XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN VÀ CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN VÀ
CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN
THAM GIA NGHIÊN CỨU
TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN VÀ
CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN

THAM GIA NGHIÊN CỨU
TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Tạ Mạnh Hùng
PGS.TS. Đoàn Cao Sơn
HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Đoàn Cao Sơn, TS. Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương,
hai người thầy đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân
tích - độc chất đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường.
Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các đồng nghiệp tại Trung tâm đánh
giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã động
viên, giúp đỡ và chia sẻ với tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè
đã giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận
văn.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ, động viên, khích lệ
của Quý Thầy, Cô, Cơ quan, Bạn bè và Gia đình đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn.

Hà nội, ngày 31 tháng 03 năm 2019
Học viên: Nguyễn Thị Dung


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ATORVASTIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA....3
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa ................................................. 3
1.1.1.1. Công thức cấu tạo ........................................................................ 3
1.1.1.2. Tính chất lý hóa ........................................................................... 3
1.1.2. Các đặc tính dược lý, dược động học .................................................4
1.1.2.1. Tác dụng dược lý.......................................................................... 4
1.1.2.2. Chỉ định [2] ................................................................................. 4
1.1.2.3. Liều lượng và cách dùng [2]. ....................................................... 4
1.1.2.4. Dược động học ............................................................................. 4
1.1.3. Một số phương pháp định lượng atorvastatin và chất chuyển hóa trong
dịch sinh học................................................................................................ 6
1.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC ..8
1.2.1. Kỹ thuật xử lý mẫu ............................................................................ 9
1.2.2. Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng
khối phổ hai lần (LC-MS/MS) với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI) 10
1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu ....................................................................... 11
1.2.2.2. Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI – Electron spray
ionization) .............................................................................................. 11
1.2.2.3. Bộ phận phát hiện (detector) ...................................................... 13
1.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học .................... 13

1.2.3.1. Độ chọn lọc ................................................................................ 13
1.2.3.2. Giới hạn định lượng dưới ........................................................... 14
1.2.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ............................................ 14
1.2.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ........................ 14
1.2.3.5. Ảnh hưởng của nền mẫu ............................................................. 15
1.2.3.6. Độ thu hồi hoạt chất và chuẩn nội .............................................. 15


1.2.3.7. Đánh giá khả năng nhiễm chéo .................................................. 15
1.2.3.8. Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học .......... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 17
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ......................... 17
2.1.1. Chất chuẩn, dung môi, hóa chất ....................................................... 17
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ............................................................... 17
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 18
2.2.1. Mẫu huyết tương .............................................................................. 18
2.2.2. Thuốc nghiên cứu (trong đánh giá tương đương sinh học)................ 18
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 18
2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích..................................................... 18
2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác định AT, o-AT, p-AT ............... 18
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ........................................................... 19
2.3.1.3. Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương ................................... 19
2.3.1.4. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: ..................................................... 20
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................... 20
2.3.3. Xác định nồng độ AT, o-AT, p-AT trong mẫu huyết tương người tình
nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học chế phẩm Atorvastatin23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 25
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..................... 25
3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT............... 25
3.1.1.1. Điều kiện khối phổ định lượng AT .............................................. 25

3.1.1.2. Điều kiện khối phổ định lượng o-AT và p-AT ............................. 28
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ................................................................. 29
3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương ................................... 31
3.1.4. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội ............................................................ 35
3.1.5. Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng AT, o-AT và
p-AT trong huyết tương ............................................................................. 35
3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................... 37
3.2.1. Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS .............................................. 37
3.2.2. Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp ......................................... 38
3.2.3. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ..................................... 41


3.2.4. Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính................................... 44
3.2.5. Độ đúng, độ chính xác của phương pháp.......................................... 45
3.2.5.1. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ........................ 45
3.2.5.2. Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng mẫu 4 lần ......................... 46
3.2.6. Ảnh hưởng của nền mẫu .................................................................. 46
3.2.7. Xác định tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội ..................... 47
3.2.8. Độ nhiễm chéo ................................................................................. 49
3.2.9. Nghiên cứu độ ổn định ..................................................................... 50
3.2.9.1. Độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc.................................. 50
3.2.9.2. Độ ổn định dung dịch chuẩn nội làm việc ở nhiệt độ phòng ....... 51
3.2.9.3. Độ ổn định mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian
ngắn ....................................................................................................... 52
3.2.9.4. Độ ổn định sau 5 chu kỳ đông – rã đông .................................... 53
3.2.9.5. Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler) .................... 54
3.2.9.6. Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương ................................. 55
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG AT, O-AT, P-AT TRONG MẪU HUYẾT
TƯƠNG NTN ............................................................................................... 56
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................... 64

