nhiều khó khăn, đặc biệt là các tác dụng không mong muốn của thuốc.
Thời điểm hiện tại cá thể hóa điều trị đang là một xu hướng tất yếu và ngày
càng ảnh hưởng sâu rộng đến quá trình điều trị ung thư đại trực tràng của các bác sĩ.
Một trong các công cụ rất hữu ích với các bác sĩ lâm sàng trong việc đối đầu với
ung thư đại trực tràng chính là sinh học phân tử.
Các nghiên cứu đã chỉ ra đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1
có ảnh hưởng lớn đến quá trình chuyển hóa của irinotecan, liên quan chặt chẽ đến
hiệu quả điều trị và mức độ trầm trọng do các tác dụng không mong muốn của
thuốc. Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug
Administration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen

UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng
kiểu gen[23]. Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về gen UGT1A1 cũng như
đa hình di truyền UGT1A1*28 ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài
“Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1 ở
bệnh nhân ung thư đại trực tràng”. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp một công cụ hỗ
trợ đắc lực cho các bác sĩ không chỉ trong việc điều trị ung thư đại trực tràng mà
còn trong việc chẩn đoán một số bệnh lý di truyền như hội chứng Gilbert hay hội
chứng Crigler – Najar.
Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng
promoter của gen UGT1A1.
Nội dung nghiên cứu:
1. Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1
trên mẫu mô bệnh phẩm đúc trong paraffin và mẫu máu.
2. Áp dụng quy trình phân tích gen trên các mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện
198. Bước đầu xác minh tần số alen và tần số kiểu gen của đa hình di truyền
vùng promoter thuộc gen UGT1A1 trong nhóm mẫu nghiên cứu.

1


VN
U

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1

ma
c

y,

Uridine 5’ diphosphat glucurosyltransferases A1 (viết tắt là UGT1A1) là một
thành viên trong họ enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferase (viết tắt

ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

ha
r

là UGT), đóng vai trò xúc tác cho các hoạt động chuyển hóa cũng như giải độc của
gan. UGT là một họ lớn bao gồm 22 loại protein, được chia làm 5 họ và 6 phân
đoạn căn cứ vào cơ sở giải trình tự gen cấu trúc (Hình 1.1) [25].

Hình 1.1. Cây phát sinh chủng loại các protein UGT [25]
Các protein UGT chủ yếu xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl của

Sc

axit uridine 5’ diphosphat glucuronic đến một cơ chất phù hợp hình thành các chất
hòa tan trong nước. Các cơ chất được gắn nhóm glucosyl bao gồm các chất không

gh
t@

phân cực kích thước phân tử nhỏ như các steroit, bilirubin, các hormon và các
thuốc. Phản ứng chuyển hóa xúc tác bởi UGT được mô tả trong Hình 1.2 [25].
Trong các UGT, các protein thuộc phân họ UGT1A được quan tâm hơn cả, đóng vai
trò then chốt trong việc chấm dứt các hoạt động sinh học và tăng cường việc đào

yri

thải các chất không phân cực của thận. Chính vì vậy, chúng giúp duy trì nồng độ

Co
p

các chất và đảm bảo cân bằng nội môi [25]. UGT1A tập trung chủ yếu ở gan và
đường ống tiêu hóa (dạ dày, ruột non, đại tràng). Bên cạnh đó còn ghi nhận sự biểu
hiện của UGT1A ở phổi, buồng trứng, tinh hoàn, tuyến vú và tuyến tiền liệt [17].
2


VN
U
ma
c

y,

Uridine 5’ diphosphat glucuronic

Nucleophin

ne
an
dP

ha
r

Enzym UGT

Gốc glucuronyl

Uridine 5’ diphosphat

ici

Hình 1.2. Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT
UGT1A1 được mã hóa bởi gen UGT1A1 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (2q37),

ed

gồm có 13 exon chia làm 2 nhóm. Nhóm 1 bao gồm 9 exon được kí hiệu là A1, A3,
A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10). Nhóm 2 gồm bốn exon, được kí hiệu từ 2 đến 5

ho
ol

of
M

(Hình 1.3). 9 exon nhóm 1 mã hóa cho vị trí liên kết với cơ chất với enzym và đều
có một promoter riêng. Sau phiên mã tổng hợp mARN, mỗi exon nhóm 1 nối với 4
exon nhóm 2, tạo ra các chuỗi mARN khác nhau, từ đó tạo thành các polypeptit

yri

gh
t@

Sc

khác nhau [2].

Co
p

Hình 1.3. Sơ đồ locus UGT1A1 ở người. Mỗi gen UGT1A bao gồm một exon
nhóm 1 (A) và 4 exon nhóm 2 phía sau (exone 2-5). Các exon nhóm 1 luân phiên
nối với 4 exon nhóm 2 phía sau tạo thành 9 loại protein khác nhau [25]
3


VN
U

Trong số các exon này, gen UGT1A1 mã hóa cho enzym UGT1A1 được
quan tâm nhiều hơn cả vì những ảnh hưởng của nó với thực tiễn lâm sàng. Hơn 100

đa hình di truyền của UGT1A1 đã được mô tả, một vài trong số chúng làm tăng,

y,

giảm hoạt động hoặc bất hoạt enzym UGT1A1 (Bảng 1) [25].

