Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 188.21

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THẾ AN

NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 188.21
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THẾ AN
Mã sinh viên: 1401001

NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 188.21
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PSG.TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận được thực hiện tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà
Nội, trong quá trình làm khóa luận tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ để
hoàn thiện khóa luận của mình.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Cao Văn Thu, người đã
định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và chỉ bảo tận tình cho tôi trong
suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn các thầy cô
giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy tại bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học
Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, thực hiện đề tài nghiên cứu tại bộ môn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, viện Hóa học
– viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Tổ môn Hóa dược công nghiệp
đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ bản thân còn hạn
chế nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tôi rất mong nhận
được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận này được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Dương Thế An


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................................... 2
1.1. Đại cương về kháng sinh ............................................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh ......................................................................................... 2

1.1.2. Phân loại kháng sinh ................................................................................................. 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ............................................................................... 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) ..................................................................... 3
1.2.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ...................... 4
1.2.2. Phân loại Streptomyces ............................................................................................ 4
1.2.3. Một số kháng sinh được tổng hợp từ chi Streptomyces ........................................... 5
1.3. Bảo quản và cải tạo giống ............................................................................................... 5
1.3.1. Bảo quản giống xạ khuẩn ......................................................................................... 5
1.3.2. Phương pháp cải tạo giống ....................................................................................... 6
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .................................................................................. 7
1.4.1. Lên men bề mặt ........................................................................................................ 7
1.4.2. Lên men chìm ........................................................................................................... 8
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ........................................................ 8
1.5. Thu sản phẩm và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men.................................................... 9
1.6. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ........................................................ 10
1.6.1. Phổ khối lượng (MS) .............................................................................................. 10
1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ...................................................................... 10
1.6.3. Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................................... 11
1.6.4. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS).......................................................................... 11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 12
2.1.1. Chủng giống VSV .................................................................................................. 12
2.1.2. Các môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 12
2.1.3. Dụng cụ, dung môi và hóa chất .............................................................................. 14
2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 14
2.3. Phương pháp thực nghiệm.......................................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong thạch nghiêng ........................................... 15
2.3.2. Xác định sơ bộ đặc điểm hình thái xạ khuẩn Streptomyces 188.21 ....................... 15
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ............................... 16
2.3.4. Phương pháp cải tạo và chọn giống ........................................................................ 17

2.3.5. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh .................................................. 19


2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng DMHC ..................................................... 19
2.3.7. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký ............................................................. 19
2.3.8. Phương pháp kết tinh kháng sinh ........................................................................... 20
2.3.9. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được......................................... 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ............................................. 21
3.1. Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 188.21.................................................... 21
3.2. Kết quả lựa chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng của kháng sinh do
Streptomyces 188.21 tổng hợp ............................................................................................ 22
3.3. Kết quả cải tạo giống ................................................................................................... 22
3.3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................................... 22
3.3.2. Kết quả đột biến ...................................................................................................... 23
3.4. Kết quả lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh ..................................................... 25
3.4.1. Chọn môi trường lên men chìm tốt nhất ................................................................. 25
3.4.2. Chọn dạng chủng, biến chúng lên men tốt nhất ..................................................... 25
3.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong
dịch lọc ................................................................................................................................. 26
3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc ............................... 26
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc ....................... 27
3.6. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh ............................................. 28
3.7. Kết quả tinh chế kháng sinh ....................................................................................... 28
3.7.1. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ..................................................... 28
3.7.2. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 ................................................................................. 29
3.7.3. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 ................................................................................. 30
3.7.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 3 ................................................................................. 31
3.7.3. Kết quả quá trình tinh chế kháng sinh .................................................................... 32
3.8. Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được ........................... 33
3.8.1. Phổ khối lượng (MS) .............................................................................................. 33

3.8.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ...................................................................... 33
3.8.3. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS) ......................................................................... 33
3.8.4. Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................................... 33
3.9. Bàn luận ........................................................................................................................ 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 38
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
16S rADN

16S ribosomal Acid 2’ deoxyribonucleic

̅
𝐷

Đường kính trung bình

13

13

C - NMR

C Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13carbon)
1

H – NMR

1

H Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

hydro)
ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

ATCC

American Type Culture Collection (Trung tâm giữ giống Hoa Kỳ)

C

Cytosine

COSY

Correlation Spectroscopy (Phổ tương quan)

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMHC

Dung môi hữu cơ

ĐBHH

Đột biến hóa học

G

Guanin

Gram (-)

Gram âm

Gram (+)

Gram dương

HMBC

HSQC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan đa liên
kết dị nhân)
Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ kết hợp lượng tử
đơn dị nhân)

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Infra Red – Phổ hồng ngoại

ISP

International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces
quốc tế)

