Khảo sát kiểu gen Cytochrome P450 3A4 Subtype 1B (CYP3A4*1B) trên bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Nghiên cứu Y học

KHẢO SÁT KIỂU GEN CYTOCHROME P450 3A4 SUBTYPE 1B
(CYP3A4*1B) TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG
Vũ Diễm My*, Hoàng Thị Phương Chi**, Bùi Hữu Hoàng***, ĐỗThị Thanh Thuỷ *

TÓM TẮT
Giới thiệu: Helicobacter Pylori (Hp) là nguyên nhân gây viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và đã
được ghi nhận là tác nhân gây ung thư dạ dày loại I (1, 2). Tuy nhiên, các nghiên cứu thống kê gần đây cho thấy tỉ
lệ thất bại trong tiệt trừ Hp ngày càng có xu hướng tăng. Tính đa hình kiểu gen Cytochrome P450 3A4
(CYP3A4) đã được ghi nhận là có sự ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính sinh học và khả năng tiệt trừ của các
kháng sinh. Đồng thời, các thuốc ức chế bơm proton (proton pump inhibitor - PPI) được sử dụng nhằm duy trì
pH dạ dày trung tính, giúp tăng hiệu quả tiệt trừ Hp;cũng được chuyển hoá một phần bởi enzyme này. Chính vì
vậy, việc xác định kiểu gen CYP3A4 là hết sức cần thiết nhằm cải thiện tỉ lệ tiệt trừ Hp.
Mục đích: Khảo sát kiểu gen CYP3A4*1B của bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng do Hp bằng phương
pháp giải trình tự.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả. Tối ưu hoá phản ứng PCR và giải trình tự. Sử
dụng các phần mềm tin sinh học xác định kiểu gen CYP3A4*1B. Tiến hành thu nhận mẫu sinh thiết dạ dày của
bệnh nhân viêm loét, ly trích thu DNA, thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự, phân tích kết quả và xác định
kiểu gen.
Kết quả: Áp dụng thành công quy trình PCR và giải trình tự xác định kiểu gen CYP3A4*1B trên bệnh
nhân. Thực hiện khảo sát trên 50 bệnh nhân, ghi nhận có 1 trường hợp bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử. Các
bệnh nhân còn lại mang kiểu gen đồng hợp tử.
Kết luận: Nghiên cứu áp dụng thành công quy trình PCR và giải trình tự nhằm xác định kiểu gen
CYP3A4*1B trên bệnh nhân.
Từ khoá: CYP3A4*1B, Helicobacter pylori, giải trình tự, thất bại điều trị.

ABSTRACT
CHARACTERISTIC OF CYTOCHROME P450 3A4 SUBTYPE1B (CYP3A4*1B) POLYMOPHISMS BY

USING MULTIPLEX REAL-TIME PCR
Vu Diem My, Hoang Thi Phuong Chi, Bui Huu Hoang, Do Thi Thanh Thuy
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016:319 - 323
Background: Helicobacter Pylori (Hp) causes chronic gastritis, gastric and duodenal ulcer. It also has been
recognized as class I gastric carcinogen. Unfortunately, the recent stastistics have shown that Hp eradication
efficacy seems lower. The antibiotic resistance is reported for affecting to unresponded treatment. Many antibiotics
used in Hp eradiacation that calalyzed by the Cytochrome P450 (CYP) system. CYP3A4 enzyme is the main path
among them, as well as has been recorded for greatly contribution to variations in bioavailability and clearance of
many antibiotics. CYP3A4 catalyzes proton pump inhibitors (PPIs), one of the most necessary drugs, as well.
Therefore, the determination of CYP3A4 will help to enhancethe treatment.

* Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp. HCM
** Đại học Khoa học tự nhiên Tp. HCM *** Bệnh viện Đại học Y Dược Tp. HCM
Tác giả liên lạc: CN. Vũ Diễm My
ĐT: 0919 789 811
Email:

Tiêu Hóa

319


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Objectives: Characterized CYP3A4*1B genotype of patients by using sequencing technique.
Methods: This is a cross section study. PCR and Sanger sequencing procedures were optimized. Using the
bioinformatics for analyzing sequencing results. The biopsy of ulcer patients was collected for DNA extraction,
PCR and sequencing to define the genotypes.

