Tiếp tục góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 182.15

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----

----

VŨ THỊ VIỆT TRINH

TIẾP TỤC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU
KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ VIỆT TRINH
Mã sinh viên: 1401640

TIẾP TỤC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU
KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Cao Văn Thu
2. TS. Nguyễn Quỳnh Lê
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
PGS.TS. Cao Văn Thu người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi từ những ngày đầu
bước vào nghiên cứu khoa học cho tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cảm ơn
TS.Nguyễn Quỳnh Lê đã hướng dẫn, hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ
dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn các
thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy tại bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, thực hiện đề tài nghiên
cứu tại bộ môn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian, phương tiện, kinh phí, kiến thức của bản thân còn hạn chế, chắc
chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp của thầy cô, bạn bè để khóa luận này được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
VŨ THỊ VIỆT TRINH


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Đại cương về kháng sinh........................................................................... 2
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ............................................................. 2
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh ......................................................................... 2
1.1.3. Phân loại kháng sinh ............................................................................ 2
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh: ........................................................... 3
1.1.5. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh ............................ 4
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh .............................................. 4
1.2. Đặc điểm xạ khuẩn ................................................................................... 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces................................. 4
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn ................................................... 5
1.2.3. Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng............................................................ 5
1.2.4. Phân loại xạ khuẩn .............................................................................. 5
1.2.5. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces ............................ 6
1.3. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh ............................ 6
1.4. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn ........................................................ 6
1.5. Bảo quản giống xạ khuẩn ......................................................................... 7
1.6. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ........................................................... 8
1.6.1. Khái niệm lên men .............................................................................. 8
1.6.2. Các phương pháp lên men .................................................................... 8
1.6.2.1. Lên men bề mặt ........................................................................... 8
1.6.2.2. Lên men chìm.............................................................................. 8
1.6.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ..................................... 9
1.7. Chiết tách, tinh chế kháng sinh ................................................................. 9
1.7.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ........................................ 10
1.7.2. Phương pháp chiết xuất ...................................................................... 10


1.7.3. Phương pháp tinh chế ........................................................................ 10

1.8. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh ........................................................ 11
1.8.1. Phổ hồng ngoại (IR) .......................................................................... 11
1.8.2. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV - VIS) ..................................................... 11
1.8.3. Phổ khối (MS)................................................................................... 11
1.8.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).................................................... 12
1.9. Các nghiên cứu liên quan đến các kháng sinh được tổng hợp từ
Streptomyces ................................................................................................. 12
1.9.1.

Sản

xuất

8-demethylgeladanamycin

và

4,5-epoxy-8-

demethylgeldanamycin và các dẫn xuất có tác dụng điều trị ung thư từ
pStreptomyces hygroscopicus ...................................................................... 12
1.9.2. Nghiên cứu về chủng Streptomyces Flavogriseus NJ-4-Chủng mới cho sản
xuất Actinomycin D và Holomycin (2017).................................................... 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................... 15
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................. 15
2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ ................................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 17
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống ...................................................................... 17
2.2.2. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh.............................................. 17

2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được ........... 17
2.3. Phương pháp thực nghiệm ..................................................................... 17
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn .......................................................... 17
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán .............. 18
2.3.3. Phương pháp cải tạo và chọn giống ..................................................... 19
2.3.3.1. Phương pháp chọn chủng có HTKS cao bằng SLNN ..................... 19
2.3.3.2. Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV ................................... 19
2.3.3.3. Đột biến cải tạo giống bằng tác nhân hoá học HNO2 .................... 20
2.3.4. Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh .............................................. 21
2.3.5. Các phương pháp chiết tách, tinh chế kháng sinh.................................. 21
2.3.5.1. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ............... 21
2.3.5.2. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay........................... 22
2.3.5.3. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng SKLM ...................... 22


2.3.5.4. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ...................................... 22
2.3.5.5. Kết tinh thu kháng sinh tinh khiết ................................................ 23
2.3.6. Sơ bộ xác định tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được ...................... 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN ........ 24
3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ......................................... 24
3.1.1. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 .............................................. 24
3.1.2. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 .............................................. 24
3.1.3. Kết quả đột biến hoá học cải tạo giống ................................................ 25
3.2. Kết quả lên men chọn môi trường nuôi cấy tốt nhất................................ 26
3.3. Kết quả chọn chủng lên men tốt nhất...................................................... 27
3.4. Kết quả sắc ký ........................................................................................ 27
3.4.1. Kết quả chạy sắc ký lần 1 ................................................................... 27
3.4.2. Kết quả chạy sắc ký lần 2 ................................................................... 27
3.4.3. Kết quả chạy sắc ký lần 3 ................................................................... 29
3.5. Kết tinh thu kháng sinh tinh khiết .......................................................... 30