KS

Kháng sinh

MS

Mass spectrometry – Phổ khối

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NMR

Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NXB

Nhà xuất bản


PCR

Polymerase Chain Reaction – Phản ứng khuếch đại gen

s

Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

SSC

Saline-sodium citrate – Dung dịch đệm muối citrat

UV-VIS

Ultraviolet–visible: Phổ tử ngoài – khả kiến

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học ............................................................... 2
Bảng 1.2: Một số kháng sinh mới được tổng hợp từ chi Streptomyces ..................................... 5
Bảng 2.1: Các VSV kiểm định ................................................................................................. 12
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) ...................................... 13
Bảng 2.3: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định ...................................................................... 13
Bảng 3.1: So sánh đặc điểm của chủng Streptomyces 188.21 với Streptomyces albidus theo
phân loại ISP ............................................................................................................................. 21
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên .................................................................. 22
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 ............................................................................ 23
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 ............................................................................ 24
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học ........................................................................ 24
Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men .......................................................... 25
Bảng 3.7: Kết quả thử HTKS chọn dạng, biến chủng lên men ................................................ 26
Bảng 3.8: Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh sau 1 ngày ............................... 27
Bảng 3.9: Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh sau 5 ngày ............................... 27
Bảng 3.10: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh trong dịch lọc ................ 28
Bảng 3.11: Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM .......................................... 29
Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1 ...................... 30
Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1 ....................... 30
Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2 ............................. 31
Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2 ....................... 31
Bảng 3.16: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3 ............................. 32

Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3 ....................... 32
Bảng 3.18: Kết quả phổ IR của KS1 ........................................................................................ 34
Bảng 3.19: Kết quả phổ IR của KS2 ........................................................................................ 34
Bảng PB.1: Môi trường phân loại xạ khuẩn theo ISP ........................................................ PL.15
Bảng PB.2: Các dung môi sử dụng..................................................................................... PL.16
Bảng PB.3: Các hóa chất sử dụng ...................................................................................... PL.17
Bảng PB.4: Kết quả thử HTKS với 9 VSV kiểm định ....................................................... PL.18
Bảng PB.5: Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau........................... PL.19
Bảng PB.6: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sàng lọc ngẫu nhiên ................................... PL.20
Bảng PB.7: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến UV lần 1 ................................ PL.21
Bảng PB.8: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến UV lần 2 ................................ PL.22
Bảng PB.9: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến hóa học .................................. PL.23


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình PH.1: Xác định HTKS bằng phương pháp khối thạch ................................................ PL.1
Hình PH.2: Phương pháp hiện hình VSV ............................................................................. PL.1
Hình PH.3: Tách kháng sinh bằng sắc ký cột ....................................................................... PL.2
Hình PH.4: KS tinh khiết thu được ...................................................................................... PL.2
Hình PH.5: Năm tìm ra một số kháng sinh quan trọng ........................................................ PL.3
Hình PH.6: Hình ảnh bào tử Streptomyces 188.21 chụp bằng kính hiển vi điện tử ............. PL.4
Hình PH.7: Phổ khối lượng của kháng sinh KS1 ................................................................. PL.5
Hình PH.8: Phổ khối lượng của kháng sinh KS2 ................................................................. PL.6
Hình PH.9: Phổ 13C-NMR của KS2 ..................................................................................... PL.7
Hình PH.10: Phổ 1H-NMR của KS2 .................................................................................... PL.8
Hình PH.11: Phổ DEPT của KS2 ......................................................................................... PL.9
Hình PH.12: Phổ DEPT của KS2 ....................................................................................... PL.10
Hình PH.13: Phổ UV-VIS của KS1 ................................................................................... PL.11
Hình PH.14: Phổ UV-VIS của KS2 ................................................................................... PL.12
Hình PH.15: Phổ IR của KS1 ............................................................................................. PL.13

Hình PH.16: Phổ IR của KS2 ............................................................................................. PL.14


ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1928, Alexander Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển S. aureus
của Penicillium notatum. Đến năm 1940, Chain và Flory đã chiết ra được penicillin từ
chủng Penicillinum chrysogenium có hoạt tính khác sinh cao hơn nhiều lần và đã cứu
được hàng ngàn thương binh trong chiến tranh thế giới lần thứ II [22]. Kể từ đó, các
công trình nghiên cứu kháng sinh được tiến hành, nhiều kháng sinh được tìm thấy và
ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng.
Tuy nhiên, ngày nay, tốc độ phát hiện thuốc đã chậm lại rõ rệt. Mặt khác, việc sử
dụng kháng sinh không theo chỉ định dẫn đến ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng
thuốc. Việt Nam và nhiều nước trên thế giới đang phải đối mặt với những bệnh nhiễm
khuẩn mới và bệnh do tác nhân kháng thuốc gây ra. Vì vậy, việc tìm kiếm các loại kháng
sinh mới được các nhà khoa học rất quan tâm.
Xạ khuẩn sản xuất một số lượng lớn các sản phẩm tự nhiên với các hoạt tính sinh
học khác nhau, đặc biệt là kháng sinh. Trong đó, chi Streptomyces là một đại diện nổi
bật bởi số lượng lớn nhất của các loài và giống, khác nhau rất nhiều về hình thái, sinh
lý học và khả năng sinh kháng sinh đặc biệt của chúng. Nhiều loài thuộc chi Strepomyces
được sử dụng để tổng hợp nên một số kháng sinh quan trọng được sử dụng nhiều trong
lâm sàng ngày nay như: Daptomycin (từ S. roseosporus), Lincomycin (từ S.
lincolnensis), Neomycin (từ S. fradiae), Streptomycin (từ S. griseus) ….[24].
Xuất phát từ những thực tế trên, tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu lên men
tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 188.21” với các mục tiêu sau:
 Xác định đặc điểm hình thái, phân loại xạ khuẩn nghiên cứu.
 Nghiên cứu cải tạo chủng xạ khuẩn ban đầu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh.
 Xác định môi trường lên men thích hợp, dung môi chiết xuất tốt nhất và tinh chế
kháng sinh.
 Xác định sơ bộ đặc điểm cấu trúc của chất kháng sinh tổng hợp được.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh
Có nhiều định nghĩa về kháng sinh, tuy nhiên định nghĩa theo Waskman (1942) có
ý nghĩa kinh điển: Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các VSV
tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV khác.
Tuy nhiên, định nghĩa này khá hạn chế vì ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo
ra bởi các VSV mà còn được tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học.
Do đó, ngày nay, kháng sinh được hiểu theo nghĩa rộng là các hợp chất nguồn gốc tự
nhiên hoặc tổng hợp và bán tổng hợp có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt chọn
lọc đối với các VSV nhiễm sinh ở nồng độ thấp, mà không có tác dụng hoặc tác dụng
yếu lên người, động vật hoặc thực vật [12].
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phân loại dựa theo cấu trúc hóa học, tính nhạy cảm của VSV với
kháng sinh, cơ chế tác dụng … trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng
phổ biến nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm
của chất kháng sinh mới phát hiện thông qua cấu trúc hóa học của nó. Theo cách phân
loại này, tại Việt Nam, kháng sinh được chia thành các nhóm như sau (Bảng 1.1) [2],
[11], [14] :
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
TT Tên nhóm

Phân nhóm

1

Các penicilin

Beta-lactam

Các cephalosporin
Các beta-lactam khác.
Carbapenem: Thienamycin, imipenem.
Monobactam: Aztreonam.
Các chất ức chếbeta-lactamase: Acid clavulanic .
2

Aminoglycosid

Streptomycin, gentamicin.

3

Macrolid

Erythromycin.

4

Lincosamid

Lincomycin .

5

Phenicol

Chloramphenicol.

2


6

Tetracyclin

Thế hệ 1: Tetracyclin.
Thế hệ 2: Doxycyclin.

7

Peptid

Glycopeptid: Vancomycin.
Polypetid: Valinomycin.
Lipopeptid: Daptomycin.

8

Quinolon

Thế hệ 1: Acid nalidixic.
Các fluoroquinolon: Thế hệ 2, 3, 4.

9

Các nhóm kháng sinh khác:
Sulfonamid.
Oxazolidinon: Linezolid
5-nitroimidazol.

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động và phát huy tác dụng:
kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn, đặc biệt có hiệu
quả ở các vi khuẩn đang sinh trưởng và phát triển mạn, bằng cách:
- Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn .
- Gây rối loạn chức năng màng bào tương.
- Ức chế sinh tổng hợp protein.
- Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic:gồm ba cấp độ:
 Ngăn cản sự sao chép của ADN mẹ tạo ADN con.
 Ngăn cản sinh tổng hợp ARN.
 Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết cho tế bào.
- Ức chế trao đổi hô hấp.
Như vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần cấu
tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của tế
bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào[2], [14].
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) , phát triển thành dạng sợi phân nhánh, có
tỷ lệ G + C > 55%, phân bố rộng rãi trong thiên nhiên (trong đất, nước và các cơ chất
hữu cơ), trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số xạ
khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Trong số khoảng
3


1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ
khuẩn. Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản

phẩm trao đổi chất quan trọng [3], [5].
Theo Waksman, các loài thuộc bộ xạ khuẩn có thể chia thành 3 họ chính: họ
Actinomycetaceae Buchman – bào tử không nằm trong túi, khuẩn ty cơ chất cắt ra thành
cầu hay hình que; họ Streptomycetaceae Waskman et Henrici – bào tử không nằm trong
túi hay nang – khuẩn ty cơ chất không tách ra thành dạng hình cầu hay que; và họ
Actinoplanaceae Couch – bào từ nằm trong túi và có khả năng di động. Trong họ
Streptomycetaceae Waskman et Henrici thì các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
Waskman et Henrici cho nhiều loại kháng sinh nhất, có cấu trúc phức tạp và trong số
này cũng có nhiều kháng sinh rất có giá trị [12], [18].
1.2.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
Xạ khuẩn chi Streptomyces thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, Gram (+), không nhuộm
kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử
nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột và
L-tyrosine. Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon. Nhiệt độ
sinh trưởng tối ưu là 25-35oC, pH tối ưu là 6,5-8,0. Thành tế bào chứa L-DAP và glycin,
không chứa acid mycolic. Tỷ lệ (G + C)% trong ADN khá cao, từ 60 – 75%.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường có dạng khô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có
thể có nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que cấy không di chuyển được khuẩn lạc
vì khuẩn ti cơ chất bám sâu vào trong thạch vì khuẩn ti cơ chất bám sâu vào trong thạch.
Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc phong phú: đỏ, cam, đen, lục,
nâu …
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí
sinh. Khuẩn ty khí sinh phát triển rất mạnh mẽ, sinh nhiều loại sắc tố khác nhau có khả
năng khuếch tán ra môi trường. Trong môi trường đặc hiệu, có loài có thể tạo ra sắc tố
melanoid màu sẫm đen. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất kháng sinh
[3], [5].
1.2.2. Phân loại Streptomyces
Để phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Waskman et Henrici trong họ
Streptomycetaceae Waskman et Henrici, khóa phân loại Streptomyces thuộc Chương

4


trình Streptomyces quốc tế (International Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb
đề xuất (1970) được sử dụng rộng rãi. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng được sử
dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa
tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử và khả năng tiêu thụ các nguồn hydratcarbon
[19].
Ngày nay, với việc áp dụng kĩ thuật xác định trình tự gen 16S rADN để phân loại
đã và đang được áp dụng. Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin cậy [3], [5],
[13].
1.2.3. Một số kháng sinh được tổng hợp từ chi Streptomyces
Cho đến ngày nay, xạ khuẩn vẫn là nguồn quan trọng để tổng hợp những kháng sinh
mới [17]. Kể từ năm 1940 – nay,khoảng trên 50% kháng sinh VSV có nguồn gốc từ chi
Streptomyces, điều này được thể hiện thông qua hình PH.5 (phụ lục trang PL.3) [24].
Nhiều loài thuộc chi Strepomyces được sử dụng để tổng hợp nên một số kháng sinh quan
trọng được sử dụng nhiều trong lâm sàng ngày nay như: Daptomycin (từ S. roseosporus),
Lincomycin (từ S. lincolnensis), Neomycin (từ S. fradiae), Streptomycin (từ S. griseus)
….
Bảng 1.2: Một số kháng sinh mới được tổng hợp từ chi Streptomyces
Loài

Tên kháng sinh

Khung cấu trúc

Tài liệu
tham khảo

Streptomyces mauvecolor

Piperidamycins

Cyclic peptide

[20]

Streptomyces aureus

Phosacetamycin

Phosphonate

[16]

Streptomyces monomycini

Argolaphos A/B

Phosphonopeptide

[21]

Streptomyces durhamensis

Valinophos

Phosphonopeptide

[21]

Streptomyces platensis

Platensimycin và Ketolides

[25]

platencin
Streptomyces scabrisporus

Okilactomycins

Spirotetronate

[26]

1.3. Bảo quản và cải tạo giống
1.3.1. Bảo quản giống xạ khuẩn
Việc giữ giống bằng phương pháp thích hợp có thể duy trì những hoạt tính ưu việt
của chúng, chống thoái hóa giống, mất hoạt tính. Một số phương pháp giữ giống:

5


-

Bảo quản trên môi trường thạch, định kỳ cấy chuyền: giống VSV được giữ trong

môi trường thạch nghiêng (đối với VSV hiếu khí) hoặc chích sâu vào thách (đối với
VSV kỵ khí), các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 6oC, định kì

kiểm tra cấy chuyền. Thời gian cấy chuyền có sự khác nhau ở các nhóm VSV nhưng
nằm trong giới hạn tối đa ba tháng.
- Giữ giống trong cát hoặc trong đất vô trùng: Cát và đất là những cơ chất tốt mang
các tế bào VSV, chủ yếu là nhóm VSV có bào tử. Cát và đất sau khi được xử lý sạch,
sàng lọc qua rây, xử lý bằng hóa chất để đảm bảo đạt độ trung tính, sấy khô và khử trùng
lặp để có độ vô trùng tuyệt đối. Sau đó trộn bào tử vào cơ chất cát hoặc đất trong các
ống nghiệm. Nút bông có phết một lớp parafin nóng chảy để ống giống không bị ẩm trở
lại. Phương này này áp dụng chủ yếu cho nhóm VSV sinh bào tử như nấm mốc hoặc xạ
khuẩn.
- Giữ giống bằng phương pháp đông lạnh: phương pháp dựa trên nguyên tắc sự ức
chế phát triển của VSV khi được đưa vào điều kiện lạnh sâu ở -25oC đến -70oC. Với
phương pháp này giống sẽ bảo quản được lâu. Thời gian cấy chuyền lại được kéo dài
hơn so với phương pháp bảo quản trên môi trường thạch.
- Giữ giống bằng phương pháp đông khô: phần nước ở trong tế bào và môi trường
có chất bảo vệ được thăng hoa ở nhiệt độ thấp để đảm bảo an toàn hơn cho sự sống của
tế bào giống. Hỗn hợp tế bào giống và dung dịch bảo vệ được chứa trong các ampul
được hàn kín bảo vệ ở 3-5oC hoặc nhiệt độ phòng [10].
1.3.2. Phương pháp cải tạo giống
VSV tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính
rất thấp. Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất cần phải cải
tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau.
-

Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết,
có cá thể HTKS mạnh gấp 10-30% những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt
tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất.

-

Phương pháp đột biến nhân tạo

6


Đột biến xảy ra dưới tác động của tác nhân đột biến mạnh với mục đích nâng cao tần
suất đột biến. Một số tác nhân đột biến:
 Các tác nhân vật lý: tia UV, tia rơnghen …
 Các tác nhân hóa học: HNO2, Ethylenimin, N-mustard…
Các tác nhân với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết các VSV, những cá
thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc làm
giảm khả năng sinh kháng sinh (đột biến âm), hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh (đột biến dương).
Để phương pháp đột biến một cách có hiệu quả thì cùng với quá trình đột biến, việc
tối ưu hóa phương pháp tuyển chọn có ý nghĩa quyết định. Việc tuyển chọn có thể ngẫu
nhiên hoặc chọn lọc. Với tuyển chọn chọn lọc có thể sử dụng các phương pháp: đóng
dấu Lederberg, phương pháp lọc làm giàu, kỹ thuật penicilin, kỹ thuật natri
pentaclophenylat, …[5], [8], [12].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Lên men là giai đoạn nuôi cấy VSV để chúng tạo ra sản phẩm hoặc sinh khối VSV
hoặc là sản phẩm trao đổi chất. Để thực hiện lên men người ta thường sử dụng hai
phương pháp là lên men bề mặt và lên men chìm.
1.4.1. Lên men bề mặt
Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc
môi trường bán rắn, rắn.
- Nuôi cấy trên bề mặt dịch thể (dùng cho VSV hiếu khí). Môi trường được pha
loãng với nồng độ thích hợp sau đó bổ sung nguồn nitrogen, nguồn khoáng…
- Nuôi cấy trên bề mặt môi trường bán rắn hay lên men bán rắn 9có thể dùng cho

VSV hiếu khí hoặc kị khí). Với phương pháp này nguyên liệu thường là gạo, đậu tương,
bột sắn, ngô…Các nguyên liệu chứa tinh bột trước khi sử dụng phải xử lý bằng cách nấu
chín hoặc đồ lên
Phương pháp lên men bề mặt có các ưu nhược điểm:
- Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị
thấp.
- Nhược điểm: hiệu suất sử dụng môi trường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động
hóa, tốn nhân công.

7


1.4.2. Lên men chìm
Phương pháp dùng cho cả VSV kị khí và hiếu khí. Khi lên men chìm, VSV được
nuôi cấy ở môi trường dịch thể. Trong quá trình lên men, thiết bị lên men cần được
khuấy đảo để tăng diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, ngăn cản sự
kết lắng tế bào, với VSV hiếu khí cần vừa khuấy trộn vừa sục khí liên tục để đảm bảo
cung cấp đầy đủ oxy.
Các phương pháp lên men chìm:
- Lên men mẻ: VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với một thể tích môi
trường xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc quá trình,
người ta thu lấy sản phẩm.
- Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc rút bớt dịch lên men và bổ
sung thêm môi trường dinh dưỡng không được thực hiện liên tục mà định kì sau những
khoảng thời gian nhất định.
- Lên men liên tục: người ta thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời bổ
sung thêm đồng lượng môi trường mới vào bình một cách liên tục.
- Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh
dưỡng để kéo dài sinh trưởng tế bào trong bình lên men. Do đó, nâng cao hiệu quả sử
dụng bình lên men.

Phương pháp lên men chìm có các ưu nhược điểm:
- Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm
mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa.
- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, khó xử lý cục bộ, cần cán bộ chuyên
môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường [5], [8], [12].
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- Nhiệt độ môi trường: Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến cường độ phát triển của
từng loại VSV mà còn chính khả năng sinh trưởng của chúng ở nhiệt độ đó. Quá trình
lên men luôn có sự tỏa nhiệt mạnh, do đó nhiệt độ thiết bị lên men sẽ tăng mạnh, có thể
vượt ngưỡng nhiệt độ thích hợp của VSV. Vì vậy, các thiết bị lên men cần trang bị hệ
thống làm mát để điều chỉnh nhiệt độ phù hợp.
- Độ ẩm: nước chiếm 70 – 90% khối lượng cơ thể VSV. Thiếu nước, VSV không
phát triển được và chỉ tồn tại ở dạng nghỉ hoặc bào tử. Nuôi VSV trên môi trường xốp
cần quan tâm đến lượng nước phù hợp (độ ẩm thường 60 – 70%).
8