4.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AT, OAT VÀ P-AT TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI ...................................... 64
4.1.1. Lựa chọn phổ khối MS/MS cho AT, o-AT và p-AT ......................... 64
4.1.2. Kỹ thuật xử lý mẫu .......................................................................... 64
4.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................... 65
4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƯƠNG NTN ....................... 66
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 68
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 69


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AN

: Chất phân tích (Analyte)

AT

: Atorvastatin

AUC

: Diện tích dưới đường cong (Area under the curve)

BMI

: Chỉ số khối cơ thể (Body mass index)

Cmax

: Nồng độ cực đại

CTPT

: Công thức phân tử

CV

: Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

DC

: Pha loãng

DĐH

: Dược động học

EMA

: Cơ quan quản lý Dược Châu Âu
(European Medicines Agency)

ESI

: Ion hóa kiểu phun điện tử (Electrospray ionization)

GlI

: Glibenclamid

HDC

: Mẫu pha loãng ở nồng độ cao

HPLC

: Sắc ký lỏng cao áp
(High performance liquid chromatography)

HQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao (High quality control)

HT

: Huyết tương

HTT

: Huyết tương trắng

IS

: Chuẩn nội (Internal standard)

LC-MS

: Sắc ký lỏng khối phổ
(Liquid chromatography – Mass spectrometry)

LC-MS/MS

: Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
(Liquid chromatography – tandem mass spectrometry)

LDC

: Mẫu pha loãng ở nồng độ thấp

LLOQ

: Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantitation)

LQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp (Low quality control)

m/z

: Khối lượng/điện tích

MDC

: Mẫu pha loãng ở nồng độ trung bình


MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

MF

: Hệ số nền mẫu (Matrix factor)

MQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa (Medium quality control)

NTN

: Người tình nguyện

o-AT

: ortho-hydroxy atorvastatin

p-AT

: para-hydroxy atorvastatin

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SKD

: Sinh khả dụng

SKĐ

: Sắc ký đồ

SPE

: Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

SQC

: Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control)

STT

: Số thứ tự

TB

: Trung bình

TĐSH

: Tương đương sinh học

TLTK

: Tài liệu tham khảo

Tmax

: Thời gian đạt nồng độ cực đại

ULOQ

: Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantitation)

US-FDA

: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

v/v

: Thể tích/thể tích

(United States – Food and Drug Administration)


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Giá trị một số thông số dược động học của AT, o-AT, p-AT ............... 5
Bảng 1.2. Một số phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời AT, o-AT, pAT trong HT........................................................................................................ 7
Bảng 2.1- Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn trong huyết tương ............................... 21
Bảng 2.2- Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương ........................... 22
Bảng 2.3- Cách chuẩn bị các mẫu pha loãng trong huyết tương……………. ... 22
Bảng 3.1- Tỷ lệ thu hồi của AT, o-AT, p-AT khi chiết bằng các dung môi khác
nhau……………………………………………………………………............ 34
Bảng 3.2- Điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT và IS ...................... 36
Bảng 3.3- Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS................................................ 38
Bảng 3.4- Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của AT và
IS....................................................................................................................... 39

Bảng 3.5- Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của o-AT
và p-AT ............................................................................................................. 39
Bảng 3.6- Đáp ứng pic của mẫu LLOQ và Zero ................................................ 42
Bảng 3.7- Độ đúng – độ chính xác của mẫu LLOQ ........................................... 43
Bảng 3.8- Kết quả khảo sát đường chuẩn đối với AT, o-AT, p-AT .................... 44
Bảng 3.9- Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày của AT, o-AT, p-AT
.......................................................................................................................... 45
Bảng 3.10- Độ đúng, độ chính xác khác khi pha loãng mẫu 4 lần ...................... 46
Bảng 3.11- Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu đối với AT ................ 47
Bảng 3.12- Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu đối với o-AT và p-AT 47
Bảng 3.13- Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của AT, o-AT và p-AT ..................... 48
Bảng 3.14- Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của IS ............................................... 49
Bảng 3.15- Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo- AT .............................................. 49
Bảng 3.16- Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo- o-AT và p-AT ............................. 50
Bảng 3.17- Kết quả độ ổn định dài ngày của các dung dịch chuẩn gốc .............. 51
Bảng 3.18- Kết quả độ ổn định của dung dịch IS làm việc ở nhiệt độ phòng ...... 51
Bảng 3.19- Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ ......... 52


Bảng 3.20- Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 5 chu kỳ
đông – rã đông................................................................................................... 53
Bảng 3.21- Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong autosampler ................ 54
Bảng 3.22- Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương .......................... 55
Bảng 3.23- Nồng độ trung bình của AT, o-AT, p-AT trong huyết tương 27 NTN
.......................................................................................................................... 59
Bảng 3.24- Thống kê mô tả một số thông số dược động học của AT trên NTN
Việt Nam ........................................................................................................... 60
Bảng 3.25- Thống kê mô tả một số thông số dược động học của o-AT trên NTN
Việt Nam ........................................................................................................... 61
Bảng 3.26- Thống kê mô tả một số thông số dược động học của p-AT trên NTN