UGT1A1*1

Protein bị

thay đổi

thay đổi

Kiểu dại
Dịch khung/

mất nu 878 –

mất acid

890

amin

UGT1A1*3

1124 C -> T

UGT1A1*4

Exon

Bệnh
liên

CN1

S375F

Sai nghĩa

4

CN1

1069 C -> T

Q357X

Vô nghĩa

3

CN1

UGT1A1*5

991 C -> T

Q331X

Mất đoạn

2

CN1

UGT1A1*6

221 G -> A

G71R

Sai nghĩa

1

Gilbert

UGT1A1*11

923 G -> A

G308E

Sai nghĩa

2

CN1

UGT1A1*12

524 T -> A

L175Q

Sai nghĩa

1

CN2

Mất đoạn

1

CN1

UGT1A1*14
UGT1A1*15
UGT1A1*16
UGT1A1*21

508- 510 mất

F170 mất

ho
ol
of
M

UGT1A1*13

ed

2

ici

quan

Mất đoạn

UGT1A1*2

nu

acid amin

826 G -> C

G276R

Sai nghĩa

1

CN1

529 T -> C

C177R

Sai nghĩa

1

CN2

1070 A -> G

O357R

Sai nghĩa

3

CN1

1223 thêm G

Dịch khung

Dịch khung

4

CN2

875 C -> T

A292V

Sai nghĩa

2

CN1

UGT1A1*26

973 mất G

Dịch khung

Dịch khung

2

CN2

UGT1A1*27

686 C -> A

P229Q

Sai nghĩa

1

Gilbert

UGT1A1*28

TAA(TA)7

UGT1A1*29

1099 C -> G

gh
t@

Sc

UGT1A1*22

yri
Co
p

ne
an
dP

877 T -> A /

Loại đột biến

ha
r

Alen

Nucleotit bị

ma
c

Bảng 1. Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến [25].

Thêm trình tự
ở vùng lặp lại
R367G

Sai nghĩa

Ghi chú : CN1: Hội chứng Crigler – Najar type 1
CN2: Hội chứng Crigler – Najar type 2
Gilbert: Hội chứng Gilbert
4

Promoter Gilbert
4

Gilbert


VN
U

Như Bảng 1 thống kê, đa số các alen mới được phát sinh chủ yếu là các dạng

biến đổi do thay thế nucleotit (đa hình di truyền đơn nucleotit), thêm và mất một

y,

đoạn trình tự ADN. Trong số các đa hình trên, phần lớn gây ảnh hưởng đến hoạt
động của enzym UGT1A, dẫn đến các rối loạn bệnh lý như hội chứng Crigler –

1.2. Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A

ha
r

1.2.1 Hội chứng Gilbert

ma
c

Najar type 1,2 hay hội chứng Gilbert.

Hội chứng Gilbert là một tình trạng di truyền thường gặp, đặc trưng chủ yếu
bởi tăng bilirubin không liên hợp trong máu, không có bệnh lý về tế bào gan hoặc

ne
an
dP

huyết tán. Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1901 bởi Augustin

ed

ici

Gilbert và Pierre Lereboullet [10]. Nguyên nhân của bệnh được xác định là do sự
suy giảm hoạt động của enzym UGT1A, có liên quan mật thiết đến đa hình di
truyền UGT1A1*28.
Những triệu chứng điển hình của hội chứng Gilbert có thể kể đến như vàng
da nhẹ liên tục ở thanh thiếu niên, billirubin gián tiếp tăng sau mất nước, tiêu chảy,
kinh nguyệt. Các triệu chứng không điển hình khác đau bụng, đau dạ dày, mệt mỏi,
sụt cân [10].
Về vàng da, trong hội chứng Gilbert cơ thể sản xuất một lượng bilirubin tự

ho
ol
of
M

do cao hơn bình thường trong máu và không gây ra hậu quả nghiêm trọng. Vàng da

gh
t@

Sc

có thể xuất hiện sau khi bệnh nhân bị stress, nhiễm trùng, gắng sức,…, nhưng
thường là không có triệu chứng [26]. Cũng đã có các báo cáo cho thấy hội chứng
Gilbert góp phần thúc đẩy sự khởi đầu của bàng da sơ sinh, đặc biệt là trong trường
hợp tăng tan máu như trong bệnh thiếu enzym G6PD. Tình trạng này có thể trở nên
đặc biệt nghiêm trọng nếu không nhanh chóng điều trị nồng độ bilirunbin tăng cao
trong máu, gây ra ảnh hưởng về thần kinh không thể phục hồi trong bệnh vàng da
nhân não [13].
Về khả năng chuyển hóa thuốc, những bất thường liên quan đến enzym
UGT1A1 trong hội chứng Gilbert cũng ảnh hưởng đến vài khả năng của gan trong
giải độc thuốc của gan. Hội chứng Gilbert có liên quan đến tình trạng tiêu chảy

Co
p

yri

nặng và sự giảm bạch cầu trung tính ở những bệnh nhân được điều trị với Irinotecan
(một thuốc điều trị ung thư), là cơ chất của UGT1A1. Paracetamol không được
chuyển hóa bởi UGT1A1 nhưng enzym chuyển hóa nó cũng có bất thường trong
hội chứng Gilbert. Nên các BN có hội chứng Gilbert có nguy cơ ngộ độc
paracetamol cao hơn.