3.6. Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh ............................................ 31
3.6.1. Kháng sinh 182.15.KS1 ..................................................................... 31
3.6.1.1. Phổ khối lượng MS kháng sinh 182.15.KS1 ................................. 31
3.6.1.2. Phổ Tử ngoại – khả kiến UV-VIS kháng sinh 182.15.KS1 .............. 31
3.6.2. Kháng sinh 182.15.KS2 ..................................................................... 31
3.6.2.1. Phổ khối lượng MS kháng sinh 182.15.KS2 ................................. 31
3.6.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân kháng sinh 182.15.KS2 .................... 31
3.6.2.3. Phổ Tử ngoại – khả kiến UV-VIS kháng sinh 182.15.KS2 .............. 31
3.6.2.4. Phổ hồng ngoại IR .................................................................... 32
3.6.2.5. Phổ DEPT Kháng sinh 182.15.KS2 ............................................. 32
3.7. Bàn luận ................................................................................................. 34
3.7.1. Chọn lọc từ cải tạo giống ................................................................... 34
3.7.2. Chiết tách, cất quay, tinh chế kháng sinh tinh khiết ............................... 34
3.7.3. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .......................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
13
13

C - NMR

1

H – NMR

C Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13carbon)
1

H Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hydro)

A

Adenin

A549

Tế bào ung thư phổi

ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

ATCC

American Type Culture Collection (Trung tâm giữ giống Hoa Kỳ)

BGC823

Tế bào ung thư dạ dày

B.pumilus

Bacillus pumilus ATCC 6633

CDC

Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát và
phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ)

COSY

Correlation Spectroscopy (Phổ tương quan)

CW I

Cell wall type 1 (Thành tế bào typ 1)
Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn

Dd
DEPT

Dung dịch
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (Phổ tăng
cường biến dạng nhờ dịch chuyển phân cực)

DM

Dung môi

Dmhc

Dung môi hữu cơ

ĐBHH

Đột biến hoá học

ĐBUV1

Đột biến UV lần 1

ĐBUV2

Đột biến UV lần 2

G

Guanin

Gr(-)/ Gr(+)

Gram âm / Gram dương

HMBC

HSQC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan đa liên kết
dị nhân)
Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ kết hợp lượng tử đơn
dị nhân)

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IMI

Innovative Medicine Initiative


IR
ISP

Ifrared (Phổ hồng ngoại)
International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc
tế)

KS

Kháng sinh

L-DAP

L-diaminopimelic acid

MC

Mẫu chứng

MS

Mass Spectrometry (Phổ khối)

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NCIMB

NCTC

The National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (Bộ
sưu tập quốc gia về công nghiệp, thực phẩm và vi khuẩn biển)
The North Centre Texas College (Trường Đại học Trung tâm Bắc
Texas)

NMR

Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

PL

Phụ lục

PLx

Phụ lục trang x

S.flexneri

Shighella flexneri DT 112

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

UV

Ultra Violet (Phổ tử ngoại)

UV – VIS

Ultra Violet - Visible (Phổ tử ngoại - khả hiếm)

