Xây dựng quy trình định lượng polysacharid trong cao mã đề bằng phương pháp đo quang

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG POLYSACHARID TRONG CAO MÃ ĐỀ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
Lê Thị Lan Phương∗, Lâm Ngọc Thọ∗∗, Nguyễn Ngọc Khôi**

TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Mã ñề Plantago major L. ñược sử dụng với nhiều mục ñích trong Y học cổ truyền
trên toàn thế giới. Tuy vậy, cho ñến nay tại Việt Nam, việc sử dụng cao Mã ñề trong các chế phẩm trị liệu còn
rất hạn chế, một phần có thể do cao Mã ñề chưa có tiêu chuẩn xây dựng ñể ñịnh lượng.
Xây dựng phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần bằng phương pháp so màu, sử dụng acid D
(+) galacturonic làm chất chuẩn.
Phương pháp: Polysaccharid ñược chiết từ cao toàn phần bằng nước nóng, sau ñó làm tủa
polysaccharid bằng ethanol 95%. Tủa này cho phản ứng với dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc. Sau
ñó hòa tan trong ethanol 95%. Đo sản phẩm tạo thành bằng máy ño quang phổ UV-Vis ở cực ñại hấp thu
422 nm. Phản ứng ñược thực hiện song song với acid D (+) galacturonic chuẩn.
Kết quả: Kết quả thẩm ñịnh qui trình cho thấy có thể ứng dụng ñể ñịnh lượng polysaccharid trong cao
chiết mã ñề.
Kết luận: Xây dựng và thẩm ñịnh qui trình ñịnh lượng polysaccharid toàn phần trong cao mã ñề, sử
dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn.
Từ khóa: Mã ñề Plantago major L., polysaccharid, acid D (+) galacturonic.

ABSTRACT
QUANTITATIVE ANALYSIS OF POLYSACCHARIDES FROMPLANTAGO MAJOR EXTRACT
Le Thi Lan Phuong, Lam Ngoc Tho, Nguyen Ngoc Khoi
Background and aims: Plantago major L. has been used as a medicinal material for many years. The
biological activity of this type of plant material is due to a complex of biologically active compounds in
which the polysaccharides are particularly noteworthy. The present study was undertaken to develop and
validate quantitative method for analysis the total content of polysaccharides in Plantago major extracts.
Methods: The polysaccharides from P. major extracts were developed by Dreywood method, converted
to galacturonic acid.
Results: This quantitative determination is inexpensive, simple, sensitive, and reproducible.
Conclusion: This method is appliable to determine the polysaccharide content of Plantago major

extracts.
Key words: Plantago major L., polysaccharide, D (+) galacturonic acid, quantitative analysis
ĐẶT VẤN ĐỀ
Mã ñề Plantago major L. ñược sử dụng với nhiều mục ñích trong Y học cổ truyền trên toàn thế giới như
có tác dụng tốt ñối với bệnh lao, ung thư và ñặc biệt ñối với các thể nặng của loét dạ dày. Cao chiết từ lá khô
có tác dụng kích thích sự tái sinh tất cả các lớp của da, tác dụng lợi tiểu, làm tăng lượng nước tiểu, ure, acid
uric và muối trong nước tiểu. Cao cồn có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt ñối với tổn thương gan gây bởi CCl4
trên ñộng vật. Hoạt chất aucubin phân lập từ hạt mã ñề có tác dụng bảo vệ gan và chống ngộ ñộc nấm
Amanita [1],[3],[5],[6].Tuy vậy, cho ñến nay tại Việt Nam, việc sử dụng cao mã ñề trong các chế phẩm có mục
ñích trị liệu còn rất hạn chế, một phần là do cao mã ñề chưa có tiêu chuẩn xây dựng ñể ñịnh lượng. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần bằng phương pháp so
màu sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn theo phương pháp của D. N. Olennikov [4].
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hóa chất, dung môi:
Dung môi sử dụng chiết xuất là loại dược dụng, dung môi và hóa chất dùng trong phân tích, ñịnh lượng
dùng loại PA (Pure Analysis) hoặc AR (Analysis Reagent): anthron PA (Merck), acid sulfuric PA, acid
hydrocloric PA (Prolabo), acid D (+) galacturonic PA (Fluka-Slovakia), ethanol PA (Merck),
Thiết bị:
Máy ño quang phổ UV-Vis Hitachi U-1900, máy ly tâm Sigma

∗

Khoa Y học Cổ Truyền- Đại học Y Dược Tp. HCM
Khoa Dược – Đại học y Dược Tp. HCM
Địa chỉ liên hệ: DS. Lê Thị Lan Phương
ĐT:0907748591
∗∗