Việt Nam ........................................................................................................... 62


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin, orthohydroxy atorvastatin ............................................................................................ 3
Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa atorvastatin trong cơ thể [25] ................................... 5
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ .................................................. 11
Hình 1.4. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba .................. 12
Hình 3.1. Phổ khối MS dung dịch chuẩn AT với chế độ ESI (+)……………. …25
Hình 3.2. Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có m/z = 559,59 .......... 26
Hình 3.3. Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [AT+H]+ ........................................ 27
Hình 3.4. Giản đồ năng lượng phân mảnh [AT+H]+ .......................................... 28
Hình 3.5. Phổ khối MS dung dịch chuẩn p-AT .................................................. 28
Hình 3.6. Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [p-AT+H]+ ..................................... 29
Hình 3.7. Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 575,2 Da (a)
và Giản đồ năng lượng phân mảnh [p-AT+H]+ (b)............................................. 29
Hình 3.8. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x
2,1 mm; 1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,001% (70 : 30, v/v) ............. 30
Hình 3.9. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (100 mm x
2,1 mm; 1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,001% (70 : 30, v/v) ............. 30
Hình 3.10. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng hệ pha động MeOH : acid formic
0,001% (75 : 25, v/v) ......................................................................................... 30
Hình 3.11. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng hệ pha động MeOH : acid formic
0,001% (65 : 35, v/v) ......................................................................................... 30
Hình 3.12- Sơ đồ chiết AT, o-AT, p-AT trong HT bằng phương pháp chiết lỏnglỏng ................................................................................................................... 32
Hình 3.13. SKĐ mẫu HT chứa AT, o-AT, p-AT khi tủa bằng MeOH ................ 33
Hình 3.14. SKĐ mẫu HT chứa AT, o-AT, p-AT khi tủa bằng MeCN ................ 33
Hình 3.15- SKĐ dòng ion AT, o-AT, p-AT khi phân tích mẫu huyết tương trắng
đã được chiết lỏng - lỏng bằng diethylether-cloroform (1:1) .............................. 34
Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu HT chứa AT, o-AT, p-AT và IS phân tích bằng LCMS/MS .............................................................................................................. 37

Hình 3.17. SKĐ tính chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp LC-MS/MS định
lượng đồng thời AT, o-AT và p-AT trong huyết tương ...................................... 40
Hình 3.18. SKĐ mẫu HT có thêm chuẩn AT, o-AT, p-AT ở nồng độ MQC ...... 56
Hình 3.19. SKĐ mẫu HT thời điểm 0h của NTN L03 có thêm chuẩn nội........... 56
Hình 3.20. SKĐ mẫu HT thời điểm 24 giờ sau khi uống thuốc thử của NTN L03
.......................................................................................................................... 57
Hình 3.21. SKĐ mẫu HT thời điểm 24 giờ sau khi uống thuốc chứng của NTN
L03 .................................................................................................................... 57
Hình 3.22. Đường cong trung bình nồng độ AT theo thời gian của 27 NTN ...... 57
Hình 3.23. Đường cong trung bình nồng độ o-AT theo thời gian của 27 NTN ... 58
Hình 3.24. Đường cong trung bình nồng độ p-AT theo thời gian của 27 NTN ... 58


ĐẶT VẤN ĐỀ
Atorvastatin (AT) là một thuốc thuộc nhóm statin, có khả năng làm giảm
tổng hợp cholesterol trong gan và làm giảm nồng độ cholesterol trong tế bào thông
qua việc ức chế men HMG-CoA reductase. Atorvastatin được chỉ định để làm giảm
cholesterol toàn phần và cholesterol LDL ở người bệnh tăng cholesterol huyết gia
đình đồng hợp tử, bổ trợ cho các cách điều trị hạ lipid khác [2].
Trong cơ thể atorvastatin bị chuyển hóa bởi hệ enzym microsom cytochrom
P450 mà chủ yếu là isoenzym 3A4 (CYP 3A4) thành hai chất chuyển hóa có hoạt tính
là ortho-hydroxy atorvastatin (o-AT) và para-hydroxy atorvastatin (p-AT) [2]. Tác
dụng ức chế men HMG-CoA reductase của các chất chuyển hóa này tương đương
với atorvastatin. Khoảng 70% các hoạt tính ức chế trong tuần hoàn đối với men khử
HMG-CoA là do các chất chuyển hóa có hoạt tính [26]. Đồng thời trong cơ thể, AT
và hai chất chuyển hóa o-AT, p-AT có mặt ở trạng thái cân bằng với các dạng lacton
không hoạt động tương ứng. Quá trình chuyển từ dạng acid sang dạng lacton và
ngược lại từ dạng lacton sang dạng acid được xúc tác bởi các enzym tương ứng là