5


VN
U

Hội chứng Gilbert có ảnh hưởng đến hệ Tim mạch. Bilirubin có đặc tính

chống oxi hóa mạnh trong ống nghiệm, làm giảm quá trình oxy hóa huyết tương [8].
Một vài phân tích cho thấy những người bị hội chứng Gilbert và đái tháo đường có
nguy cơ bị các bệnh mạch vành thấp hơn người bình thường [16].

ma
c

y,

Hội chứng Gilbert là một tình trạng lành tính, do vậy không cần một chế độ
quản lý, điều trị đặc biệt và không cần bất kỳ một chế độ ăn kiêng nào.
1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar

ha
r

Hội chứng Crigler-Najjar (CNS) là một rối loạn di truyền hiếm gặp gây rối

ne
an
dP

loạn chuyển hóa bilirubin. Hội chứng Crigler-Najjar được phân thành 2 loại. Type 1
được mô tả bởi Crigler và Najjar vào năm 1952 có liên quan đến tăng bilirubin gián
tiếp ở trẻ sơ sinh sơ sinh và vàng da nhân. Type 2 (còn gọi là hội chứng Arias) được
Arias phát hiện vào năm 1962, với mức bilirubin trong máu thấp hơn và đáp ứng
với điều trị phenobarbital [32].
Hội chứng CNS liên quan đến sự thiếu hụt enzym UGT do đột biến trong
trình tự mã hóa enzym UGT. Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, cơ thể gần như

ho
ol
of
M

ed

ici

thiếu hụt hoàn toàn enzym UGT, dẫn đến nống độ bilirubin trong máu sau sinh
cao (có thể lên đến 50 mg/dl). Trong khi đó, Crigler-Najjar type 2 có nồng
bilirubin thấp hơn (khoảng 20 mg/dl). Đối với các trường hợp này, điều
phenobarbital có thể thúc đẩy sự hoạt động của enzym UGT, làm giảm nồng
bilirubin trong máu khoảng 25% [32].

rất
độ
trị
độ

gh
t@

Sc

Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, bệnh nhân sẽ có biểu hiện vàng da
kéo dài sau sinh. Đối với type 2, vàng da có thể không biểu hiện cho đến khi bệnh
nhân đến độ tuổi thiếu niên. Hậu quả nghiêm trọng nhất của tăng bilirubin máu là
vàng da nhân và tình trạng này xảy ra ở hầu hết bệnh nhân type 1 không được điều

trị, đặc biệt trong những ngày đầu sau sinh. Biến chứng vàng da nhân não do tăng
bilirubin hiếm gặp ở type 2, nhưng có thể bị thúc đẩy bởi các yếu tố nhiễm trùng,
thuốc mê, hay sử dụng thuốc. Biểu hiện lâm sàng của vàng da nhân gồm giảm
trương lực cơ, điếc, liệt vận nhãn, hôn mê và tử vong.
Với các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler-Najjar type 2 có thể không cần

Co
p

yri

điều trị hay được điều trị bằng phenobarbital. Ngược lại, khi xuất hiện biến chứng
vàng da nhân trên bệnh nhân type 1, cần được nhanh chóng điều trị nhằm hạn chế
các di chứng thần kinh. Các thuốc phenobarbital (luminal, barbita) được sử dụng để
hạn chế các di chứng thần kinh trong bệnh nhân type 1và điều trị các triệu chứng
thần kinh đối với type 2 [19].

6


VN
U

Điều trị khẩn biến chứng não do tăng bilirubin bao gồm truyền huyết tương,
nhằm loại bỏ albumin đã bão hòa bilirubun trong máu, đồng thởi cung cấp protein
tự do để gắn kết với bilirubin trong mô, giảm nồng độ bilirubun [15].
Truyền huyết tương cần điều trị kèm chiếu đèn trong thời gian dài, giúp

ma
c

y,

chuyển đổi bilirubin gián tiếp sang bilirubin trực tiếp để có thể thải ra theo nước
tiểu. Sử dụng canxi photphat cũng có thể hỗ trợ cho liệu pháp chiếu đèn [15].
1.3. Đa hình di truyền UGT1A1*28

ha
r

Trong số các đa hình di truyền của UGT1A1, đa hình di truyền UGT1A1*28
phổ biến và được quan tâm nhiều nhất. UGT1A1*28 gây suy giảm hoạt tính của

ne
an
dP

enzym UGT1A1, dẫn đến các rối loạn về chuyển hóa cũng như chức năng giải độc

ed

ici

của gan với các thuốc. UGT1A1*28 được ghi nhận có liên quan đến nhiều bệnh lý
chuyển hóa và sự gia tăng những tác dụng không mong muốn của các thuốc, đặc
biệt là irinotecan trong điều trị ung thư đại trực tràng.
UGT1A1*28 là đa hình di truyền với sự lặp lại 7 lần của trình tự thymineadenine (TA) ở vùng promoter của UGT1A1[17]. Ở dạng kiểu dại trình tự (TA) chỉ
lặp lại 6 lần và được kí hiệu là alen UGT1A1*1. Độ dài của trình tự TA ở vùng
promoter của exon UGT1A1 liên quan chặt chẽ đến hoạt tính của enzym UGT1A1.
Chính vì vậy đa hình UGT1A1*28 đã được ghi nhận gây giảm hoạt tính của enzym