V

Thể tích

v/v

Thể tích/ thể tích

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng phân loại các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học ......................... 3
Bảng 1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ................................................................... 3
Bảng 2.1. Các chủng VK kiểm định ........................................................................... 15
Bảng 2.2. Các môi trường nuôi cấy VK kiểm định ..................................................... 15
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ............................................................. 16
Bảng 3.1. Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 1 ........................................................ 24
Bảng 3.2. Kết quả chính thử HTKS đột biến UV lần 2 ............................................... 25
Bảng 3.3. Kết quả chính thử HTKS sau đột biến hoá học ........................................... 26
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men tốt nhất ................................ 26
Bảng 3.5. Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men tốt nhất ........................................ 27
Bảng 3.6. Kết quả thử HTKS và SKLM sau chạy sắc ký cột lần 1 ............................. 28
Bảng 3.7. Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2...................... 29
Bảng 3.8. Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3...................... 29
Bảng 3.9. Màu sắc, khối lượng kháng sinh tinh khiết và hiệu suất tinh chế. ............... 30
Bảng 3.10. Kết quả phổ IR của kháng sinh 182.15.KS2 ............................................. 32
Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ C13-DEPT ............................................................ 33
Bảng PB13: Bảng so sánh cấu trúc vòng Phenoxazone của Actinomycin X2 và
Actinomycin D so với và kháng sinh 182.15.KS2 theo phổ cộng hưởng từ hạt nhân
C13 ....................................................................................................................... PL21
Bảng PB14: Bảng thử hoạt tính kháng sinh các chủng 182.15 sau ĐBUV1........... PL22
Bảng PB15: Bảng thử hoạt tính kháng sinh các chủng 182.15 sau ĐBUV2........... PL23
Bảng PB16: Bảng thử hoạt tính kháng sinh các chủng 182.15 sau ĐBHH............. PL24
Bảng PB17: Bảng kết chọn chủng lên men có HTKS tốt nhất ............................... PL25

Bảng PB18: Các dung môi sử dụng trong nghiên cứu ........................................... PL26
Bảng PB19: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................. PL27


DANH MỤC CÁC HÌNH
1. Hình PH1. Phổ khối 182.15.KS1 ........................................................................ PL1
2. Hình PH2. Phổ khối 182.15.KS2 ........................................................................ PL2
3. Hình PH3. Phổ182.15.KS2.13C .......................................................................... PL3
4. Hình PH4. Phổ 182.15.KS2.1H........................................................................... PL7
5. Hình PH5: Phổ tử ngoại - khả kiến 182.15.KS1.UV-VIS .................................. PL11
6. Hình PH6: Phổ tử ngoại – khả kiến 182.15.KS2.UV-VIS ................................. PL12
7. Bảng PB7: Các kháng sinh được tổng hợp từ chi xạ khuẩn Streptomyces ......... PL13
8. Hình PH8: Phổ hồng ngoại 182.15.KS2.IR ....................................................... PL14
9. Hình PH9: Phổ 182.15.KS2.DEPT.................................................................... PL15
10. Hình PH10: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh ................................... PL18
11. Hình PH11: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng các phân đoạn và giai đoạn chạy cột quan
sát bằng mắt thường .............................................................................................. PL19
12. Hình PH 12: Hình ảnh thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch,
giếng thạch, khoanh giấy lọc................................................................................. PL20


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc kháng sinh là loại thuốc quan trọng để điều trị nhiễm khuẩn ở cả người
và động vật. Thật không may, nhiều vi khuẩn gây ra các bệnh nhiễm trùng này đang
trở nên kháng các kháng sinh hiện có. Chúng ta càng sử dụng kháng sinh, vi khuẩn
kháng thuốc càng trở nên phổ biến. Và việc tìm ra các kháng sinh mới đang là nhu cầu
cấp bách của toàn cầu. Tuy nhiên tốc độ kháng sinh mới được tìm ra và đưa vào sử
dụng lâm sàng ngày càng chậm lại, nhiều công ty và nhà khoa học đã từ bỏ việc tìm
kiếm kháng sinh mới do vấn đề kinh tế. [19]
Tổ chức Y tế Thế giới WHO đang kêu gọi các quốc gia và các nhà khoa học nỗ

lực tìm kiếm các kháng sinh mới nhằm tiêu diệt vi khuẩn kháng thuốc. Mà
Streptomyces 182.15 được chứng minh có khả năng sinh tổng hợp ra 2 kháng sinh
mới, nên tôi chọn đề tài “Tiếp tục góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces
182.15” với các mục tiêu sau:
 Cải tạo chủng giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
 Chiết tách và tinh chế kháng sinh thu được.
 Sơ bộ nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh thu được.