uridin

diphosphat

(UDP)-glucuronosyltransferase

(UGTs)

và

esterases

(paraoxonases) [27], [25]. Hiện tượng chuyển dạng này không chỉ diễn ra trong cơ
thể mà còn diễn ra trong quá trình bảo quản, xử lý và phân tích các mẫu huyết tương,
ảnh hưởng lớn đến độ chính xác của các kết quả trong quá trình tiến hành nghiên
cứu dược động học của AT và các chất chuyển hóa [21], [22]. Theo khuyến nghị
của FDA về đánh giá tương đương sinh học đối với chế phẩm atorvastatin, ngoài
các dữ liệu về atorvastatin, các dữ liệu về hai chất chuyển hóa o-AT, p-AT (nồng
độ trong huyết tương, các giá trị dược động học, trung bình hình học và tỷ lệ trung
bình của AUC và Cmax) cũng cần được báo cáo [14]. Tuy nhiên nồng độ tối đa của
AT, o-AT, p-AT trong huyết tương khi uống một liều đơn 10 mg hoặc 20 mg
atorvastatin tương đối thấp (khoảng 0,1 – 20 ng/ml) [29], [30]. Do vậy để định lượng
được AT và các chất chuyển hóa trong các mẫu huyết tương người đòi hỏi phải có
phương pháp bảo quản, xử lý mẫu phù hợp cũng như một phương pháp phân tích
có đủ độ nhạy, đặc hiệu và chính xác cao. Mặt khác hiện nay nhu cầu đánh giá
tương đương sinh học các chế phẩm chứa AT sản xuất tại Việt Nam ngày càng
1


tăng cao nhưng chưa có phương pháp phân tích nào về định lượng đồng thời AT

và các chất chuyển hóa có hoạt tính trong huyết tương được chính thức công bố tại
Việt Nam.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng
phương pháp định lượng đồng thời atorvastatin và các chất chuyển hóa trong
huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học”
với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời atorvastatin và
hai chất chuyển hóa có hoạt tính ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy
atorvastatin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS).
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng atorvastatin và hai chất
chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy trong huyết tương
người tình nguyện tham gia nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế
phẩm viên nén Atorvastatin sản xuất tại Việt Nam.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ATORVASTIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
1.1.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin, orthohydroxy atorvastatin
* Atorvastatin:
- Công thức phân tử: C33H35FN2O5
- Khối lượng phân tử: 558,65 g/mol
- Tên khoa học: Acid (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-(1-methylethyl)-3phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic.
* Ortho-hydroxy atorvastatin:
- Công thức phân tử: C33H35FN2O6
- Khối lượng phân tử: 574,7 g/mol

- Tên khoa học: Acid (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-(1-methylethyl)-3phenyl-4-(2 –hydroxyphenylcarbamoyl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic
* Para-hydroxy atorvastatin:
- Công thức phân tử: C33H35FN2O6
- Khối lượng phân tử: 574,7 g/mol
- Tên khoa học: Acid (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-(1-methylethyl)-3phenyl-4-(4 –hydroxyphenylcarbamoyl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic
1.1.1.2. Tính chất lý hóa
AT, o-AT và p-AT đều là dẫn chất của acid heptanoic. AT ở dạng bột màu trắng
hoặc hơi trắng, dạng muối calci rất ít tan trong nước, ít tan trong ethanol, dễ tan
3


trong methanol, dimethyl sulphoxid. AT calci có nhiệt độ nóng chảy khoảng
159,2oC – 160,7 oC; logP = 6,36; pKa1 = 4,3 (carboxy); pKa2 = 14,9 (hydroxy)
[5], [26].
1.1.2. Các đặc tính dược lý, dược động học
1.1.2.1. Tác dụng dược lý
Atorvastatin thuộc nhóm thuốc điều hòa lipid huyết, là một chất ức chế cạnh
tranh với HMG-CoA reductase. Thuốc làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần,
LDL-cholesterol và VLDL-cholesterol trong huyết tương. Thuốc cũng có khuynh
hướng làm giảm nồng độ triglycerid và làm tăng HDL-cholesterol trong huyết
tương. Ngoài ra thuốc còn có tác dụng chống xơ vữa động mạch [2].
1.1.2.2. Chỉ định [2]
- Rối loạn lipid huyết
- Dự phòng biến chứng tim mạch.
1.1.2.3. Liều lượng và cách dùng [2].
Có thể uống liều duy nhất vào bất cứ lúc nào trong ngày. Liều khởi đầu 10
mg một lần mỗi ngày. Liều duy trì 10-40 mg/ngày. Nếu cần có thể tăng liều nhưng
không quá 80 mg/ngày [2].
1.1.2.4. Dược động học
Các chế phẩm chứa AT trên thị trường thường dưới dạng viên nén hoặc