ho
ol
of
M

UGT1A1. Người mang 1 alen UGT1A1*28 có hoạt tính enzym UGT1A1 giảm 25%
và giảm đến 70% ở người có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28 (mang 2 alen

gh
t@

Sc

UGT1A1*28) [5],[6]. Tần số xuất hiện của alen UGT1A1*28 dao động nhiều ở các
quần thể khác nhau: 26% đến 31% ở quần thể người da trắng, 42% đến 56% ở quần
thể người Châu Phi và 9% đến 16% ở các quần thể người Châu Á.
Ảnh hưởng lớn nhất của alen UGT1A1*28 liên quan đến quá trình chuyển
hóa của một số thuốc và tình trạng tăng nồng độ bilirubin không liên hợp (bilirubin
gián tiếp). Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của nhân hem trong hemoglobin của
hồng cầu, chủ yếu được tạo ra ở hệ thống tổ chức liên võng, ngoài hệ thống tuần
hoàn. Đây là một chất không tan trong nước có ái lực cao với lipid và albumin của
huyết thanh. Do có ái lực cao với lipid của màng tế bào nên sự kết hợp với lipid

Co
p

yri

màng của bilirubin gây hư hại chức năng màng tế bào đặc biệt của hệ thống thần

kinh. Bilirubin được vận chuyển vào máu và kết hợp với albumin của huyết thanh,
sau đó được vận chuyển đến gan và được giải phóng nhanh chóng khỏi albumin. Ở
tế bào gan, bilirubin được glucuronic hóa nhờ các UGT tạo thành bilirubin liên hợp,
là chất tan trong nước, dễ dàng đào thải qua phân và nước tiểu [2].

7


VN
U

Hoạt tính của enym UGT, đặc biệt là UGT1A1 suy giảm sẽ làm tăng nồng độ
bilirubin không liên hợp trong máu, gây ra tình trạng vàng da. Đột biến

UGT1A1*28 đã được quan sát thấy ở các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler – Najar
type I và được ghi nhận là dấu hiệu của hội chứng Gilbert [12].

ma
c

y,

Nhiều thuốc khác đã được xác định là chất ức chế hoạt động của enzym
UGT1A1 như Indinavir (kháng retrovirus, sử dụng trong điều trị HIV), Atazanavir
(điều trị HIV), Sorafenib (điều trị ung thư gan và thận)…[17]. Nhiều nghiên cứu
cho thấy xác định sự có mặt của alen UGT1A1*28 ở những bệnh nhân điều trị với

ha
r

Atazanavir, Indinavir có thể giúp họ tránh bị tăng bilirubin không liên hợp [4], [24].
Một số thuốc khác đã được xác định là cơ chất của UGT1A1 như raloxifene (điều

ne
an
dP

trị loãng xương), raltegravir (ức chế virus, sử dụng trong điều trị HIV)… đặc biệt là
irinotecan (thuốc điều trị ung thư đại trực tràng) được quan tâm nhất. Ảnh hưởng
của alen UGT1A1*28 đến bệnh nhân điều trị bằng irnotecan sẽ được trình bày cụ
thể hơn ở bên dưới. Đến nay, mối tương quan giữa đa hình UGT1A1*28 và đáp ứng
của cơ thể với các thuốc khác nhau vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu.

ici

1.4. Ung thƣ đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình

ed

di truyền UGT1A1*28

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế

ho
ol
of
M

giới cũng như ở Việt Nam. Trong điều trị bệnh, irinotecan được sử dụng thường
xuyên cho những bệnh nhân ở giai đoạn IV. Tuy nhiên thuốc có nhiều tác dụng

gh
t@

Sc

không mong muốn như tiêu chảy nặng, suy tủy, xuất huyết… UGT1A1*28 được ghi
nhận có liên quan chặt chẽ đến các tác dụng không mong muốn này. Do vậy trong
thực hành lâm sàng, các bác sĩ cần cân nhắc xét nghiệm UGT1A1*28 trước khi
quyết định điều trị bằng irinotecan và điều chỉnh liều lượng thuốc phù hợp cho bệnh
nhân để tránh các tác dụng không mong muốn nặng.
Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ
hai, với khoảng 14 triệu trường hợp mắc mới vào năm 2012 và sẽ tăng khoảng 70%
trong vòng 2 thập kỷ tới. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước
có thu nhập thấp và trung bình [16]. Việt Nam cũng không phải ngoại lệ. Theo

Co
p

yri

thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII năm
2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000
người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ngày và con số này dự báo sẽ ngày
càng tăng cao. Tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của các ung thư phổ biến được thể hiện
trong Hình 1.4.