- Oxy: phụ thuộc vào khả năng sử dụng oxy, người ta chia VSV thành 3 nhóm chính:
VSV hiếu khí, VSV kỵ khí và VSV kỵ khí tùy tiện. Với đặc tính của từng nhóm VSV,
việc điều chỉnh lượng oxy hòa tan là cần thiết.
- pH môi trường: mỗi loại VSV có khả năng sinh trưởng phát triển ở pH môi trường
khác nhau. Trong quá trình lên men, VSV tạo ra các sản phẩm mang tính axit hoặc kiềm
làm thay đổi pH môi trường gây ảnh hưởng đến hoạt động sống của chính VSV ấy [7],
[12].
1.5. Thu sản phẩm và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Việc thu sản phẩm với hiệu suất cao có ý nghĩa quyết định đến đến hiệu quả quá
trình lên men. Bởi vậy, việc tách và thu hồi sản phẩm phải được tính toán lưu ý ngay từ
lúc chọn chủng giống VSV để lên men, chọn nguyên liệu cũng như môi trường dinh
dưỡng.
Các sản phẩm của quá trình tổng hợp VSV thường được tích lỹ hoặc bên trong tế

bào hoặc ở trong pha lỏng của dịch nuôi cấy, cũng có trường hợp sản phẩm vừa nằm
trong tế bào, vừa nằm trong pha lỏng của dịch nuôi cấy.
Việc đầu tiên là tách tế bào VSV ra khỏi pha lỏng của dịch lên men: có thể dùng
phương pháp lọc (đối với VSV có cấu tạo hệ sợi như nấm, tảo) hay phương pháp li tâm
ở tốc độ cao (đối với VSV đơn bào, kích thước nhỏ như nấm men, vi khuẩn…). Đối với
mỗi loại sẽ có phương pháp chiết tách và tinh chế khác nhau [10].
Các phương pháp sử dụng để tinh chế kháng sinh: lọc, ly tâm, kết tủa, chiết bằng
dung môi, hấp phụ, điện di, thẩm tích, lọc màng chọn lọc, sắc kí… [8], [10].
Một số phương pháp tinh chế:
- Chiết xuất: Là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác, thường dùng
DMHC (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp nghiên
cứu.
+ Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau.
+ Đối với kháng sinh ngoại bào có thể dùng phương pháp chiết lỏng – lỏng với
các phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng. Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế bào sử dụng
phương pháp chiết lỏng - rắn.
- Sắc kí lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng hấp phụ khác
nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn hấp phụ. Pha tĩnh là một lớp mỏng gồm các
hạt có kích thước đồng nhất được kết dính lại trên một giá đỡ bằng nhôm, thủy tinh hay
9


chất dẻo. Pha động là một hệ thống dung môi hoặc hỗn hợp dung môi. Pha động di
chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của
các chất là hệ số Rf. Sắc kí lớp mỏng chế hóa có thể sử dụng để tinh chế kháng sinh.
- Sắc ký cột: Là phương pháp tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các
chất giữ hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc thành tấm phim màng mỏng trên bề
mặt chất rắn trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ
bề mặt pha tĩnh. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng
mới của pha động [8].

1.6. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
Hiện nay để xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ được tổng hợp hay phân lập từ
tự nhiên, người ta sử dụng các phương pháp phổ. Các phương pháp phổ thường sử dụng
nhiều trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ bao gồm: phổ hồng ngoại
(IR), phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS), phổ khối lượng hay phổ khối (MS) và phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR). Mỗi loại phổ trên có các đặc trưng riêng và cung cấp thông
tin khác nhau về chất hữu cơ cần khảo sát.
1.6.1. Phổ khối lượng (MS)
Hợp chất cần nghiên cứu được chuyển thành dạng hơi sau đó được ion hóa bằng
phương pháp thích hợp tạo ra các ion, các ion sẽ được ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối
lượng/ điện tích của chúng (m/z). Vì xác suất tạo ion có z > 1 là rất nhỏ nên m/z chính
là khối lượng ion. Như vậy máy phổ khối là thiết bị tạo ra các ion và xác định khối lượng
của chúng. Nếu ion phân tử được tạo ra đủ bền thì phân tử khối được xác định trực tiếp
là pic có giá trị m/z cao nhất.
Phân tích phổ khối lượng còn giúp xét đoán cấu trúc phân tử bằng việc qui mỗi pic
trên phổ là một mảnh phân tử xác định và chỉ ra sự tạo thành mảnh đó.
1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phương pháp này dựa vào sự tương tác của các nguyên tử, phân tử với từ trường.
Phổ thu được từ những phân tử có chứa hạt nhân có monen động lượng khác không
trong từ trường biến thiên. Có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng kĩ thuật NMR,
nhưng hydro và carbon là phổ biến nhất. Hiện nay có các phương pháp phổ một chiều:
1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT và phổ hai chiều COSY, HMBC, HSQC là những phổ quan

trọng cho biết thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử giúp xác định cấu trúc phân tử hợp
chất.
10