viên nén bao phim với hàm lượng 10 mg; 20 mg; 40 mg và 80 mg. AT được hấp
thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong
vòng từ 1 đến 2 giờ. Tỷ lệ gắn kết với protein huyết tương của AT ≥ 98%. Thuốc
chuyển hóa mạnh ở gan (> 60%) chủ yếu do enzyme CYP 3A4 thành các chất
chuyển hóa có hoạt tính là ortho-hydroxy atorvasttatin và para-hydroxy
atorvastatin. Tác dụng ức chế men HMG-CoA reductase của các chất chuyển hóa
này tương đương với AT. Trong cơ thể, AT và hai chất chuyển hóa o-AT, p-AT có
mặt ở trạng thái cân bằng với các dạng lacton không hoạt động tương ứng. Quá trình
chuyển từ dạng acid sang dạng lacton và ngược lại từ dạng lacton sang dạng acid
được xúc tác bởi các enzym tương ứng là uridin diphosphat (UDP) glucuronosyltransferase (UGTs) và esterases (paraoxonases) (Hình 1.2) [25], [27].
4


Ngoài cơ thể, khi pH huyết tương > 6 thì cân bằng giữa dạng acid và dạng lacton
của AT, o-AT, p-AT sẽ bị phá vỡ, dạng lacton sẽ dễ dàng chuyển sang dạng acid
làm sai lệch kết quả định lượng nồng độ các chất trong huyết tương. Để hạn chế
quá trình trên thì cần điều chỉnh pH huyết tương về khoảng 4 – 6 [5], [19], [21],
[22]. AT được đào thải qua nước tiểu và phân với nửa đời bán thải (t1/2) khoảng 14
giờ [2], [26].

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa atorvastatin trong cơ thể [25]
Kết quả xác định các thông số dược động học của AT, o-AT và p-AT trong
một số nghiên cứu được trình bày trong bảng 1.1:
Bảng 1.1. Giá trị một số thông số dược động học của AT, o-AT, p-AT
Thiết kế
nghiên cứu

Chất

AT

Liều đơn 10
mg, 50 người
tình nguyện

o-AT

p-AT

Cmax

Tmax

(ng/ml)
2,811*
(1,799)
3,006**
(1,819)
1,885*
(0,941)
1,872**
(1,064)

(giờ)
1,29
(1,42)
1,21
(1,47)
5,15
(2,80)

5,08
(2,68)

0,155*
(0,172)
0,166**
(0,171)

AUC0-t

AUC0-∞

T1/2

(ng.giờ/ml) (ng.giờ/ml) (giờ)
25,593
28,942
14,01
(12,747)
(21,4920
(6,73)
25,133
28,736
16,44
(12,341)
(21,102)
(12,87)
31,306
33,233
10,60

(16.876)
(17,849)
(3,04)
30,652
32,637
10,71
(18,468)
(20,132)
(3,45)
3,450
96,743
12,50
21,00
(3,556)
(31,482)
(13,47)
(15,93)
2,781
3,901
12,21
22,80
(3,419)
(4,567)
(12,63)
(12,13)
5

TLTK

[30]

Liều đơn 40
mg, 20 người
tình nguyện

Liều đơn 80
mg, 18 người
tình nguyện

2,55
(1,73)
2,46
(1,20)

42,73
(34,31)
44,51
(34,03)
52,36
(23,29)
53,14
(21,66)
1021
(1,98)
1023
(1,67)
319
(135)
334

(229)
272
(132)
259
(151)

12,74
(3,35)
15,51
(10,15)

10,06
(8,10)
8,01
(3,93)

49
(35)
47
(48)

64
(39)
68
(64)

23,30
(7,88)
19,45
(4,25)

1,16
(1,06)
0,69
(0,66)
2,11
(1,74)
1,53
(1,45)
4,21
(0,76)
4,22
(0,86)

AT

70,60*
(35,89)
74,94**
(56,01)

1,85
(1,18)
2,13
(1,20)

o-AT

31,75*
(21,59)

27,78**
(14,88)

p-AT

2,30*
(2,65)
1,85**
(1,52)

AT
Liều đơn 20
mg, 45 người
tình nguyện

38,22
(32,72)
40,02
(32,92)
47,32
(22,16)
48,47
(21,62)
821,37
(1,13)
825,39
(1,22)
314
(134)
329

(229)
267
(132)
255
(151)