8

VN
U

Trong số các ung thư phổ biến, ung thư đại trực tràng là một trong những
dạng ung thư có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao nhất ở cả 2 giới. Trên thế giới, ung

thư đại trực tràng có tỉ lệ mắc cao thứ 4 (17,2%) và tỉ lệ tử vong cao thứ 5 (8,3%).
Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5 bệnh ung thư thường gặp với tỉ

ma
c

y,

lệ mắc là 10,1% và tỉ lệ tử vong là 7,0%. So với các ung thư đường tiêu hóa khác,
ung thư đại trực tràng có tiên lượng tốt hơn. Tỉ lệ sống 5 năm phụ thuộc vào giai
đoạn bệnh: giai đoạn I >90%, giai đoạn II>60%, giai đoạn III > 30% và giai đoạn
IV<5% [17]. Tuy nhiên các chương trình sàng lọc ung thư đại trực tràng mới được

ne
an
dP

ho
ol
of
M

ed

ici

bệnh ở giai đoạn muộn vẫn còn cao.

ha
r

triển khai trong những năm gần đây, hơn nữa sự tiếp cận của người dân với các
phương pháp chẩn đoán sớm còn hạn chế nên tình trạng bệnh nhân phát hiện ra

gh
t@

Sc

Hình 1.4. Tỉ lệ mắc và tử vong ở cả hai giới của 10 ung thư phổ biến nhất năm
2012 [33]
Irinotecan (CPT-11,7-ethyl-10-[4-(1-(piperidino)-1-piperidino]
carbonyl
camptothecin, Camptosar®) là thuốc điều trị chính để điều trị ung thư đại trực tràng
giai đoạn muộn, khi ung thư di căn, tái phát hoặc tiến triển sau điều trị ban đầu.

Co
p

yri

Thuốc thường được sử dụng kết hợp với các thuốc khác trong các phác đồ. Pháp đồ
điều trị phối hợp irinotecan thông thường là FOLFIRI (FOLONIC acid,
Fluoroucacil hoặc leucovorin, IRInotecan) [17].

Irinotecan là một dẫn xuất tổng hợp của thuốc chống ung thư camptothecin
(lần đầu tiên được phân lập từ cây Camptotheca). Giống như camptothecin,
9


VN
U

irinotecan ức chế enzym topoisomerase I (là một enzym trong nhân tế bào). Enzym

này xúc tác cho một số quá trình trong nhân tế bào như điều hòa cấu trúc cuộn xoắn,
quá trình sao chép và sửa chữa của ADN.
Irinotecan là tiền chất của SN38. Dạng hoạt hóa SN38 có hoạt tính mạnh gấp

ma
c

y,

100 -1000 lần so với Irinotecan [18]. SN-38 có tác dụng gây độc tế bào bằng cách
liên kết với phức hợp topoisomerase-ADN, làm gián đoạn quá trình cắt sợi đơn,
ngừng quá trình sao chép. Việc quá trình sao chép bị ngừng đột ngột và sự tương
tác của các enzym sao chép với phức hợp SN38-topoisomerase-ADN phá vỡ cấu

ha
r

trúc sợi kép của ADN, gây ra những tổn thương ADN không hồi phục, đưa các tế
bào vào quá trình apotosis (chết theo chu trình). Chính vì tác dụng như vậy mà

ne
an
dP

irinotecan ngăn cản sự phát triển và tiêu diệt các tế bào ung thư. Nhưng cũng vì thế
thuốc ảnh hưởng đến các mô, cơ quan có các tế bào có khả năng phân chia mạnh
như đường tiêu hóa, tủy xương. Hậu quả là thuốc thường gây nên các tác dụng
không mong muốn có thể dẫn đến tử vong như tiêu chảy nặng, suy tủy, dễ chảy
máu… do tích tụ sản phẩm chuyển hóa . Tuy nhiên, nhờ có enzym UGT1A trong

Sc

ho
ol
of
M

ed

ici

gan, SN-38 được glucuronyl hóa tạo thành sản phẩm không độc và đào thải được
(Hình 5).

gh
t@

Hình 1.5. Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan. a) Sự chuyển
hóa của irinotecan nhờ enzym UGT1A1 ở gan. b) Đa hình di truyền vùng promoter
của alen UGT1A1*28 ảnh hưởng tới hoạt tính glucuronul hóa của enzym UGT1A1

Co
p

yri

Dưới sự xúc tác của enzym UGT1A1, SN-38 liên hợp với axit glucuronic
hình thành SN-38 glucuronit không còn hoạt tính gây độc, được đào thải chủ yếu
qua mật, khoảng 30% qua thận[14]. Chính vì vậy, những bệnh nhân mang alen
UGT1A1*28 làm giảm biểu hiện của UGT1A1 sẽ gây tích tụ SN-38 trong cơ thể,
gây nguy cơ xuất hiện các tác dụng phụ ở mức độ nặng khi điều trị bằng irinotecan

10


VN
U

[11]. Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Administration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen

UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng
kiểu gen (Hình 1.6) [23].

ma
c

y,

Chưa có một liều lượng irinotecan cụ thể được thiết lập cho alen
UGT1A1*28. Tuy nhiên Innocenti và cộng sự năm 2006 đã đưa ra khuyến cáo giảm
20% liều cho bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28. Liều lượng thuốc có
thể điều chỉnh tăng hoặc giảm trong lần điều trị thứ 2 dựa trên các đáp ứng của khối

ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

ha
r

u với thuốc và quá trình theo dõi các tác dụng không mong muốn.