Results: Successfully applied PCR and sequencing techniques for determining CYP3A4*1B genotype of 50
patients. The results recorded one case what had heterozygeous genotype while remaining cases with homozygeous
genotype.
Conclusions: Successfully optimized PCR and sequencing proceduresfor identifying CYP3A4*1B
polymorphism.
Keywords: Real-time PCR, CYP2C19 polymorphism, Helicobacter pylori, eradicative treatment.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm Hp là một trong những nguy cơ gây
ung thư dạ dày được biết rõ nhất (10). Có khoảng
90% các trường hợp viêm dạ dày có sự hiện diện
của vi khuẩn Hp. Tương tự, tỷ lệ này chiếm từ 75
- 85% trong bệnh loét dạ dày; 95 - 100% ở bệnh
loét tá tràng; còn trong biến chứng thủng loét dạ
dày tá tràng thì sự hiện diện của loại vi khuẩn
này chiếm từ 80 - 95% các trường hợp. Chính vì
vậy, việc điều trị tiệt trừ Hp là rất cần thiết nhằm
ngăn ngừa các biến chứng như xuất huyết; loét
thủng dạ dày; và nặng hơn nữa là ung thư dạ
dày, tá tràng.
Hp là xoắn khuẩn có dạng hình cánh én, với
kích thước dao động từ 0,5 - 1µm. Nhờ có các
đặc tính sinh lý, sinh hóa chúng có thể tồn tại
trong môi trường pH acid thấp ở dạ dày và gây
bệnh(10). Trên 50% dân số thế giới nhiễm Hp(3,6).
Tỷ lệ nhiễm Hp tăng theo lứa tuổi và chiếm tỉ lệ
cao ở các nước đang phát triển. Điển hình ở
Canada và Mỹ tỷ lệ nhiễm Hp ở người trưởng
thành khoảng 30%, trong khi đó ở Ethiopia tỷ lệ
này lên đến 95% (6). Ở nước ta khoảng 70% người

trưởng thành nhiễm Hp.
Hiện nay, phác đồ điều trị tiệt trừ Hp là sử
dụng thuốc ức chế bơm proton (proton pump
inhibitor - PPI) kết hợp hai loại kháng sinh khác
nhau (4). Tuy nhiên, sự giảm tiết acid dịch vị do
PPI có thể gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ các
kháng sinh này(7). Đồng thời, tỷ lệ kháng thuốc
cao cũng là một trong những nguyên nhân chính
dự báo thất bại điều trị.

320

CYP3A4 là enzyme có tính đa hình cao thuộc
hệ thống Cytochrome P450 (CYP), chịu trách
nhiệm chuyển hoá khoảng 50% các loại thuốc
được thương mại hoá(5). Gen CYP3A4 bao gồm
13 exon và nằm trên nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí
7q22.1. Tính đến nay, đã có khoảng 23 biến thể
CYP3A4
được
ghi
nhận
( Sự tương tác giữa các loại thuốc (drug drug interactions) sử dụng trong tiệt trừ Hp như
clarithromycin, amoxicillin với PPI cũng chịu
ảnh hưởng bởi enzyme này. Mặt khác, tỷ lệ kiểu
gen CYP3A4 thay đổi tùy mỗi quần thể. Do đó,
nếu sử dụng cùng một liều thuốc cho tất cả bệnh
nhân sẽ dẫn đến tỷ lệ thành công trong tiệt trừ
Hp không đồng nhất. Vì vậy, việc xác định tính
đa hình kiểu gen CYP3A4 sẽ giúp tối ưu hoá

hiệu quả tiệt trừ Hp.

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu cắt ngang mô tả.

Đối tượng nghiên cứu
50 bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng đến
thăm khám và điều trị tại Bệnh viện Đại học Y
dược Tp.HCM từ tháng 01/2015 đến tháng
10/2015.

