Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thực vật thuộc chi agrimonia họ hoa hồng (rosaceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC

HỒ ĐẮC HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI AGRIMONIA HỌ HOA
HỒNG (ROSACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - năm 2013

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC

HỒ ĐẮC HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI AGRIMONIA HỌ HOA

HỒNG (ROSACEAE)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Phạm Gia Điền

Hà Nội – năm 2013

2


LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này được hoàn thành tại phòng Công nghệ các
chất có hoạt tính sinh học-Viện Hóa học-Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm
Gia Điền, Trưởng phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học
người đã ủng hộ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập và làm luận văn, là người thầy hướng dẫn tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Kim Anh đã tận tình chỉ bảo,
giúp đỡ trong quá trình làm luận văn, cảm ơn nhà thực vật học Nguyễn
Kim Đào trong việc thu hái mẫu và định tên cây. Xin cảm ơn các đồng
nghiệp thuộc phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học-Viện
Hóa học đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và cảm ơn tới Ban

lãnh đạo Viện Hóa học và tới các thầy cô giáo Khoa Hóa - Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này.

Hà nội, ngày

tháng năm 2013

Hồ Đắc Hùng

3


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
IR

Phổ hồng ngoại

EI-MS

Phổ khối ion hóa bằng va chạm electron

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

1

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMBC

Phổ tương quan 1H-13C xa

HSQC

Phổ tương quan 1H-13C gần sử dụng kỹ thuật đo HSQC

s

Singlet

d

Duplet

dd

Duplet của duplet

m

Multiplet

t

Triplet

J (Hz)

Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

MeOH

Metanol

EtOH

Etanol

ppm

Phần triệu

Hz

Hertz

IC50

Nồng độ cần thiết của một hoạt chất ức chế 50% sự tăng sinh invitro

4


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

i

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

ii

MỤC LỤC

iii

Mở đầu

1

Chƣơng I: TỔNG QUAN

3

1.1. Vài nét về thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia)

3

1.2. Một số kết quả nghiên cứu hóa thực vật của chi Agrimonia

3

1.2.1. Các hợp chất flavonoit

4

1.2.2. Các hợp chất tecpenoit

10

1.2.3. Các hợp chất khác

11

2. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi

12

Agrimonia.
2.1. Công dụng của một số loài thực vật chi Agrimonia đƣợc sử dụng

12

trong y học dân tộc Việt Nam:
2.2. Những nghiên cứu ở nƣớc ngoài về hoạt tính sinh học của thực

13

vật chi Agrimonia :

CHƢƠNG 2. ĐỒI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

17

2.1. Đối tƣợng, nhiệm vụ nghiên cứu:

17

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu:

17

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất:

17

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất:

18

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học:

18

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

19

3.1. Đặc điểm thực vật của cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa

19

Ledeb.)
5


3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất

19

3.2.1. Thu hái và xử lý mẫu thực vật:

19

3.2.2. Sơ đồ phân lập và chiết tách mẫu thực vật

20

3.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất:

23

3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các cặn dịch chiết từ
cây Long nha thảo:
3.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa (antioxidant activity)

36

3.4.2. Hoạt tính độc tế bào (Cytotoxic activity)

37

3.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity)

38

CHƢƠNG IV: THỰC NGHIỆM

40

4.1. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu:

40

4.2. Dung môi hóa chất:

40

4.3. Nguyên liệu thực vật:

40

4.4. Chiết xuất và phân lập:

40

4.4.1. Xử lý mẫu và phương pháp chiết tách:

40

4.4.2. Phân lập các hợp chất:

41

36

Phân lập các chất trong dịch chiết CH2Cl2

41

Phân lập các chất trong dịch chiết etylaxetat

42

Phân lập cặn dịch chiết butanol

42

4.5. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất thu đƣợc:

43

KẾT LUẬN

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

49

PHỤ LỤC

55

6


MỞ ĐẦU
Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên,
hàng trăm nghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên
cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực của cuộc sống, đặc biệt là trong y học.
Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất quí
hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để tổng
hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên
nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có
khả năng trị bệnh rất cao. Các kết thống kê gần đây cho thấy các hợp chất
được đăng ký làm thuốc trên toàn thế giới thì 61% là các hợp chất thiên
nhiên hoặc các chất có liên quan tới chúng. Trong đó có 6% là các hợp
chất thiên nhiên, 27% là các dẫn xuất của các hợp chất thiên nhiên, 5% là
các hợp chất tổng hợp có mang các nguyên liệu đầu bắt nguồn từ các hợp
chất thiên nhiên và 23% là các chất tổng hợp được thiết kế trên cơ sở cấu
trúc phân tử thu được từ các hợp chất thiên nhiên (các chất mô phỏng các
hợp chất thiên nhiên). Trong một số các lĩnh vực trị liệu có đến 78% các
hoạt chất dùng làm thuốc kháng sinh và 74% các hoạt chất dùng làm
thuốc chữa ung thư là các hợp chất thiên nhiên hoặc có nguồn gốc từ các
hợp chất thiên nhiên [*].
Việt nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa là một vùng
có tính đa dạng sinh học cao. Riêng về thực vật, Việt Nam có khoảng
12000 loài, trong đó có hơn 2300 loài thực vật đã được sử dụng làm
lương thực, thuốc chữa bệnh… Khoảng 25% các loại thuốc sử dụng

thông thường xuất phát từ các loài thực vật dùng trong y học dân gian.
Cây Long nha thảo có tên khoa học: Agrimonia pilosa Ledeb.
thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) là loại cây thảo sống lâu năm có nguồn
gốc ở vùng Hymalaya, bao gồm cả Trung quốc và Ấn độ và Việt Nam.
Trong y học dân gian cây Long nha thảo đã được sử dụng làm thuốc cầm
7


máu, chữa thổ huyết, khái huyết (ho ra máu), nục huyết (đổ máu cam), đi
lỵ phân lẫn máu, sốt rét và mụn nhọt lở loét ngoài da [1]. Các nghiên cứu
gần đây cho thấy, Long nha thảo là vị thuốc có phổ tác dụng tương đối
rộng, từ chống viêm nhiễm, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể,
có tác dụng ức chế khối u đến khả năng kháng HIV… do vậy đang được
sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, ở Việt Nam
mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian và còn chưa được
nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Ngoài ra, Long
nha thảo cũng là một trong mười thành phần của vị thuốc do nhóm lương
y thuộc phòng nghiên cứu các cây thuốc, bài thuốc dân tộc thuộc Trung
Tâm Công nghệ Hóa dược và hóa sinh hữu cơ - Viện KH & CNVN sử
dụng từ năm 2004 đã điều trị thành công một số bệnh nhân nhiễm HIV
chuyển sang AIDS. Trên cơ sở bài thuốc nam đó chúng tôi chọn cây
Long nha thảo làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục đích tìm
hiểu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây với những nội
dung chính là:
2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất có trong cây Long nha thảo
(Agrimonia pilosa Ledeb.) họ hoa hồng (Rosaceae), thu hái ở
Sapa-Lào Cai.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
4. Khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn dịch chiết trong cây
và các chất phân lập được.

[*]. David J. Newman, Gordon M. Cragg, and Kenneth M. Snader. (2003), “Natural
products as sources of new drugs over the periode 1981-2002”. J. Nat. prod.. 66,
pp1022-1037.

8


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia)
Chi Long nha thảo (danh pháp khoa học: Agrimonia) là một chi
chứa khoảng 12-15 loài. Chi Long nha thảo thuộc họ Hoa hồng
(Rosaceae) có nguồn gốc ở vùng Hymalaya, bao gồm cả Trung Quốc, Ấn
Độ ngoài ra còn có ở khu vực ôn đới Bắc bán cầu, châu Âu và ở châu Phi.
Theo thống kê các loài thuộc chi Agrimonia phân bố trên thế giới:
- Agrimonia eupatoria (1 loài phân bố Châu Âu, Châu Á, Châu Phi)
- A. coreana, A. nipponica (1 loài phân ở bố Đông Á)
- Agrimonia pilosa (1 loài phân bố ở Đông Âu, Châu Á)
- Agrimonia procera (1 loài phân bố ở Châu Âu)
- Agrimonia repens (1 loài phân bố ở Nam Á)
- A. rostellata, A. striata, A. gryposepala, A. incisa, A. microcarpa, A.
parviflora, A. pubescens (7 loài phân bố ở Bắc Mỹ).
Ở Việt Nam cây có nhiều ở Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, Cao
Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình, Tam Đảo chủ yếu là loài A. pilosa [1].
1.2. Một số kết quả nghiên cứu hóa thực vật của chi Agrimonia
Thành phần hóa học của chi Agrimonia đã được nghiên cứu trên
thế giới tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về chi này. Loài A.
pilosa Ledeb mới được sử dụng trong các bài thuốc dân gian, chưa được
nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Đã có một số
công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc trên