Hình 1.6. Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến
kiểu gen UGT1A1[16]
1.5. Các phƣơng pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28

gh
t@

Sc

Hiện tại có rất nhiều phương pháp khác nhau để phân tích các đa hình di
truyền. Các phương pháp này dựa trên những nguyên lý khác nhau như trình bày
bên dưới. Tuy nhiên phương pháp giải trình tự theo nguyên lý của Sanger và PCRRFLP được ứng dụng trong phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 nhiều hơn cả.
Với nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác, phương pháp giải trình tự theo
nguyên lý của Sanger được lựa chọn cho nghiên cứu này.
1.5.1 Giải trình tự ADN

Co
p

yri

Phần lớn các phương pháp được nói phía dưới ứng dụng cho việc để sàng lọc
bước đầu đột biến điểm/ các SNP. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải
trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm

11


VN
U

1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotit (gọi tắt là phương pháp

dideoxy) [35]. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này dựa trên sự bổ sung các dẫn

xuất tương ứng của các deoxynucleotit (dNTP) là 2’,3’-dideoxynucleotit (ddNTP).
Các ddNTP thiếu nhóm 3’- OH, nên một khi được gắn vào mạch ADN đang tổng

ma
c

y,

hợp thì quá trình tổng hợp ADN sẽ dừng lại. Theo phản ứng tổng hợp ADN, một
trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng
cách sử dụng một đoạn oligonucleotit ngắn là đoạn ADN có trình tự xác định trước,
thường được tổng hợp hóa học, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó.

ha
r

Các mồi oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzym ADN polymerase.
Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại dNTP và ddNTP để ngắt phản ứng kéo dài

ne
an
dP

chuỗi. Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel
polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [1],
[27].

Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các
phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Với

ho
ol

of
M

ed

ici

sự phát triển của các enzym ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương
pháp này cho phép sàng lọc các SNP hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật
đã miêu tả trên. Cho đến nay, giải trình tự thế hệ mới và sử dụng chất huỳnh quang
cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất
cao. Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như:
loại đột biến, vị trí và có thể tiến hành phân tích với nhiều đột biến điểm cùng lúc
[2].

gh
t@

Sc

Tuy vậy hạn chế của phương pháp này là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN
phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Thời gian cần thiết để
tiến hành giải trình tự cũng kéo dài hơn so với các phương pháp như Real – time
PCR và PCR - RFLP. Tuy nhiên, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác
định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp
cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm.
Bên cạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu
kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu. [1]

Co

p

yri

1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation
polymorphism - SSCP):
Đây là một phương pháp đơn giản được sử dụng trong nghiên cứu đột biến
điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc

12


VN
U

không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi
trường chứa chúng. Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi,

cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit và bất cứ thay đổi nào trong
đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Phương pháp này sử dụng PCR để khuếch

ma
c

y,

đại đoạn gen mong muốn. Sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel
polyacrylamit không biến tính, các nucleotit trên phân tử ADN sợi đơn sẽ bắt cặp
bổ sung lại với nhau, dẫn đến hình thành cấu hình không gian khác nhau do sự khác
biệt về trình tự nucleotit. Các phân tử ADN sợi đơn này sẽ di chuyển với tốc độ

ha
r

không giống nhau và phân tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi
đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách.

ne
an
dP

Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được
các phân tử ADN có trình tự khác nhau [22], [29].

1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis):

Cũng giống như phương pháp SSCP, nguyên lý của phương pháp phân tích
dị sợi kép dựa trên sự hình thành của ADN dị sợi kép. Các ADN của một mẫu có

ho
ol
of
M

ed

ici

kiểu dại đã được xác định trước được trộn lẫn với mẫu ADN cần phân tích. Các
phân tử ADN sợi kép được biến tính ở nhiệt độ cao để phân tách 2 mạch đơn. Nếu

mẫu cần phân tích có kiểu gen dị hợp thì trong mẫu trộn lẫn sau biến tính sẽ bao
gồm các sợi bổ sung và các sợi có chứa một cặp basơ không bổ sung (tương ứng với
vị trí của SNP). Sau đó hạ nhiệt độ xuống chúng sẽ liên kết lại với nhau hình thành

Sc

ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Chính sự xuất hiện của cặp
basơ ghép đôi không chính xác này làm giảm tốc độ di chuyển khi điện di của các
phân tử ADN dị sợi kép so với các phân tử ADN đồng sợi kép. Hiện nay phương
pháp này đã được cải tiến bằng cách khuếch đại các đoạn ADN của mẫu kiểu gen
hoang dại và kiểu gen cần phân tích [22], [29].

gh
t@

1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length
polymorphism – RFLP)
Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzym giới
hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh

Co
p

yri

nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo
chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamit
và/hoặc được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot. Trên màng lai
có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ

13


VN
U

sung với chúng. Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch
đại đoạn gen cần phân tích. Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-

ma
c

hóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp khác [27], [29].

y,

RFLP. Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có
thể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản

1.5.5 Real – time PCR

ha
r

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuyếch đại đoạn ADN đích, người
làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả ví dụ như điện di sản

ne
an
dP

phẩm PCR trên gel agarose, acrylamide hay thí nghiệm lai với các đoạn dò đặc hiệu
(trên màng, trên giếng hay phiến nhựa…) để xem sản phẩm khuếch đại có trình tự
mong muốn hay không. Kỹ thuật PCR cần phải có giai đoạn đọc kết quả sau khi
hoàn tất phản ứng khuếch đại được gọi là PCR cổ điển .
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà số lượng khuếch đại ADN đích hiển thị
được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Quá trình khuếch đại ADN của các
ống được hiển thị dưới dạng một biểu đồ khuếch đại. Các dNTP (nguyên liệu để

ho
ol
of
M

ed

ici

tổng hợp ADN) được đánh dấu huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang trong ống
phản ứng sẽ tăng sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của ADN đích tăng gấp
đôi sau mỗi chu kỳ và được máy ghi lại để dựng thành biểu đồ. Tuy nhiên cường độ
huỳnh quang trong ống sẽ tăng trưởng đến một mức độ thì sẽ chậm dần và thành
đường ngang do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzym Taq polymerase không hoạt
động hiệu quả nữa, nên số lượng bản sao không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2
nữa [27], [29].
1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy

gh
t@

Sc

V.Thomas và cộng sự năm 2013 đã phát triển quy trình phân tích đa hình di
truyền vùng promoter của gen UGT1A1 dựa trên kĩ thuật HRM (phân giải cao nhiệt
độ chảy). Phương pháp này có ưu điểm dễ ứng dụng, tiết kiệm chi phí và thời gian
hơn so với phương pháp giải trình tự. Tuy nhiên phương pháp này không phân tích
được sự khác nhau giữa các kiểu gen dị hợp TA6/TA7 và TA6/TA8 và cần sử dụng

Co
p

yri

phương pháp điện di tiếp sau để phân biệt 2 loại kiểu gen dị hợp này (thể hiện trong
Hình 1.7 và Hình 1.8) [30]. Chính vì vậy, V.Thomas vẫn đưa ra khuyến cáo nên sử
dụng phương pháp giải trình tự để có được kết quả khách quan khi phân tích đa
hình TA6/TA7 [30].

14


TA8/TA8

y,

Sự khác biệt mức tín hiệu

TA7/TA8

VN

U

Biên độ nhiệt

ma
c

TA7/TA7

ha
r

TA5/TA8

TA5 /TA7

ne
an
dP

TA5/TA5

TA6/TA7 và
TA6/TA8

TA6/TA6
TA5/TA6

Hình 1.7. Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1. Tất cả

ho
ol
of
M

ed

ici

8 kiểu gen TAn đều được phân biệt rõ ràng với các kiểu gen khác, ngoại trừ kiểu
gen TA6/TA7 và TA6/TA8 [30].

Co
p

yri

gh
t@

Sc

Hình 1.8. Kết quả điện di của kiểu gen TA6/TA7 và TA6/TA8 sử dụng gel agarose
3%. Sau khi điện di tối thiểu 60 phút, bệnh nhân có kiểu gen dị hợp TA6/TA7 chỉ thu
được 1 băng ADN. Ttrong khi đó, bệnh nhân có kiểu gen TA6/TA8 sẽ thu được 2
băng ADN.

15

2.1.

VN
U

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu

y,

38 mẫu sinh phẩm thu được sau phẫu thuật tại Bệnh viện 198 Bộ Công an

Hóa chất

ha
r

2.2.

ma
c

được cố định trong formalin và đúc trong paraffin, được bảo quản ở 4 oC.
8/38 bệnh nhân trên cung cấp thêm mẫu máu (1 ml) bảo quản trong EDTA
lưu ở -20 oC đến khi sử dụng.

Nhóm hóa chất tách ADN tổng số: Kit ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep

ne
an

dP

System (Promega) dùng cho mẫu mô đúc trong paraffin; Kit E.Z.N.A blood DNA
Mini kit (Omega-Biotek) dùng cho mẫu máu; Ethanol 100%; Isopropanol 100%.
Nhóm hóa chất điện di: EDTA(Affymetrix); Tris base (Bio basic); agarose
(Lonza); GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific) dùng cho điện di
sản phẩm PCR; Lamdba DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific) dùng cho điện di
sản phẩm ADN tổng số; 6X ADN loading dye (Thermo Scientific).

ed

ici

Nhóm hóa chất phản ứng PCR: dNTPMix 2mM (Thermo Scientific); Q5
High-Fidelity ADN polymerase (NEB); Nước khử ion (Omega-Biotek); Cặp mồi
đặt tổng hợp tại hãng IDT (Mỹ) với trình tự như sau:

ho
ol
of
M

F1: 5’ GCTCCACCTTCTTTATCTCTG 3’
R1: 5’ ATC AAC AGT ATC TTC CCA GCA 3’
Nhóm hóa chất giải trình tự: BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing (Applied
Biosystems); Dung dịch SAM (Applied Biosystems).

gh
t@

Sc

2.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu
Bể ổn nhiệt; Tủ ấm; Máy lắc VELP Scientifica (Đức); Máy li tâm EBA 21
Hettich Zentrifugen (Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel ColeParmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh sâu -20 ˚C (Nhật
Bản); Máy phân tích phân đoạn ADN tự động (Applied Biosystems); Máy quang
phổ NP80 Nanophotometer (Đức).