Phương pháp nghiên cứu
Ly trích DNA từ mẫu mô: mẫu mô sau khi tiến
hành xét nghiệm CLO test sẽ được thu nhận và
xử lý với proteinase K, sau đó ly trích bằng bộ kit

Chuyên Đề Nội Khoa I


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
Boom (Nam Khoa) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
Khảo sát và tối ưu hoá phản ứng PCR: mồi của
phản ứng được tham khảo từ công trình của tác

Nghiên cứu Y học

giả A Sapone, phản ứng PCR được thực hiện
bằng bộ kit TaKaRa Taq™ Hot Start Version

(Takara) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 1: Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR và giải trình tự (8)
Tên mồi

Trình tự (5’ - 3’)

CYP3A4 3B
CYP3A4 2B

CTCTGTCTGTCTGGGTTTGG
CCTTTCAGCTCTGTGTTGCTC

Kích thước
(base pair)
20
21

Nhiệt độ bắt cặp

Kích thước sản phẩm
(base pair)

o

501

54 C

Giải trình tự và phân tích kết quả: phản ứng

giải trình tự được thực hiện bằng bộ kit Big Dye
Terminator V3.1 (ABI) theo hướng dẫn của nhà
sản xuất. Sử dụng phần mềm CLC Main
Workbench để phân tích kết quả.

Các thành phần của phản ứng PCR bao gồm:
1,5l PCR 10X buffer, 1,5l dNTPs, 0,75l mồi
CYP3A4 3B, 0,75l mồi CYP3A4 2B, 0,1l Takara
Taq Hotstart Polymerase, 3l genomic DNA (20 50ng/ul), 8,4l nước cất hai lần khử ion.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả giải trình tự và phân tích kết quả xác
định kiểu gen CYP3A4*1B: sử dụng phần mềm
CLC Main Work Bench để phân tích dữ liệu thô,
kết quả giải trình tự được thể hiện qua những
đỉnh sóng màu khác nhau, nucleotide A được
mã hoá bằng đỉnh sóng màu xanh lá, nucleotide
C được mã hoá bằng đỉnh sóng màu xanh
dương, nucleotide T được mã hoá bằng đỉnh
sóng màu đỏ, nucleotide G được mã hoá bằng
đỉnh sóng màu xanh đen.

Kết quả thu nhận mẫu bệnh phẩm: tổng số mẫu
thu nhận là 50. Đặc điểm các mẫu được thể hiện
trong bảng sau:
Bảng 2: Đặc điểm các mẫu bệnh thu nhận
Tuổi
Tỷ lệ nam/nữ
Pylori test dương/âm

28 - 72
19/31
43/7

Kết quả tối ưu phản ứng PCR: tiến hành khảo
sát nhiệt độ bắt cặp (50oC, 52oC, 54oC, 56oC,58oC)
và các thành phần khác của phản ứng. Kết quả
thu nhận nhiệt độ tối ưu của phản ứng là 54oC.

Trường hợp bệnh nhân mang kiểu CYP3A4
bình thường (AA) sẽ cho một đỉnh sóng A màu
xanh lá, nếu bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp
CYP3A4*1B (GA) sẽ cho tín hiệu sóng đôi, nếu
bệnh nhân mang kiểu gen biến đổi CYP3A4*1B

Tiêu Hóa

đồng hợp (GG) sẽ cho một đỉnh sóng G màu
đen. Kết quả khảo sát trên 50 mẫu bệnh, ghi
nhận có một mẫu mang kiểu gen dị hợp
CYP3A4*1B các mẫu còn lại mang kiểu gen bình
thường.

321


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

BÀN LUẬN
Trong những năm gần đây, việc điều trị tiệt
trừ Hp trong các bệnh lý viêm, loét dạ dày tá
tràng đang phải đối mặt với nhiều thách thức, do
tỷ lệ thất bại ngày càng có xu hướng tăng. Đã có
nhiều yếu tố được xác định là nguyên nhân làm
giảm hiệu quả điều trị Hp. Trong đó, hai yếu tố
quan trọng là việc sử dụng kháng sinh không
hiệu quả và ức chế toan không tốt do dùng PPI
không đủ liều lượnglà nguyên nhân chủ yếu.

Như đã đề cập ở trên, gen CYP3A4 có
khoảng 23 biến thể được ghi nhận, trong đó kiểu
gen CYP3A4*1B là dạng phổ biến nhất.
CYP3A4*1B nằm tại vị trí -392 vùng promoter
gen CYP3A4, đây là dạng có đột biến thay đổi
nucleotide A thành G dẫn đến tạo các protein
khiếm khuyết làm giảm hoạt tính enzyme. Có
khoảng 53% người Mỹ gốc Phi được ghi nhận
mang kiểu biến thể này, ở người da trắng tỉ lệ
này là 9% và chưa được ghi nhận trên người
châu
Á
( />articles/genetic-polymorphisms-cytochromep450-cyp3a4-enzyme). Tuy nhiên, theo kết quả
khảo sát trên 50 bệnh nhân ghi nhận 1 trường
hợp mang kiểu gen dị hợp CYP3A4*1B, cho thấy
cần phải tiến hành khảo sát với số mẫu lớn hơn
để xác định tỉ lệ phân bố kiểu biến thể này trên
dân số Việt Nam.