một số loài thực vật thuộc chi Agrimonia. Các nghiên cứu về thành phần
hóa học từ loài cây Agrimonia pilosa đã chỉ ra sự có mặt của các hợp chất
flavonoid, tritecpen, saponin và tanin [2,3,4]. cũng đã có một số nghiên
cứu công bố các hoạt tính sinh học từ các phần dịch chiết từ lá và thân
loài cây này; đáng chú ý là các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn,

9


chống oxy hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư và
hoạt tính kháng HIV [5,6 ,7].
Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Agrimonia là các
tecpenoit, flavonoit và một số các hợp chất khác.
1.2.1. Các hợp chất flavonoit
Flavonoit là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực vật, có
trong hơn nửa các loại rau quả dùng hàng ngày. Flavonoit cũng là một
nhóm hoạt chất lớn trong dược liệu. Phần lớn các flavonoit có màu vàng,
ngoài ra còn có những chất màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu. Flavonoit
có mặt trong tất cả các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là
hoa, tạo cho hoa những sắc màu rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng
giúp cho sự thụ phấn của cây. Trong cây, flavonoit giữ vai trò là chất bảo
vệ, chống oxy hóa, bảo tồn axít ascorbic trong tế bào, ngăn cản một số tác
nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng,...) một số còn có tác
dụng điều hòa sự sinh trưởng của cây cối.
Flavonoit là nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học. Trước hết,
các dẫn chất flavonoit là chất chống ô xy hóa, do có khả năng bắt các gốc
tự do như OH, ROO (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư,
tăng nhanh sự lão hóa,...). Đồng thời, flavonoit tạo phức với các ion kim
loại nên ngăn cản các phản ứng oxy hóa mà những ion đó là enzym xúc
tác. Do đó, các chất flavonoit có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ

vữa động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức
xạ. Các flavonoit còn có tác dụng làm bền thành mạch, được dùng trong
các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạnh, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng
mạc,.... Các chất flavonoit còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương
tổn gan, bảo vệ chức năng gan. Nhiều hợp chất flavonoit thuộc nhóm
flavon, flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt có trong lá diếp cá,
cây râu mèo,.... Trên hệ tim mạch, nhiều hợp chất flavonoit như
quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm
10


tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim,....Ngày nay, những
dược liệu và hoa quả có hàm lượng flavonoit cao đã được khai thác và
chiết xuất, nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: thuốc viên, thuốc nước,
rất tiện ích khi sử dụng.
Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thực vật
thuộc chi Agrimonia trên thế giới:
Khi nghiên cứu thành phần hóa học loài A. pilosa Ledeb, các nhà
nghiên cứu của Trung Quốc và Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc
được các hợp chất như: Aromadendrin (1), aromadendrin 3-O-β-dglucopyranosit (2), astragalin (3), afzelin (4), tilirosit (5), luteolin (6),
quercetin (7) , isoquercetrin (8), quercitrin (9), takanechromone C (10),
5,7-dihydroxy-2-propylchromone
dihydroxy-2-propylchromone

7-O-β-d-glucopyranosit

(12),

(11),

demethylagrimonolit

5,7-

6-O-β-d-

glucopyranosit (13), agrimonolit 6-O-glucosit (14), demethylagrimonolit
(15), methylagrimonolit (16), agrimonolit (17) [8, 9].

5'
6'
8

R2

O

2

7

1'
3

6
5
OH

4
O

5'

4' OH
3'

8

HO

O

7

2'

5
OH

4. R1
5. R1
6. R1
7. R1
8. R1
9. R1

1. R1=H
2. R1=Glc
3. R2=OGlc.

11

4' OH

1'

3'
R2

3

6

OR1

2

6'

4

O

2'

R1

=O-Rha R2=H
=O-6- cumaroyl-Glc R2=H
=H R2=OH

=R2 =OH
=O-Glc R2=OH
=O-Rha R2=OH


4' OR2
R 2O

8

O

7
6

2 R1

R1O 6

3

3
5
OH

4

1''
1'
2''