1


1CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Năm 1928 Alexander Fleming và cộng sự đã chú ý đến một hộp Petri nuôi
Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có hiện tượng vòng vô khuẩn
xuất hiện xung quanh khuẩn lạc nấm. Năm 1929, Ông sử dụng tên giống nấm
Penicillium để đặt tên cho hoạt chất kháng sinh của chủng mốc này là penicilin, nhưng
chưa thể chiết tách được. Năm 1940, Howard Walter Florey và Ernst Boris Chain đã
chiết xuất thành công penicilin. Năm 1943, penicilin được áp dụng vào điều trị. Sau
đó, nhiều kháng sinh đã được tìm ra. Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công
nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con đường tổng hợp
và bán tổng hợp cũng dần phát triển. [5], [22]
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh.
Định nghĩa hẹp: “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được
các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các
vi sinh vật khác”
Định nghĩa rộng được coi là tương đối hoàn chỉnh: “Kháng sinh là tất cả các
hợp chất nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc

đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà
không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật, hoặc thực vật bằng con
đường cung cấp chung”. [15],[4],[1]
1.1.3. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng hay theo
phổ tác dụng… trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được sử dụng phổ biến nhất.
Các chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo Bảng 1.1 [4],
[15], [1]

2


Bảng 1.1. Bảng phân loại các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học
STT
1

Nhón kháng sinh
β-lactam

Ví dụ
Penicilin: benzylpenicilin, oxacilin, ampicilin,…
Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor,…
Các β-lactam khác: carbapenem, chất ức chế βlactamase,…

2

Aminoglycosid

Streptomycin, gentamicin,neomycin…

3

Macrolid

Erythromycin, clarithromycin,azithromycin,…

4

Lincosamid

Lincomycin, clindamycin,…

5

Phenicol

Cloramphenicol, thiamphenicol,…

6

Tetracyclin

Tetracyclin, doxycyclin,…

7

Peptid

Glucopeptid: vancomycin,…
Polypeptid: polymicin, bacitracin,…

8

Quinolon

Acid nalidixic, ciprofloxacin, levofloxacin,...

9

Sulfonamid

Sulfamethoxazol

10

Imidazol

Metronidazol,...

1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh:
Các kháng sinh có một hoặc nhiều cơ chế tác dụng khác nhau và hiện tại có 5
cơ chế tác dụng trên vi sinh vật như sau [4], [15]:
Bảng 1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Kháng sinh, nhóm kháng sinh

Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

β-lactam, vancomycin,...

Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của Cloramphenicol, macrolid,
vi khuẩn

tetracyclin,...

Ức chế tổng hợp acid nucleic

Quinolon, rifampicin,…

Ức chế chuyển hóa

Sulfamethoxazol,...

Ức chế sinh tổng hợp, thay đổi tính thấm Polymycin, amphotericin,…
của màng tế bào
Ức chế trao đổi hô hấp

Antimycin A, Actinomycin X,…

3


1.1.5. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập VSV sinh kháng sinh người ta lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác
nhau: đất ở ruộng, bùn, đất quanh rễ cây,... từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết
những VSV sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng phương pháp đặc trưng và trên
các môi trường chọn lọc.
Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:
- Phương pháp cấy dịch chiết lên bề mặt thạch.

- Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch.
- Phương pháp làm giàu đất.
- Phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường phân lập. [8], [3]
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Được giới thiệu ở Hình PH10 phần Phụ lục trang 18. [9], [12]
1.2. Đặc điểm xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng trong tự nhiên (đất, nước, bùn…). Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ
khuẩn.
Đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh,
thuộc nhóm VK Gr (+), có tỷ lệ G + C > 55%. [15]
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phát triển thành dạng sợi phân nhánh.
Hệ sợi của xạ khuẩn Streptomyces chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí
sinh. Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, còn khuẩn ty ký sinh phát riển mạnh hay
yếu thậm chí hầu như không phát triển tùy từng chi, từng loài. Khuẩn ty của xạ khuẩn
thường không có vách ngăn, không tự đứt đoạn, đường kính 0,3 - 2,0 µm, màu sắc rất
phong phú: da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng, xám,... [15]
- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm
nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng.
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì
dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh. Sau một thời gian phát triển,
trên đỉnh của khuẩn ty khí sinh xuất hiện chuỗi bào tử.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình tròn, bầu dục, hình que,
hình trụ,…Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có gai hoặc có tóc.