8,78 *
(5,24)
10,76**
(6,86)
5,78*
(3,25)
5,77**
(2,26)
61,66
(3,05)
62,16
(0,76)

o-AT

AT

7,42
(3,33)
7,45
(3,34)
7,83
(2,94)
7,35

(1,88)
40,02
(1,07)
40,12
(1,23)
12,36
(3,38)
10,96
(2,81)

(*): thuốc thử; (**): thuốc chứng
1.1.3. Một số phương pháp định lượng atorvastatin và chất chuyển hóa trong
dịch sinh học
Các nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, đánh giá tương đương
sinh học chế phẩm AT và các chất chuyển hóa o-AT, p-AT đã công bố cho thấy
sau khi uống viên nén AT với liều từ 10 mg – 80 mg nồng độ cực đại của AT và
o-AT, p-AT trong huyết tương (HT) rất thấp (0,1 ng/ml – 100 ng/ml) và dao động
giữa các cá thể [18], [22], [29], [30]. Vì vậy để định lượng đồng thời AT, o-AT, pAT trong dịch sinh học, phương pháp phân tích phải có giới hạn định lượng thấp
(0,1 ng/ml – 3 ng/ml đối với AT; 0,1 ng/ml – 1 ng/ml đối với o-AT; 0,01 ng/ml –
0,1 ng/ml đối với p-AT). Do đó, trong các nghiên cứu đã được công bố, các tác giả
chủ yếu sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng đồng thời AT, o-AT, pAT.
6

[29]

[18]

[22]

Tóm tắt một số phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời AT và các
chất chuyển hóa trong huyết tương được trình bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2. Một số phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời AT, o-AT, p-AT
trong HT
Điều kiện sắc ký

Xử lý mẫu

- Cột C18; 75 x 4,6 mm; 2,7 µm
- Pha động: Acetonitril (MeCN) - Methanol
(MeOH) - acid formic 0,005% (25:40:35)
- Thời gian phân tích: 6 phút
- Nguồn ion hóa ESI (-)
- Cột Lichro CRART 55-2, Purospher STAR
RP-18e; 3 µm
- Pha động: acid formic 0,3%/nước - acid
formic 0,3%/MeCN (50:50)
- Thời gian phân tích: 4 phút
- Nguồn ion hóa ESI (-)
- Cột CAPCELL PARK CR 1:4; 150 x 2,0 mm;
5 µm.
- Pha động: MeCN - amoni acetat 20 mM chứa
acid formic 0,3% (50:50)
- Thời gian phân tích: 6 phút
- Nguồn ion hóa ESI (+)
- Cột YMC Basic; 50 x 2 mm; 5 µm
- Pha động chương trình gradient:
+ A: 950 ml H2O - 50 mL MeOH - 43 µl acid
formic 88%
+ B: 950 ml MeCN - 50 ml MeOH - 43 µl acid

formic 88%
- Thời gian phân tích: 3,5 phút
- Nguồn ion hóa ESI (+)
- Cột RP-80A; 150 x 4,6 mm; 4 µm.
- Pha động: nước - MeOH (14:96) điều chỉnh
về pH 3,2 bằng acid tricloroacetic.
- Thời gian phân tích: 6 phút
- Nguồn ion hóa ESI (+)

7

LLOQ
(ng/mL)

TLTK

Chiết SPE

AT: 0,05
o-AT: 0,05
p-AT: 0,05

[22]

Chiết lỏnglỏng bằng
ethylacetat

AT: 2,04
o-AT: 1,51
p-AT: 0,25

[23]

Chiết lỏnglỏng bằng
AT: 0,035
ethylacetato-AT: 0,020
methyl tertp-AT: 0,015
butyl ether
(50/50, v/v)

[30]

Chiết bằng
methyl tertbutyl ether

Tủa protein
bằng MeCN

AT: 0,5
o-AT: 0,5
p-AT: 0,5

AT: 1,5
o-AT: 1,0
p-AT: 0,2

[21]

[20]