O

1

8
OH

O

10. R1 =propyl R2=Glc
11. R1 =isopropyl R2=Glc
12. R1 =propyl R2=H

O

13. R1
14. R1
15. R1
16. R1
17. R1

=Glc R2=H
=Glc R2=CH3
= R2=H
= R2=CH3
=H R2=CH3

Glc:-D-glucopyranosyl
Rha: -L-rhamnopyranosyl

Một hợp chất flavonol glycosit là kaempferit 3-rhamnosit (18) đã
được các nhà nghiên cứu của Ý phân lập được từ loài Agrimonia
eupatoria [10].
OH
HO

O

O
OH

O

OH

O

OH
OH

18. Kaempferit-3-rhamnosit

Cũng từ loài A. eupatoria các nhà nghiên cứu của Anh đã phân lập
được các flavonol glycosit như isoquercetrin (8) và kaempferol 3-O-β-Dglucopyranosit (19) [11]

12


OR'

2'
8

HO

O

2

7

3'

5'

1'

6'

3

6
5
OH

4
O

4' OH

OR

8. R=Rhamnosyl
19. R=H

R'=H
R'=Glucosyl

Các nhà nghiên cứu của Hàn Quốc đã phân lập từ loài Agrimonia
pilosa Ledeb được một số hợp chất flavonoit như tilirosit (5), 3- methoxy
quercetin (21), quercetin (7), và quercitrin (9). Các hợp chất trên được thử
hoạt tính cho thấy kết quả là hợp chất tilirosit (5) và quercetin (7) có khả
năng ức chế hoạt tính của enzyme acetylcholinesterase (AChe) với các
mức độ phụ thuộc rõ rệt vào liều dùng với các giá trị IC50 là 23,5µM và
19,8 µM [12].

5'
4'

6'
5'
4'

6'
8

HO

OH

3'
2

2

1'

3

OH

5

3

4

O

O

6

OH

6

OH

OH

1'
2'

3'
2'

OH

O

7

O

7

5

8

HO

4

O

OH

O

OH

HO
OH

9. Quercitrin (Quercetin 3-O-L-rhamnosit)

7. Quercetin

13


5'
4'

6'
8

HO

OH

3'

O

2

1'

7

2'

OH

3

6

OCH3

4

5

O

OH

20. 3-methoxyQuercetin

5'
4'

6'
8

HO

O

OH

3'
2

1'

7

2'

OH

3

6
5

OH

O

4

O

O

O

OH

O
OH

HO
OH

5. Tilirosit

Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc
được chất pilosanol N (21) từ loài A. pilosa Ledeb, và nhận thấy trong
loài này có hàm lượng cao polyphenol; một số chất flavonoit, coumarins,
glycosit phenolic với các đặc tính dược lý, như hoạt tính chống ung thư,
kháng viêm, kháng khuẩn, hoạt tính ức chế acetylcholine esterase và hoạt
tính ức chế nitric oxít (NO). NO là một trong những nguyên nhân phá hủy
các tế bào, theo nghiên cứu thì các hợp chất phenolic có hoạt tính ức chế
NO. Với kết quả thử hoạt tính của chất phân lập được, chỉ ra rằng chất
pilosanol N (21) đã ức chế NO nguyên nhân gây ra kích thích các đại

14


thực bào. Thông qua quá trình ức chế NO sẽ làm giảm sự sản xuất NO
quá mức [13,14, 15].

Me

3"

O
H3C
H3C

2" OH

4"

8"
O

1"

5"

6"

7"

OH

8

HO

6'

O

7

2

1'
3

6
5
OH

4
O

5'

4' OH
3'
2'

OH

OH

21. Pilosanol N

HO

O
O

22. Loliolit

Cũng nhóm nhà khoa học của Nhật ở trên đã phân lập và xác định
cấu trúc được 5 hợp chất như: quercitrin (9), agrimonolit 6-O-glucosit
(14), loliolit (22), dihydrokaempferol-3-O-glucosit (23), aromadendrin
(24) từ loài A. pilosa Ledeb.