4


Khuẩn lạc xạ khuẩn: tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành

khuẩn lạc xạ khuẩn. Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp, dạng
phấn, không trong suốt, có thể có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc đường
tròn đồng tâm,… [15]
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn
Thành tế bào xạ khuẩn: có dạng kết cấu peptidoglycan G(+), dày khoảng 10 20nm. Thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I chứa L-ADP (Ldiaminopimelic acid) và glycin.
Màng tế bào chất dày khoảng 7,5 - 10,0nm. Thành phần chính là protein và
phospholipid. Chức năng màng tế bào chất là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan
trong nước, là nơi mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp.
Tế bào chất: chứa mesosom và các vật thể ẩn nhập bên trong như hạt phosphat,
hạt polysaccharid.[11] Mesosom có hình phiến, hình bọng hay hình ống, làm tăng diện
tích tiếp xúc của màng tế bào chất và qua đó làm tăng cường hoạt tính enzym, tăng vận
chuyển điện tử,... [15]
1.2.3. Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng
Streptomyces thuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tốt nhất 22 320C, pH tốt nhất 6,5 - 7,5.
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển chúng phân
giải các hydratcarbon làm nguồn dinh dưỡng, đồng thời thủy phân các hợp chất như
gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. [15]
1.2.4. Phân loại xạ khuẩn
Nhiều khoá phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học trên thế giới xây
dựng: Waksman, Krassilnhikov, Gauze,…
Phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces theo khoá phân loại ISP của
E.B.Shirling & Gottlieb được sử dụng rộng rãi, khoá phân loại dựa vào các đặc trưng:
- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí
sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả
năng sử dụng các nguồn đường. [15]

5

Ngày nay, người ta cũng thường sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S
rADN để phân loại Streptomyces. Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin cậy.
[6], [15]
1.2.5. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều kháng
sinh có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau. Bảng PH7 phần Phụ lục
trang 13 giới thiệu một số chất kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces [6], [15], [3].
1.3. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh
Vi sinh vật ở trong các cơ chất khác nhau như: trong đất, nước, không khí. Vi
sinh vật được phân lập theo kỹ thuật sau:
- Phân lập vi sinh vật trong không khí: sau khi cân môi trường , tiệt trùng và đổ
vào các hộp petri, rồi để hộp không đậy nắp trong 20 - 30 phút ở những nơi muốn phân
lập. Các VSV có trong không khí sẽ mọc lên các khuẩn lạc sau 48 - 120 giờ nuôi.
- Phân lập vi sinh vật từ cơ chất rắn, nước: cân 1g cơ chất rồi hòa tan vào 10ml
nước vô trùng, sau đó dùng nước pha loãng đến nồng độ mong muốn, sử dụng pipet
nhỏ 0,1ml lên bề mặt MT thạch, dùng que chang dàn đều trên mặt thạch của hộp petri.
Sau thời gian nuôi trong tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp các nhóm VSV sẽ
hình thành khuẩn lạc và dùng que cấy cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng để
thuần khiết hóa, sau đó chuyển sang môi trường đặc dụng, ủ ấm, rồi thử hoạt tính
kháng sinh. [3], [8]
1.4. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn
Mục đích:
Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập từ cơ chất thường có hoạt tính
thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải
tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy
thích hợp nhằm mục đích:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt hơn, rút ngắn
thời gian lên men,…
- VSV chỉ tạo 1 sản phẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho tách chiết và tinh chế.

- Tạo ra biến chủng ít tích tụ các sản phẩm không mong muốn.
- Sinh tổng hợp các chất mới với tác dụng mới. [5], [8]

6


* Đột biến cải tạo giống
Chọn lọc tự nhiên chưa đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp, cần thiết phải
dùng đến các phương pháp đột biến nhân tạo.
Các tác nhân đột biến bao gồm:
- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hoá khác. Khả
năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào bước sóng, cường độ, khoảng cách
và thời gian chiếu ánh sáng UV.
- Tác nhân hoá học: Nitrozoguanidin, HNO2, ethylenimin,…
- Tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động.
Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, phải tiến
hành đột biến bậc thang kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp,
kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.
Sau khi đột biến bằng các tác nhân trên với liều lượng và thời gian thích hơp
hầu hết các VSV sẽ chết. Trong số các biến chủng sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm
thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm
tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương
tính). [8],[10]
1.5. Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị
biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ.
Các phương pháp bảo quản:
- Bảo quản lạnh: bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2oC, định kỳ 3-6
tháng cấy chuyền.
- Đông khô: phân tán tế bào VSV trong môi trường chất bảo quản rồi đông

lạnh, làm khô mẫu đông lạnh.
- Đông lạnh: huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp từ -78oC đến -20oC.
- Làm khô: Trộn tế bào vi sinh vật với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng.
[8],[11]