Nhận xét:
- Phương pháp của Pankaj Partani và cộng sự [22] sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn
cho nền mẫu sạch và có giới hạn định lượng dưới thấp (0,05 ng/ml cho cả AT, oAT, p-AT) tuy nhiên chi phí tốn kém, chưa phù hợp với điều kiện kinh tế tại Việt
Nam.
- Phương pháp của Rajesh Dhiman [23], Ying Zhou [30], Mohammed Jemal [21]
sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với dung môi chiết là ethylacetat, methyl tertbutyl ether hoặc hỗn hợp ethylacetat-methyl tert-butyl ether (50/50, v/v) với quy
trình chiết dễ thực hiện và áp dụng tại các phòng thí nghiệm Việt Nam. Tuy nhiên
phương pháp của Rajesh Dhiman [23], Mohammed Jemal [21] có giới hạn định
lượng dưới đối với o-AT và p-AT cao (0,2 ng/ml – 1,5 ng/ml). Phương pháp của
Ying Zhou [30] có giới hạn định lượng dưới đạt yêu cầu nhưng đòi hỏi cần có cột
phân tích có độ chọn lọc, phân giải cao, chưa phổ biến tại nhiều phòng thí nghiệm
ở Việt Nam (Cột CAPCELL PARK CR 1:4).
- Phương pháp của Mahmoud Yacoub [21] sử dụng kỹ thuật tủa protein bằng
MeCN cho quá trình xử lý mẫu nhanh, đơn giản nhưng giới hạn định lượng dưới
đối với o-AT và p-AT còn cao (1,0 ng/ml và 0,2 ng/mL).
1.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
So với các phương pháp phân tích thuốc trong chế phẩm bào chế, phương
pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học có nhiều điểm khác biệt: nền mẫu phức
tạp (chứa muối vô cơ, lipid, protein, chất nội sinh,…), nồng độ hoạt chất thấp,
khoảng nồng độ biến thiên rộng, lượng mẫu ít và số lượng mẫu phân tích nhiều do
vậy phương pháp phân tích cần phải có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định
lượng dưới thấp, độ lặp lại tốt và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn. Chính
vì vậy, khi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
cần chú trọng ba vấn đề cơ bản, đó là: kỹ thuật xử lý mẫu, kỹ thuật phân tích định
lượng và cách tiến hành thẩm định phương pháp phân tích nhằm đảm bảo độ tin
cậy của phương pháp.

8

1.2.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
Phần lớn các phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học đều không
thể định lượng được các hoạt chất trực tiếp từ mẫu mà chỉ có thể định lượng được
sau khi mẫu đã được xử lý. Vì vậy, mẫu cần phải được chiết tách, xử lý để loại tạp
chất, các ảnh hưởng của nền mẫu và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân
tích để tăng độ nhạy của phương pháp. Hiện nay, để xử lý mẫu dịch sinh học, người
ta thường hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản đó là: tủa protein, chiết lỏng – lỏng và
chiết pha rắn [24].
- Kỹ thuật tủa protein:
Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân gây tủa để loại đi phần lớn
lượng protein có trong nền mẫu. Tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học
thường dùng là acid (như acid tricloroacetic, acid percloric..), dung môi hữu cơ
(như methanol, acetonitril…), muối vô cơ (như (NH 4)2SO4, NaCl…) [17].
Kỹ thuật tủa protein có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng lượng dung
môi ít và kinh tế. Trên thực tế, để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân tích định
lượng, người ta hay dùng kỹ thuật tủa protein bằng dung môi hữu cơ hoặc acid.
Nhược điểm của kỹ thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa bằng dung môi
hữu cơ, mẫu sau xử lý còn chứa nhiều tạp chất làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký và
gây nhiễu đường nền, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả khi phân tích bằng
các phương pháp sắc ký, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng khối phổ [10].
- Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng:
Chiết lỏng - lỏng là phương pháp được dùng phổ biến nhất để phân tích
thuốc trong dịch sinh học. Nguyên lý của kỹ thuật này là chuyển chất phân tích
được hoà tan trong dung môi này sang dung môi khác không đồng tan [1]. Tỉ lệ
thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết, tính
phân cực của dung môi chiết, pH của pha nước, hệ số/hằng số phân bố của hoạt
chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau.
Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là diethylether, methyl
tert-butyl ether, cloroform, dicloromethan, n-hexan, ... Các dung môi này có thể

9


dùng đơn thành phần hoặc dùng phối hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng hoạt
chất phân tích.
Ưu điểm của kỹ thuật chiết lỏng - lỏng là mẫu thu được tương đối sạch và
có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều dược chất, phù hợp với điều kiện và
thiết bị của nhiều phòng thí nghiệm. Nhược điểm của kỹ thuật này sử dụng nhiều
dung môi ảnh hưởng tới sức khỏe người phân tích và môi trường, thời gian xử lý
mẫu dài hơn so với kỹ thuật tủa protein, có thể hình thành nhũ tương trong quá
trình chiết ảnh hưởng đến kết quả phân tích [24].
- Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE):
Là kỹ thuật được phát triển dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật tách sắc
ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ dung
môi thích hợp). Các giai đoạn chính của kỹ thuật SPE gồm các giai đoạn: hoạt hóa
cột, nạp mẫu, rửa và rửa giải. Kỹ thuật này đòi hỏi người phân tích phải được đào
tạo và có kinh nghiệm trong việc chọn cột và dung môi thích hợp để rửa tạp và rửa
giải. Ưu điểm của kỹ thuật này là nền mẫu sạch ít gây ra hiện tượng ảnh hưởng của
nền mẫu, tỷ lệ thu hồi cao, độ lặp lại tốt. Hiện nay trên thế giới kỹ thuật SPE được
áp dụng khá phổ biến nhưng trong các phòng thí nghiệm của Việt Nam kỹ thuật
này chưa được áp dụng nhiều do cột dùng cho SPE đắt nên chi phí phân tích cao.
Mặt khác nếu sử dụng kỹ thuật SPE thủ công thì thời gian xử lý mỗi mẫu kéo dài
do quá trình chiết trải qua nhiều giai đoạn, nếu sử dụng kỹ thuật SPE tự động thì
có thể xử lý đồng thời nhiều mẫu nhưng đòi hỏi thiết bị hiện đại, giá thành cao
[24].
1.2.2. Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng khối
phổ hai lần (LC-MS/MS) với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)
Để định lượng thuốc trong dịch sinh học thường sử dụng các phương pháp
phân tích hóa lý như sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di