15


OH
HO

OH

O
HO

O

O
OH

O

HO

OH
OH

OH
OH

O

O

OH

24. Aromadendrin

23. Dihydrokaempferol-3-O-glucosit

Các nhà nghiên cứu cũng đã thử hoạt tính ức chế nitric oxít và
nhận thấy các hợp chất quercitrin (9), dihydrokaempferol-3-O-glucosit
(23), aromadendrin (24) phân lập được có hoạt tính ức chế nitric oxít cao
hơn các hợp chất phenolic khác.
Một nhóm các nhà khoa học Brrazil đã phân lập được hợp chất
catechin và dẫn suất của chúng từ loài A. pilosa đồng thời nhận thấy
chúng có hoạt tính kháng khuẩn [16]. Catechin còn có hoạt tính bảo vệ
thần kinh chống lại glutamat, chúng còn có khả năng bắt các gốc tự do
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Các kết quả cho thấy catechin có
thể là chất bảo vệ thần kinh do hoạt tính bắt gốc tự do của nó [17, 18].
Catechin đã được chứng minh là có khả năng tác động đến quá
trình ức chế sự tạo thành các sợi alpha S (protein alpha-synuclein) và làm
mất tính bền của các sợi đó tạo ra từ trước. Sự kết tụ alpha S tạo thành sợi
trong não là gia đoạn chủ chốt trong quá trình phát triển của các bệnh

thần kinh thể Lewy và sự teo đa hệ thống [15].
1.2.2. Các hợp chất tecpenoit
Các nhà Khoa học Hàn Quốc và Trung Quốc đã phân lập và xác
định cấu trúc được các tritecpenoit như usrolic axít (25), polmolic axít
(26), tormentic axít (27), corosolic axít (28) từ loài Agrimonia pilosa
Ledeb. Các hợp chất trên có các hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng
viêm, trừ giun sán và chống chảy máu [2, 3].
16


30

29

R2
19

20

12
18
25

26

COOH

1

R1

28

3

27

HO
24

23

25. R1 = R2= H
26. R1 = H R2=OH
27. R1 = R2= OH
28. R1 = H R2=OH

1.2.3. Các hợp chất khác
Các loài thực vật thuộc chi Agrimonia có chứa các chất hypericin,
agrimophol, agrimol A-G, caffeic axit, gallic axit, dầu bay hơi, tannin,
axit hữu cơ, vitamin C, K.. .. [1].

O

OH

O

H3C
HO

CH3

HO

CH3

O

OH
MeO
H3C

CH3

HO

CH2
OH

O

O
H3C

OH

30. Agrimophol

29. Hypericin

17

CH3


OH

OH

OH

R1OC

COR3

OH
HO

HO
OH

MeO
CH3

COR

2

OMe

CH3

Agrimol A: R1=R3=CH(CH3)2, R2=CH(CH3)CH2CH3
B: R1=R3=CH2CH2CH3, R2=CH(CH3)CH2CH3
C: R1=R2 =R3=CH2CH2CH3
D: R1=CH(CH3)2, R2=CH(CH3)CH2CH3, R3=CH3
E: R1=R3=CH3, R2=CH(CH3)CH2CH3
F: R1=CH3, R2 =R3=CH2CH2CH3
G: R1=R2 =R3=CH(CH3)2

2. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Agrimonia.
2.1. Công dụng của một số loài thực vật chi Agrimonia đƣợc sử dụng
trong y học dân tộc Việt Nam:
Long nha thảo A. pilosa Ledeb var. nepalensis, cây có vị đắng,
chát, tính bình, có tác dụng thu liễm chỉ huyết, triệt ngược, chỉ lỵ, giải
độc. Thường dùng trị khái huyết, thổ huyết, băng huyết, đại tiện ra máu,
sốt rét, lỵ , tràng nhạc, lao lực, ung thũng [1].
Long nha thảo A. pilosa Ledeb, cây có tác dụng thu liễm chỉ huyết,
cầm lỵ, sát trùng. Điều trị các chứng xuất huyết như khái huyết, thổ
huyết, nục huyết, niệu huyết, tiện huyết, băng lậu, phúc tả, kiết lỵ, sốt rét,
viêm âm đạo do trùng roi [1]. Long nha thảo thường được sử dụng chữa
các bệnh như ban xuất huyết do giảm tiểu cầu, ban xuất huyết do dị ứng,
bệnh ưa chảy máu (hemophilia), xuất huyết đường tiêu hóa, xuất huyết
đường tiết niệu, xuất huyết tử cung...
Đặt biệt, kết quả nghiên cứu dược lý gần đây phát hiện Long nha
thảo có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, các chất
quercetin, ursolic acid,... trong Long nha thảo có tác dụng ức chế khả
năng tái sinh của virut HIV [19]. Hiện tại Long nha thảo bắt đầu được sử
dụng trên lâm sàng cho các bệnh nhân HIV/AIDS. Đã có một số nghiên
18