KẾT LUẬN

Hình 2: Các yếu tố dẫn đến thất bại trong điều trị tiệt
trừ Hp
Sự chuyển hoá các loại kháng sinh sử dụng
trong điều trị Hp như: clarithromycin,
metronidazole được thực hiện chủ yếu bởi
enzyme CYP3A4. Các kháng sinh khác như
amoxicillin tuy không được chuyển hoá trực tiếp
bằng enzyme này nhưng cũng chịu sự tác động.
Do đó, hoạt động của enzyme CYP3A4 có ảnh
hưởng lớn đến hiệu quả điều trị Hp(8). Các PPI
cũng được chuyển hoá một phần thông qua con
đường này. Sự giảm tiết acid dịch vị của PPI đã
được ghi nhận là gây ảnh hưởng đến sự hấp thu
của các thuốc khác. Độ hòa tan thuốc có thể giảm
ở pH trung tính so với điều kiện có tính acid.
Khoảng 10 - 20% bệnh nhân sử dụng PPI không
ghi nhận hiệu quả kháng tiết acid mà nguyên
nhân chủ yếu là do sự chuyển hoá thuốc bị ảnh
hưởng bởi tính đa hình kiểu gen(9). Chính vì vậy,
việc xác định kiểu biến thể CYP3A4 là rất cần
thiết nhằm tối ưu hiệu quả tiệt trừ Hp.

322

Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu
quy trình PCR và giải trình tự xác định kiểu biến
thể CYP3A4*1B, quy trình này có thể được sử

dụng để khảo sát vai trò của CYP3A4*1B trong
việc chuyển hoá các loại thuốc khác trên nhiều
nhóm bệnh lý khác nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

5.
6.

7.

Amieva MR, et al (2008). "Host-bacterial interactions in
Helicobacter pylori infection", Gastroenterology. 134(1), 306323.
Anzenbacher P, et al (2003). "Cytochromes P450: review on
their basic principles"Proceedings-indian national science
academy part B. 69(6), 883-892.
Billard A, et al (2012). "The allele-specific probe and primer
amplification assay, a new real-time PCR method for fine
quantification of single-nucleotide polymorphisms in pooled
DNA", Applied and environmental microbiology. 78(4), 10631068.
Chaudhry AS, et al (2008). "Genetic polymorphism of
CYP2C19 and therapeutic response to proton pump
inhibitors", Indian J Med Res. 127(6), 521-530.

Ekroos M, et al (2006). Structural basis for ligand promiscuity
in cytochrome P450 3A4. PNAS. vol. 103, no. 37, 13682 - 13687.
Hunt RH, et al. (2011), "Helicobacter pylori in developing
countries. World Gastroenterology Organisation global
guideline", J Gastrointestin Liver Dis. 20(3), 299-304.
Ogawa R, Echizen H (2010). Drug - drug interaction profiles of
proton pump inhibitors. Clin. Pharmacokinet. 49(8), 509-533.

Chuyên Đề Nội Khoa I


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
8.

9.

Sapone A, et al (2003). The Clinical Role of Cytochrome P450
Genotypes in Helicobacter pylori Management. The American
Journal of Gastroenterology. Vol. 98, No. 5, 1010-1015.
Shimatani T, et al (2006). Acid-suppressive effects of
rabeprazole, omeprazole, and lansoprazole at reduced and
standard doses: a crossover comparative study in
homozygous extensive metabolizers of cytochrome P450
2C19. Clin. Pharmacol. Ther. 79(1), 144-152.

Tiêu Hóa

10.

Nghiên cứu Y học

Wroblewski LE, et al (2010). "Helicobacter pylori and gastric
cancer: factors that modulate disease risk", Clinical
microbiology reviews. 23(4), 713-739.

Ngày nhận bài báo:

20/11/2015

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

30/11/2015

Ngày bài báo được đăng:

15/02/2016

323