Email:

147


Cao chiết Mã ñề:
Thu mua Mã ñề còn tươi vào tháng 03/2009 tại chợ Nguyễn Văn Trỗi, loại bỏ những thân, lá bị sâu
bệnh, rửa sạch, bỏ rễ, phơi âm can và xay thô. Bột Mã ñề sau ñó ñược ngấm kiệt bằng cồn 50% với tỷ lệ
dung môi: dược liệu là 10:1. Tất cả dịch chiết sau ñó ñược cô cách thủy ñến khi ñược cao chiết với ñộ ẩm
12,43%, hiệu suất chiết sau khi ñã trừ ẩm là 20%.
Phương pháp xử lý mẫu:
Cân chính xác khoảng 1 g cao cho vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước nóng. Đun cách thủy trong 1 giờ,
làm lạnh. Lọc vào bình ñịnh mức 50 ml. Thêm khoảng 20 ml nước nóng và chiết thêm 1 lần nữa trong ñiều
kiện tương tự. Bổ sung nước cho tới vạch (dung dịch A).
Lấy 2 ml dung dịch A, thêm 4 ml ethanol 95%, khuấy ñều và cách thủy 10 phút. Sau ñó ñể nguội và ly
tâm 3000 vòng/10 phút. Gạn bỏ dịch. Thêm vào tủa 5 ml ethanol 95%, tiến hành các bước tương tự như trên.
Sau khi ly tâm bỏ dịch, dùng hơi nóng loại bỏ vết của ethanol. Thêm 4 ml dung dịch 0,2% anthron/H2SO4
ñậm ñặc, ñem cách thủy hỗn hợp phản ứng trong 10 phút. Để nguội, cho vào bình ñịnh mức 25 ml, bổ sung
ethanol 95% ñến vạch (dung dịch B).
Mẫu chuẩn ñược thực hiện ñồng thời với mẫu thử khi cho phản ứng với dung dịch 0,2% anthron/H2SO4
ñậm ñặc. Dung dịch mẫu trắng là 4 ml dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc trong bình ñịnh mức 25 ml,
bổ sung ethanol 95% ñến vạch.
Quét phổ mẫu thử và mẫu chuẩn từ 700 – 350 nm tìm ñỉnh hấp thu cực ñại ñể tiến hành ñịnh lượng.
Thẩm ñịnh qui trình:
Bao gồm: khảo sát ñộ lặp lại, ñộ chính xác của phương pháp và khoảng tuyến tính của nồng ñộ ñịnh
lượng. Từ ñó suy ra lượng polysaccharid toàn phần có trong cao chiết quy về acid D (+) galacturonic.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Phổ UV-Vis tìm bước sóng hấp thu cực ñại

1

2

Hình 1. Bước sóng hấp thu cực ñại của chuẩn và mẫu thử
Mẫu chuẩn (1) và thử (2) có ñỉnh hấp thu cực ñại ở bước sóng 422 nm, vì thế chọn bước sóng này ñể
ñịnh lượng. Theo tác giả D. N. Olennikov thì mẫu chuẩn và thử có ñỉnh hấp thu cực ñại là 424 nm [5]
Khoảng tuyến tính
Khảo sát sự tuyến tính giữa lượng acid D (+) galacturonic và ñộ hấp thu theo phương pháp tiến hành trên
với lượng mẫu từ 160 – 560 µg, sau ñó sử dụng MS-Excel ñể phân tích hồi quy (regression analysis) ta có
dạng ước tính của phương trình tương quan tuyến tính là Ŷ = 0,0014 X – 0,0085. Trắc nghiệm tính tương
thích của phương trình và ý nghĩa của hệ số hồi quy cho thấy phương trình hồi quy tuyến tính giữa lượng
acid D (+) galacturonic và ñộ hấp thu là Y = 0,0014X [2]
Khoảng tuyến tính là 160 – 560 µg ñể tính lượng mẫu thử cần thiết cho ñịnh lượng, ñồng thời tiến hành
thử ñộ ñúng và ñộ chính xác của qui trình trong khoảng tuyến tính này.