cứu trong nước từ nguồn tổng hợp hoặc nguồn gốc tự nhiên để làm thuốc
điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Theo đó, cây Long nha thảo đã
được sử dụng là một trong 10 vị thuốc mà nhóm lương y thuộc phòng
nghiên cứu các cây thuốc, bài thuốc dân tộc thuộc Trung tâm Công nghệ
Hóa dược và hóa sinh hữu cơ - Viện KH & CNVN từ năm 2004 đã điều
trị thành công một bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS (theo xét
nghiệm của bệnh viện Quân y 103 với biểu hiện người bị lở loét, nhiễm
trùng phổi nặng, suy kiệt thể chất. Sau 9 tháng điều trị bằng thuốc nam,
bệnh nhân đã khỏi bệnh, tăng cân, thân thể lành lặn như người bình
thường. Trên cơ sở bài thuốc nam đó, đến năm 2011 những lương y của
Trung Tâm đã hoàn thiện bài thuốc và tiến hành chữa khỏi cho nhiều
bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những bệnh nhân này đã khỏi bệnh, đi làm
việc bình thường và không phải dùng thuốc nữa.
2.2. Những nghiên cứu ở nƣớc ngoài về hoạt tính sinh học của thực
vật chi Agrimonia :
Đã có một số công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Hàn
quốc, Trung quốc trên một số loài thực vật thuộc chi Agrimonia. Các
nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ các phần dịch chiết từ lá và thân loài
cây này đã chỉ ra các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa,
hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư và hoạt tính kháng
HIV [2,5,7,19]. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy, Long nha thảo là vị
thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng. Chất agrimol trong Long nha thảo
có tác dụng trừ sán; tannins trong Long nha thảo có tác dụng chống virut
gây bệnh mụn rộp. Cao thuốc chế từ Long nha thảo có tác dụng làm co
mạch ngoại biên, tăng tốc độ đông máu, có tác dụng ức chế rất mạnh đối
với tụ cầu khuẩn vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn coli, trực khuẩn
lỵ, trực khuẩn thương hàn và trực khuẩn lao. Kết quả nghiên cứu ở Trung
Quốc cho thấy Long nha thảo có tác dụng ức chế mạnh đối với tế bào ung

thư mô liên kết S180, ung thư ruột, ung thư gan và một số loại ung thư
khác. Đặt biệt, kết quả nghiên cứu dược lý thập niên gần đây còn phát
19


hiện thêm Long nha thảo có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của
cơ thể; các chất quercetin, ursolic axít,... trong Long nha thảo có tác dụng
ức chế khả năng tái sinh của virut HIV. Hiện tại Long nha thảo bắt đầu
được sử dụng trên lâm sàng cho các bệnh nhân HIV/AIDS.
Từ dịch chiết ethanol của loài Agrimonia pilosa (APE) nhóm các
nhà nghiên cứu Hàn Quốc đã thử tác dụng gây chết và ức chế dòng tế bào
ung thư gan người là Hep G-2. Kết quả cho thấy với liều lượng APE là
50–400 μg/ml tiến hành thử nghiệm trong 24giờ và 48 giờ đối với dòng tế
bào ung thư gan Hep G-2 cho các giá trị IC50 là 154.42 μg/ml trong 24 h
và 87.0 μg/ml trong 48 h, như vậy có sự ngăn cản, gây chết và ức chế
dòng tế bào ung thư gan Hep G-2 [12,19].
Từ dịch chiết của loài Agrimonia pilosa (APE) một nhóm các nhà
khoa học Nhật Bản đã nghiên cứu các tác dụng chống viêm và chống dị
ứng đối với các dòng tế bào trong ống nghiệm và trong cơ thể chuột. Mô
hình thử nghiệm của chứng viêm và cơ chế phân tử liên quan là nghiên
cứu tác động bởi dịch chiết methanol của loài A. pilosa lên đại thực bào
chuột RAW 264,7. Lipopolysaccharit (LPS) sinh ra các chất trung gian
gây viêm nhiễm đã được đo. Sử dụng IgEDNP và kiểm chứng sự thoái
biến trong dòng tế bào chuột RBL-2H3 [13].
Các nhà khoa học Nhật Bản đã thử hoạt tính ức chế quá trình sinh
ra nitrit oxit bởi lipopolysaccharit (LPS) do RAW264.7 (đại thực bào
chuột) bằng dịch chiết etanol của loài A. pilosa Ledeb. Với ảnh hưởng
của nồng độ khác nhau (0,025%, 0,50%, 0,10% và 0,25%) của dịch chiết
EtOH của Agrimonia pilosa Ledeb để đánh giá sự ức chế quá trình sinh ra
nitrit oxit. Các giá trị ức chế đã được chỉ ra bởi sự ức chế (%) của các tế