1.6.3. Phổ hồng ngoại (IR)
Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng: các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc
bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hơp chất
hoá học dao động với nhiều vận tốc khác nhau và làm xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là
phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương
pháp phổ hồng ngoại là cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các
phương pháp tính toán phức tạp.
1.6.4. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS)
Quá trình hấp thụ ánh sáng tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân tử
từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp
thụ ánh sáng UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại. Phổ tử ngoại – khả kiến
giúp ta có thể xác định các đặc điểm liên quan đến cấu trúc hóa học của phân tử chất
cần nghiên cứu [1], [4], [6], [9], [15], [23].

11


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Chủng giống VSV
- Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 188.21 đã được phân lập
và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp
và lưu giữ.
- VSV kiểm định
VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung
cấp (bảng 2.1):
Bảng 2.1: Các VSV kiểm định
Đặc trưng

Vi khuẩn Gram (+)

Vi khuẩn Gram (-)

Tên VSV kiểm định

Tên viết tắt

Bacillus cereus ATCC 9946

B. cereus

Bacillus subtilis ATCC 6633

B. subtilis

Bacillus pumilus ATCC 10241

B. pumilus

Sarcina lutea ATCC 9341

S. lutea

Staphyllococus aureus ATCC 1128

S. aureus

Proteus mirabilis BV 108

P. mirabilis

Escherichia coli ATCC 25922

E. coli

Shigella flexneri DT 112

S. flexneri

Salmonella typhi DT 220

S. typhi

2.1.2. Các môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 2.2.

12


Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)
Thành phần
Tinh bột

MT1

MT2

MT5

MT6

2,0

2,0

2,4

2,0

Glucose

MT7

1,0

Saccarose

3,0

Bột đậu tương

1,5

Bột ngô

2

0,1

Pepton

0,3

0,3

Cao thịt

0,3

0,5

KNO3

0,1

KCl

0,05

NaNO3

0,2

CaCO3

0,4

K2HPO4

0,05

0,1

MgSO4.7H2O

0,05

0,05

NaCl

0,05

0,2

0,1

Cao nấm men

0,5

Thạch

1,6-2,0

1,6-2,0

1,6-2,0

1,6-2,0

1,6-2,0

Nước vđ (ml)

100,0

100,0

100,0

100,0

100,0

7,0 – 7,2

6,8 – 7,2

7,0 – 7,2

7,0 – 7,2

7,0 – 7,2

pH

Với môi trường lên men dịch thể (MTdt) sử dụng để lên men chìm thì các thành phần

tương tự như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
- Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Pepton

Cao thịt

(g)

(g)

0,5

0,5

0,3

0,0

100,0

7,0 – 7,4

0,5

0,5

0,3

1,6 – 1,8

100,0

7,0 – 7,4

Thành phần

NaCl (g)

MT canh thang
MT thạch thường

13

Thạch (g)

Nước
(ml)

pH


Các môi trường ISP dùng để xác định sơ bộ đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn
Streptomyces 188.21 được giới thiệu trong bảng PB.1 (phụ lục trang PL.15 )
Các MT trên được tiệt khuẩn ở 118-120°C/ 30 phút. Các nguồn đường: D-glucose;
D-fructose; D-xylose được tiệt khuẩn theo phương pháp Tyndall.
Từng bình môi trường ISP9 sau khi đã tiệt khuẩn, để nguội đến 60°C, cho một trong
các nguồn đường trên vào sao cho nồng độ đường trong môi trường là 1%.
2.1.3. Dụng cụ, dung môi và hóa chất

- Các dung môi sử dụng được giới thiệu trong bảng PB.2 (phụ lục trang PL.16)
- Các hóa chất sử dụng được giới thiệu trong bảng PB.3 (phụ lục trang PL.17)
- Nguyên liệu cho chạy sắc ký
 Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60F254 Merck.
 Dung môi chạy sắc ký: các dung môi trên, pha thành các hỗn hợp chạy.
 Bình chạy sắc ký.
 Cột chạy sắc ký có đường kinh 1cm, dài 50cm.
 Hạt Silicagel 60 Merck có đường kính 0,040 – 0,063mm.
 Ống mao quản có kích thước phù hợp.
- Máy móc, thiết bị, dung cụ;
 Tủ cấy vô trùng AuraVF 48.
 Đèn UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 15W, điện thế 220V.
 Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030.
 Tủ sấy SL Shellab.
 Tủ ấm Memmert, Binder.
 Tủ lạnh Deawoo, Sanyo.
 Cân kỹ thuật Sartorius TE 210.
 Cân phân tích Sartorius BP 121S.
 Máy lắc Taitec Bio – Sharker BR 300Lf.
 Máy quét phổ UV – VIS Hitachi U-1900
 Thước kẹp, Palmer, bình chiết, bình nón, ống đong, đèn cồn, pipet, ống
nghiệm, đĩa Petri …
2.2. Nội dung nghiên cứu
▪