7


1.6. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.6.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm tích
luỹ các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần tế bào.
Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh trưởng
của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng. [6], [8], [12], [15]
1.6.2. Các phương pháp lên men
1.6.2.1. Lên men bề mặt
VSV được nuôi cấy trên bề mặt dịch thể hoặc bề mặt bán rắn, hấp thu các chất
dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi
trường.
Yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng và không quá sâu (5 –
10cm).
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện; trang thiết bị đơn giản; dễ xử lý cục bộ.
Nhược điểm: Hiệu suất sử dụng trường không gian thấp; khó giữ vô trùng; khó
cơ giới hoá, tự động hoá; tốn diện tích, tốn nhân công. [5], [8], [11]
1.6.2.2. Lên men chìm
Là phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men bình phản ứng sinh
học, trong điều kiện sinh lý tốt nhất, VSV phát triển cả 3 chiều.
Ưu điểm: Dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.

Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ
cần chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường.
Các phương pháp lên men chìm:
- Lên men mẻ: VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với thể tích môi
trường xác định, ở điều kiện sinh lý tối thích. Trong suốt thời gian lên men, không tác
động hay bổ sung gì, ngoài cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH. Kết thúc
quá trình, thu lấy dịch lên men chứa sản phẩm.
-Lên men bán liên tục: Là lên men VSV trong điều kiện xác định, khi VSV phát
triển tạo ra nồng độ sinh khối cần thiết ta lấy bớt dịch lên men, rồi bổ sung thêm môi
trường mới bằng lượng dịch đã lấy.

8


- Lên men liên tục: Hoạt động như một hệ mở khi ta lấy ra liên tục lượng dịch
lên men đồng thời bổ sung đồng lượng môi trường mới vào hệ thống lên men.
- Lên men có bổ sung: Bổ sung một cách liên tục, định kỳ hoặc theo chương
trình vào bình lên men, cho phép thay đổi thể tích dịch lên men. [5], [8], [11]
1.6.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
pH môi trường: Ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp của VSV
thông qua tác dụng trực tiếp của ion H+ hay OH– đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực
của enzym hoặc tác dụng gián tiếp.
Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng, kiểu sinh sản, hình thái,
trao đổi chất, nhu cầu dinh dưỡng của VSV. Nhiệt độ thấp VSV không phát triển, nhiệt
độ cao VSV bị chết do biến tính protein và ADN. Vì vậy, thiết bị lên men cần có bộ
phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất cho VSV.
Độ hoà tan oxy và thông khí: Thiếu oxy sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào,
phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hoà tan oxy đáp ứng được với tốc độ sử dụng oxy
của VSV.
Như vậy, trong sản xuất cần nghiên cứu kỹ các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình

lên men để tối hoá các điều kiện tạo thuận lợi cho sinh tổng hợp các chất mong muốn.
[5], [8], [11]
1.7. Chiết tách, tinh chế kháng sinh
Tùy theo đặc tính của loài mà các kháng sinh được tiết vào môi trường nuôi cấy
(penicillin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nysatin…). Vì vậy để thu lấy
hoạt chất có độ tinh khiế cao cần chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp để
sản phẩm đạt chất lượng cao, đạt tiêu chuẩn dược điển, độ bền lâu và giúp hạ giá thành
sản phẩm.
Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
- Phương pháp tạo phức kết tủa.
- Phương pháp trao đổi ion.
- Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, …).
- Các phương pháp khác. [8], [2]

9


1.7.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đóng vai trò rất quan trọng vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường
kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp. Để thu được
kháng sinh có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp.
[8], [9]
1.7.2. Phương pháp chiết xuất
Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình chuyển
chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha lỏng không
đồng tan (1 pha là nước, 1 pha là DMHC).
Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào
nhau.Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng chiết lỏng lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng.Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế bào
nên tiến hành chiết lỏng rắn. [11], [2], [8]

1.7.3. Phương pháp tinh chế
Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng chất.
Phương pháp bao gồm: Chiết, thẩm thấu, sắc ký. [2], [8]
Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động
chạy qua pha tĩnh, phát hiện vết cần tách.
Nguyên lý tách: Mẫu phân tích hòa tan trong pha động (thường là dòng chảy
dung môi), pha động được di chuyển qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn
với nó, các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ tùy thuộc sự tương
tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan nên các thành phần sẽ được tách riêng biệt thành
dải trên sắc ký đồ nhờ tốc độ di chuyển khác nhau.
Một số phương pháp sắc ký thường dùng:
 Sắc ký lớp mỏng:
+

Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ

(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ).
+

Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf:
Rf =

Trong đó: dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
ddm: Khoảng cách dung môi chạy.