Co
p

yri

Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Y Dược
học cơ sở - Khoa Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội.

16


Phƣơng pháp nghiên cứu

VN
U

2.4.

2.4.1. Tách chiết ADN tổng số

y,

ADN tổng số cần được thu hồi từ mẫu sinh phẩm để thực hiện cho các phản
ứng tiếp theo. Với phản ứng PCR để nhân dòng một đoạn ADN xác định rất cần

ma
c

ADN được tinh sạch. Các tạp chất còn lẫn trong mẫu ADN cần nhân dòng có thể ức
chế hoặc làm giảm hiệu suất của quá trình PCR. Để giải quyết vấn đề này, mẫu cần

ha
r

được xử lý qua một loạt quá trình ly giải để khử tạp chất. Một trong số các phương
pháp phổ biến nhất hiện nay và cũng được áp dụng trong nghiên cứu này là phương
pháp tinh sạch ADN bằng cột ly tâm chứa chất bám silica (mô tả trong Hình 2.1)

ho
ol
of
M

ed

ici

ne
an
dP

[9].

Chuẩn bị
mẫu

Gắn ADN

Tách ADN

gh
t@

Sc

Hình 2.1. Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica [35]
Để tiến hành tinh sạch ADN theo phương pháp này, người ta sử dụng đệm ly
giải chứa nồng độ cao các muối hoạt động bề mặt cao. Các chấp hoạt động bề mặt
này sẽ làm mất ổn định liên kết hydro, lực Van der Walls và tương tác kị nước [9].
Protein cũng bị mất ổn định và liên kết của chúng với axit nucleic bị phá vỡ tạo điều
kiện chuyển ADN lên màng silica. ADN được gắn lên màng ở lực ion cao và sau đó
được giải phóng ở lực ion thấp. Để tăng cường khả năng gắn cả acid nucleic lên
màng, các alcohol cũng được thêm (ở nghiên cứu này sử dụng ethanol). Dung dịch
ly giải cần được ly tâm tiếp để có thể đi qua màng silica, sau ly tâm chỉ ADN hoặc
ARN được giữ lại trên màng, còn các thành phần khác như protein, poysaccarit,...
sẽ bị rửa trôi. Sau đó cột silica được ly tâm để làm khô cột, loại bỏ ethanol. Cuối
cùng, đệm Tris 10mM hoặc nước được thêm vào màng để các acid nucleic sẽ bị
hydrat hóa và được giải phóng nhanh chóng ra khỏi màng [9].

yri
Co
p

Rửa mẫu

17


VN
U

2.4.2. Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số

Hai phương pháp để đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số
được sử dụng trong nghiên cứu này là điện di ADN và đo mật độ quang.

y,

Với phương pháp điện di ADN, nguyên tắc là dưới tác động của điện trường,

ha
r

ma
c

các phân tử axit nucleic khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và
dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực
âm sang cực dương với tốc độ di chuyển khác nhau. Vì vậy chúng dần tách nhau ra
trên trường điện di; qua đó ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn

ne

an
dP

ADN hoặc gen riêng rẽ. Trên trường điện di, các phân đoạn ADN có kích thước
càng nhỏ càng di chuyển nhanh. Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thể
quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, như ethidium bromide.
Mỗi băng điện di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có cùng kích
thước [1].

Có 2 loại gel được dùng phổ biến là gel agarose và polyacrylamide. Gel
polyacrylamid có độ phân giải cao, nhưng vùng kích thước ADN có thể phân tích

ho
ol
of
M

ed

ici

hẹp, thường chỉ dùng để phân tích các đoạn ADN kích thước nhỏ (5 – 1000 bp).
Trong khi đó gel agarose có độ phân giải thấp đối với các đoạn ADN có kích thước
nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các đoạn ADN kích thước lớn (khoảng từ 200
bp đến 20 kb). Trường hợp kiểm tra độ tinh sạch ADN tổng số, tôi sử dụng gel
agarose để kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm ADN tương ứng với kích thước
khoảng 23 kb [1].

gh
t@

Sc

Với phương pháp đo mật độ quang, nguyên lý dựa trên cường độ hấp thụ tia
tử ngoại của các cấu trúc vòng thơm trong các nucleotit cấu tạo nên phân tử ADN.
Khi tia UV được chiếu qua dung dịch axit nucleic, mức độ hấp thụ tia UV (OD260)
phụ thuộc vào nồng độ các axit nucleic. Dựa trên nồng độ ADN hoặc ARN của các
dung dịch chuẩn biết trước, các giá trị OD 260 tương ứng được dùng để vẽ đường
tuyến tính chuẩn tương quan giữa nồng độ axit nucleic với chỉ số OD 260. Khác với
axit nucleic, protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (chủ yếu là do
cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan). Do vậy độ tinh sạch của dịch chiết
ADN có thể xác định qua tỉ số OD 260/280 [1].

Co
p

yri

2.4.3. Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1
Kỹ thuật PCR dùng ADN polymerase để tổng hợp phân tử ADN mới từ trình
tự của phân tử ADN làm khuôn với tiền chất là các dNTP. Các ADN polymerase

18