148


Bảng 1. Sự tương quan giữa lượng acid D (+) galacturonic và ñộ hấp thu
Lượng acid D (+) galacturonic (µg)
(X)
160
240
320
400
480
560

Độ hấp thu (Y)
0,208
0,307
0,44

0,543
0,632
0,753

Độ chính xác:
Bảng 2. Kết quả khảo sát ñộ chính xác
Lần thử

Độ hấp thu

Hàm lượng (%)

1

0,568

100,0

2

0,564

99,29

3

0,567

99,82

4

0,562

98,94

5

0,56

98,59

6

0,563

99,12

Trung bình X = 99,29 ; SD = 0,487 ; CV = 0,49%

Kết quả khảo sát ñộ chính xác cho thấy qui trình ñịnh lượng polysaccharid trong mã ñề có ñộ chính xác
cao (CV = 0,49% < 2%), ñáp ứng yêu cầu ñối với một phương pháp ñịnh lượng.
Độ ñúng:
Thực hiện bằng cách lần lượt thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn bằng 100% ± 10% hàm lượng chất
có trong mẫu.

Bảng 3. Kết quả khảo sát ñộ ñúng
Lượng Lượng
Tổng
mẫu thêm (µg) lượng

(µg)
(µg)
207,5

Độ hấp Lượng
Tỷ lệ
thu
tìm thấy phục hồi
(%)
0,282

207,5

160

367,5

0,493

150,7

94,1

207,5

160

367,5

0,495

152,1

95,1

207,5

160

367,5

0,498

154,2

96,4

207,5

190

397,5

0,550

191,4

100,8

207,5

190

397,5

0,545

187,8

98,9

207,5

190

397,5

0,546

188,6

99,2

207,5

224

431,5

0,587

217,9

97,3

207,5

224

431,5

0,578

211,4

94,4

207,5

224

431,5

0,590

220

98,2

Trung bình: 97,16

Qui trình ñịnh lượng có tỷ lệ phục hồi trung bình là 97,16% (ñạt yêu cầu khi từ 98-102%). Tỷ lệ phục hồi
này có thể chấp nhận ñược vì ñây là qui trình ñịnh lượng dược liệu.
Kết quả thẩm ñịnh qui trình cho thấy phương pháp vừa xây dựng trên có thể ứng dụng ñể ñịnh lượng
polysaccharid trong cao chiết mã ñề.
Hàm lượng polysaccharid
Polysaccharid toàn phần có trong cao chiết ñược tính theo công thức sau:
AC/AT = CC/CT
Trong ñó: Nồng ñộ CC = 400 µg
Độ hấp thu mẫu chuẩn AC = 0,543

149


Độ hấp thu mẫu thử AT = 0,568
CT = (0,568 x 400) /0,543 = 418,4 µg
Từ CT tính % polysaccharid có trong cao chiết X = (CT x 25 )x(100/m)/106
25 là nồng ñộ pha loãng, 106 hệ số ñổi µg ra gam
m lượng cân mẫu (1 gam)
X= (418,4 x 25) x (100/1) / 106 = 1,046% tính theo cao toàn phần.
Kết quả ñược lặp lại 3 lần, lấy số trung bình
KẾT LUẬN
Phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần trong cao mã ñề sử dụng acid D (+) galacturonic làm
chất chuẩn xây dựng và thẩm ñịnh nêu trên cho thấy với phương pháp tương ñối ñơn giản, nhanh chóng từ
cách xử lý mẫu ñến ñiều kiện phân tích, ñảm bảo tính tuyến tính, ñộ ñúng và chính xác. Phương pháp này
hoàn toàn có thể áp dụng trong việc ñịnh lượng cao chiết Mã ñề, nhằm tiêu chuẩn hóa các công thức có sử
dụng cao Mã ñề trong mục ñích ñiều trị.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chiang L.C., Chiang W., Chang M.Y., Ng. L.T., Lin. C.C. (2002), Antiviral activity of Plantago
major extracts and related compounds in vitro, Antiviral Research, pp. 55, 53–62

2. Đặng Văn Giáp (2003),Trắc nghiệm giả thuyết trong nghiên cứu khoa học, ĐHYD Tp. HCM khoa
Dược.
3. Lezama R.V., Aguilar R. T., Ramos R. R., Avila E. V., Gutiérrez M. P. (2006), Effect of Plantago major
on cell proliferation in vitro, Journal of Ethnopharmacology, pp. 103, 36-42
4. Olennikov D.N., Tankhaeva L. M. and Samuelsen A. B. (2006), Quantitative analysis of
polysaccharides from Plantago major leaves using the Dreywood method, Chemisty of Natural
Compounds, 42, No. 3, pp. 265-268.
5. Samuelsen A.B,(2000),The traditional uses, chemical constituents and biological activitives of
Plantago major L. A review, Journal of Ethnopharmacology, pp. 71, 1-21
6. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và ñộng vật làm thuốc Việt Nam, tập 1,NXB Khoa học kỹ thuật,
Hà Nội, tr.345-349, 419-424.

150