10


Rf phụ thuộc: Cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của

dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
 Sắc ký cột:
Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các
chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng
trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi
thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm
liên tục một lượng mới của pha động. [2], [6], [8]
1.8. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh
1.8.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại (IR) là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ
bức xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau.
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi
trạng thái dao động thì tạo nên 1 dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan giữa
nhóm nguyên tử và dải hấp thụ để nhận biết nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có
dải hấp thụ đặc trưng, đây chính là cơ sở để phân tích cấu trúc bằng phổ IR. [2]
1.8.2. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV - VIS)
Phổ UV - VIS là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào
bước sóng hay số sóng. Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại làm thay đổi mức năng
lượng của các electron từ trạng thái cơ bản E0 lên trạng thái kích E1, E2, …
Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết
đơn, liên kết bội, nhân thơm, … hoặc cặp eletron tự do không tham gia vào liên kết
của O, N, halogen. Vì vậy, dựa vào phổ hấp thụ UV ta có thể xác định các đặc điểm về
cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu.
Phổ UV - VIS được sử dụng để định tính bằng cách so sánh với phổ của chất
chuẩn đã có sẵn (về vị trí cực đại, cực tiểu và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng
đó), tuy nhiên phổ UV - VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu trúc nên vẫn thường sử
dụng phổ IR để xác định cấu trúc [2].
1.8.3. Phổ khối (MS)
- Phương pháp phổ khối là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng
cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối

11


lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên
tử của mẫu.
- Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình 50 - 100eV để bắn phá phân tử
hữu cơ ở chân không cao (10 mmHg). Khi các phân tử ở trạng thái khí va chạm với
một dòng electron có nặng lượng cao thì sẽ tách ra một hoặc hai ion và trở thành ion
có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2. Loại ion này gọi là ion gốc hay ion phân tử.
Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớ hơn thì
chúng sẽ bị vớ thành nhiều mảnh ion, thành các ion gốc hay các phân tử trung hòa
khác nhau. Khi tách ion có số khối khác nhau và xác định được xác suất có mặt của
chúng, ta vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan xác suất có mặt (cường độ I) và số khối Z.
Đó là phổ khối lượng.
- Dựa trên phổ thu được ta xác định được khối lượng phân tử và góp phần nhận
dạng cấu trúc hóa học của hợp chất. [2]
1.8.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân được xem là một phương pháp ưu việt áp dụng vào
việc nghiên cứu, biện giải và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Sự phát sinh các
tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ thuộc cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số v
của từ trường biến thiên, gọi là phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Những hạt nhân nguyên
tố có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự
nguyên tố là số lẻ thì có moment từ và có tín hiệu NMR. Có rất nhiều hạt nhân được
nghiên cứu nhưng Hydro và Carbon là phổ biến nhất. [2]
Phối hợp các phương pháp trên để biện giải cấu trúc kháng sinh.
1.9. Các nghiên cứu liên quan đến các kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces
1.9.1. Sản xuất 8-demethyl geladanamycin và 4,5-epoxy-8-demethyl geldanamycin
và các dẫn xuất có tác dụng điều trị ung thư từ Streptomyces hygroscopicus
Geldanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus, trong quá

trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-deoxy-8-demethyl geldanamycin được tinh chế từ
dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon, đặc tính có tác dụng chống
ung thư do tác dụng mạnh lên ATPase làm bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào
ung thư. Geldamycin đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển các thuốc điều trị ung
thư mới mà mục tiêu là ức chế Hsp90.