mao quản (CE)… Tùy thuộc vào nồng độ, cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý, khả
năng hấp thụ UV-VIS, khả năng phát huỳnh quang… của chất phân tích mà lựa
chọn detector phù hợp để phát hiện. Đối với những mẫu dịch sinh học có nồng độ
dược chất ở ngưỡng thấp (ng/ml), hiện nay người ta hay sử dụng phương
10


pháp phân tích khối phổ (MS), đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần
(LC-MS/MS) vì phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp
giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối
của detector khối phổ [1].
Trong số các kỹ thuật LC-MS, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối
với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)
có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao do vậy thường được sử dụng để phân
tích thuốc trong dịch sinh học [3], [4].
Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong Hình 1.3.

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ
1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị
khối phổ. Với LC-MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ
thống HPLC [1].
1.2.2.2. Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization)
Nguồn ion hóa là nơi diễn ra quá trình chuyển các hoạt chất cần phân tích
thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau.
Trong nguồn ion sử dụng kĩ thuật ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI),
tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí
mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí
và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt

sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi
mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn, lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ
chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để
11


hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Từ những hạt rất
nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào
bộ phận phân tích khối. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng
ion qua bơm chân không của thiết bị khối phổ. Nguồn ESI, với kỹ thuật ion hóa
mềm, nhiễm điện bề mặt nên có thể áp dụng để ion hóa nhiều hoạt chất với các
đặc điểm hóa lý khác nhau [7], [8].
1.2.2.3. Bộ phận phân tích khối tứ cực chập ba
Bộ phân tích khối sẽ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại
riêng biệt nhờ tác dụng của điện trường.
Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập ba gồm ba tứ cực Q 1, Q2 và Q3 nối
tiếp nhau. Mỗi tứ cực này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song và
sát nhau tạo thành hai cặp điện cực (hình 1.4).

Hình 1.4. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba
Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp
đối diện của tứ cực. Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các
ion có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và quỹ đạo khác nhau. Ion có số
khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.
Tại Q1 sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m/z xác định và được đưa đi thẳng đến
Q2, những ion khác sẽ bị loại đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu. Quá
trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2. Trong
buồng Q2, ion ban đầu (ion mẹ) chuyển động Brown, va chạm với các phân tử khí
trơ có mặt trong buồng (khí argon). Nhờ va chạm này năng lượng động học của
các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn

(ion con) tùy theo mức độ bền vững của các liên kết trong ion ban đầu. Các ion
con mới hình thành có số khối m/z khác nhau tiếp tục được phân tách riêng tại Q3
12


với cơ chế phân tích khối lượng tương tự như tại Q1và cuối cùng được đưa đến
detector để định lượng [8].
Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ
chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy, có thể
định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS.
1.2.2.3. Bộ phận phát hiện (detector)
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phép phát hiện và
khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được
chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
1.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học
Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp
phân tích nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói
riêng. Mục đích của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp có đủ độ
nhạy, tin cậy và lặp lại để phân tích các mẫu thực.
Theo hướng dẫn của US-FDA [13] và EMA [11] thẩm định phương pháp
LC-MS/MS phân tích thuốc trong dịch sinh học gồm những chỉ tiêu sau:
1.2.3.1. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với
các thành phần khác có trong mẫu. Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc
đối với chất phân tích (AN) và chuẩn nội (IS) khi:
- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của AN và IS phải được nhận diện rõ ràng
và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác.
- Trên SKĐ của từng mẫu trắng (ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau), tại
thời điểm trùng với thời gian lưu của pic AN tín hiệu đo phải không vượt quá 20%

đáp ứng pic của mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong đường chuẩn và tại thời
điểm trùng với thời gian lưu của pic IS tín hiệu đo của từng mẫu trắng phải nhỏ
hơn 5% so với đáp ứng trung bình của pic IS trong các mẫu đường chuẩn và mẫu
kiểm tra (QC).
13