Nghiên cứu xác định hình thái xạ khuẩn
14


▪

Cải tạo chủng xạ khuẩn ban đầu

▪

Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh thu được

▪

Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong thạch nghiêng
Chủng Streptomyces 188.21 được cấy zigzac trên ống thạch nghiêng, cho vào tủ ấm
28oC, sau 6 – 10 ngày chủng phát triển tốt, cho các ống vào tủ lạnh bảo quản ở 2oC, định
kỳ 3 – 6 tháng cấy truyền 1 lần.
2.3.2. Xác định sơ bộ đặc điểm hình thái xạ khuẩn Streptomyces 188.21
Chuẩn bị giống gốc Streptomyces 188.21 được phân lập nuôi cấy trong ống thạch
nghiêng đủ 6 ngày.
Xác định đặc điểm hình thái, màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và
đánh giá khả năng tạo thành sắc tố hòa tan: các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5
được hấp tiệt trùng đổ vào đĩa Petri, mỗi môi trường làm 4 đĩa. Cấy zigzac bào tử
Streptomyces 188.21 lên bề mặt thạch. Để ở 28°C, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy
được 7, 14, 21 ngày.
- Màu của khuẩn ty khí sinh (màu của bề mặt khuẩn lạc): có thể có màu đỏ (R), vàng
(Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W). Trường hợp có các
màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau.
- Màu của khuẩn ty cơ chất: quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri),
thường có các màu vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời
hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không

thấy ký hiệu là (0).
- Sắc tố hòa tan nằm ngay trong môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Nếu
có ký hiệu là (1), nếu không có ký hiệu là (0).
- Xác định khả năng tạo sắc tố melanoid: nuôi cấy xạ khuẩn trên các MT ISP6, ISP7,
quan sát ở ngày thứ 2, ngày thứ 4. Sắc tố nếu có sẽ có màu nâu đen hoặc đen. Nếu có ký
hiệu là (1), nếu không có ký hiệu là (0).
- Khả năng tiêu thụ nguồn carbon: nuôi cấy bào tử trên các MT ISP9 có chứa các
nguồn đường khác nhau, đánh giá sự phát triển của xạ khuẩn tại ngày thứ 10 và 16. Nếu
bào tử phát triển mạnh hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên MT ISP9 chứa glucose (chứng
dương) thì ký hiệu là (+), nếu phát triển yếu hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên MT ISP9
15


không có nguồn đường (chứng âm) thì ký hiệu là (-), nếu phát triển mạnh hơn chứng âm
nhưng kém hơn chứng dương thì ký hiệu là (±). Mỗi nguồn đường làm với bốn đĩa Petri.
- Hình dạng chuỗi bào tử, kích thước và bề mặt bào tử quan sát dưới kính hiển vi
điện tử: Hấp tiệt trùng môi trường MT2 sau đó đổ ra đĩa Petri. Cấy zigzac bào tử
Streptomyces 188.21 lên bề mặt thạch. Để ở 28oC, sau 10 ngày đem chụp ảnh kính hiển
vi điện tử tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
- Các dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), thẳng hơi cong (Rf), móc câu (RA), xoắc ốc (S).
Bề mặt bào tử có thể có các dạng :phẳng, nhẵn (Sm), sần sùi (Wa), có gai (Sp), có tóc
(Ha) [19].
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định,
kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV
kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
- Tạo hỗn dịch VSV kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi trường
canh thang, ủ trong tủ ấm 37°C trong 18 – 24 tiếng, nuôi cấy tạo hỗn dịch vi khuẩn ổn
định có nồng độ 107-108 tế bào/ml.

- Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường sau khi đã hấp tiệt trùng và để
nguội đến 45 – 50°C với tỷ lệ Vgiống/ Vthạch thường = 1/40. Lắc đều để VSV kiểm định phân
tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa.
Các phương pháp thử:
- Phương pháp khối thạch: Đưa mẫu thử là các khối thạch đường kính từ 6,2 –
6,5mm lấy từ đĩa Petri (cấy zigzac xạ khuẩn) lên bề mặt môi trường VSV kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch đường kính 6,2 – 6,5mm trên môi
trường VSV kiểm định, sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng.
- Phương pháp khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc đường kính 6,2 – 6,5mm tẩm
dung dịch cần thử (3 lần), sấy khô ở 60°C, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt
môi trường VSV kiểm định.
Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 36 – 37°C trong 18 –
24 tiếng. Sau thời gian ủ tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn
đo bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm và được đánh giá theo công thức:

16