12


Tuy nhiên do khả năng hòa tan trong nước kém và độc tính gan kém, GA đã
không tiến lên trong các thử nghiệm lâm sàng. Để khắc phục các đặc tính không mong
muốn này, nhiều chất tương tự GA đã được tổng hợp chỉ khác nhau trong nhóm thế 17
của chúng.
Chúng bao gồm 17-allylamino-demethoxy geldamycin (17-AAG) đã hoàn
thành giai đoạn thử nghiệm 1 và 2 như là một phương pháp điều trị tiềm năng cho
bệnh đa u tủy. [26], [22]
1.9.2. Nghiên cứu về chủng Streptomyces Flavogriseus NJ-4-Chủng mới cho sản
xuất Actinomycin D và Holomycin (2017)
Các xạ khuẩn NJ-4 được phân lập từ đất của Đại học Nông nghiệp Nam Kinh
được xác định là S. flavogriseus. Loài S. flavogriseus này đã được tìm thấy lần đầu
tiên để sản xuất ra hai hợp chất kháng khuẩn được xác định là actinomycin D và
holomycin.
Hai hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn được tách ra từ dịch chiết thô kháng
khuẩn của Sephadex LH-20. Hợp chất đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn được phân
lập dưới dạng bột màu đỏ cam và được tinh chế thêm bằng HPLC với thời gian lưu
HPLC là 14,8 phút. Thành phần đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn có phổ UV-Vis
điển hình trong methanol với cực đại hấp thụ ở bước sóng 241nm và 443nm, tương tự
như Actinomycin D. Phổ IR (KBr) cho thấy sự hiện diện của nhóm -C=O (1746,23
cm-1 và 1646,91 cm -1 ) và -NH (3445,21 cm-1 và 3273,57 cm-1 ). Có các dải ở 2874,38

cm-1 và 2965,02 cm -1 tương ứng với C-H đối xứng và không đối xứng của nhóm
CH2. Phổ khối ESI-MS của hợp chất đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn cho thấy một
ion phân tử ở m/z 1255,22 [M + H] + và 1277,38 [M + Na] + , giống hệt với kết quả
quan sát được với Actinomycin D.
Hợp chất thứ hai có hoạt tính kháng khuẩn được phân lập dưới dạng lăng kính
màu vàng cam và được tinh chế thêm bằng HPLC với thời gian lưu HPLC là 9,4
phút. Phổ UV của hợp chất thứ hai có hoạt tính kháng khuẩn biểu hiện cực đại ở cực
đại ở bước sóng 386nm trong metanol, đặc trưng của vòng pyrroline. Phổ hồng ngoại
của thành phần hoạt động thứ hai giống hệt với phổ được công bố cho
holomycin. ESI-MS của hợp chất hoạt động thứ hai cho thấy một ion mạnh ở m/z
237.0 [M + Na] + , giống như đã quan sát thấy với holomycin. Các dữ liệu 1H và 13C
NMR của thành phần hoạt động thứ hai (500 MHz, DMSO-d 6 , 1H NMR: 2.02 ppm, s;

13


7.04 ppm, s; 9.83 ppm, s; 10,67 ppm, s; 13C NMR: 22,31 ppm, 110,45 ppm , 115,36
ppm, 133,69 ppm, 133,92 ppm, 167,87 ppm, 168,78 ppm) giống như phổ NMR của
holomycin. Dựa trên tất cả các thông tin trên, hoạt chất thứ hai được xác định là
holomycin.
Nghiên cứu này chỉ ra rằng S. flavogriseus NJ-4 thể hiện một khả năng riêng
biệt và tiềm năng công nghiệp sản xuất một lượng đáng kể Actinomycin D trong điều
kiện không tối ưu hóa. [28]

14


2CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: Giống xạ khuẩn Streptomyces 182.15 có HTKS mạnh
nhất được lưu sau đề tài nghiên cứu năm 2017, do bộ môn Vi sinh - Sinh học trường
Đại học Dược Hà Nội cung cấp. [13]
 Giống VK kiểm định: Các chủng VK kiểm địnhdo bộ môn Vi sinh - Sinh
học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được giới thiệu ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chủng VK kiểm định
Vi khuẩn Gr(+)

Vi khuẩn Gr(-)

Bacillus pumilus ATCC 10241

Shigella flexneri DT 112

 Môi trường nuôi cấy:
- Các môi trường nuôi cấy VK kiểm định giới thiệu ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Các môi trường nuôi cấy VK kiểm định
Thành phần

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước

MT

(g)

(g)

(g)

(g)

(ml)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

0

100 (vđ)

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,6 - 1,8

100 (vđ)

- Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn giới thiệu ở Bảng 2.3.

15

pH

7,0 - 7,4