bào trong mẫu cho LPS điều trị. Đánh giá khả năng tồn tại của tế bào với
các mẫu xử lý ở nồng độ thử nghiệm đã được kiểm tra bởi một khảo
nghiệm MTT, khả năng tồn tại của tế bào được thể hiện bằng giá trị %
của các tế bào kiểm soát mà không có mẫu. Với kết quả thu được thấy
20


dịch chiết của A. pilosa Ledeb có hoạt tính ức chế và điều chỉnh sự sản
sinh nitrit oxit quá mức, nguyên nhân gây ra độc và phá hủy tế bào [14].
Từ nghiên cứu tác dụng chống hen suyễn của dịch chiết AP trong
cơ thể và viêm đường hô hấp do ovalbumin (OVA), với việc sử dụng mô
hình trên chuột, kết quả cho thấy rằng dịch chiết của AP làm suy yếu sự
kích hoạt của các đại thực bào basophils và ức chế viêm đường hô hấp
gây ra bởi OVA. Các cơ chế phân tử cho thấy dịch chiết AP có tác dụng
kháng viêm và chống dị ứng mạnh. Từ đó cho thấy rằng AP có giá trị trị
liệu trong điều trị khác nhau đối với bệnh viêm bao gồm hen suyễn [20].
Khi nghiên cứu một số loài thực vật bản địa, một nhóm các nhà
khoa học Anh đã xác định được những loài có hoạt tính kháng khuẩn có
liên quan đến điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và vết thương, trong đó có
loài Agrimonia eupatoria. Chế phẩm của loài A. eupatoria đã được sàng
lọc hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn Gram dương và Gram
âm trong thử hoạt tính chống viêm. Bằng cách sử dụng phương pháp pha
loãng nồng độ trên 96 giếng, với các nồng độ là 200, 40 và 8 mg/ml.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định cho các chất chiết xuất giá
trị từ 2 đến 0,004 mg/ml. Chế phẩm của loài Agrimonia eupatoria có tác
dụng làm se vết thương và được sử dụng để điều trị tiêu chảy trẻ em,
viêm niệu đạo, viêm đại tràng, viêm bàng quang và viêm họng [21].
Các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu khả năng bảo vệ gan
của nước chiết từ loài A. eupatoria (AE) để chống lại chấn thương mãn
tính gan do ethanol. Thử nghiệm trên chuột được cho ăn một chế độ ăn

uống với chất lỏng Lieber-DeCarli trong 8 tuần sau đó động vật đã được
điều trị bằng miệng với nước chiết AE với liều lượng là 10, 30, 100, và
300 mg/kg/ngày. Kết quả sau khi chấn thương mãn tính gan do ethanol
gây ra, các hoạt động dẫn truyền huyết thanh aminotransferase và viêm
cytokine tăng đáng kể, song những gia tăng đã suy yếu sau khi điều trị
bằng nước chiết AE. Hoạt độ cytochrome P450 2E1 và peroxy lipid tăng
21


lên sau khi tiêu thụ ethanol mãn tính, trong khi giảm nồng độ glutathione,
những thay đổi này đã suy giảm do tác động của AE. Kết quả cho thấy
AE làm giảm chấn thương mãn tính gan gây ra do ethanol, và sự bảo vệ
đó có thể là do khả năng chống oxy hóa và truyền tín hiệu qua trung gian
TLR viêm [22].
Các nhà nghiên cứu của Anh tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn
và chống oxy hóa của các dịch chiết từ loài A. eupatoria và nhận thấy chỉ
có dịch chiết n-hexane có tác dụng ức chế đối với khuẩn Bacillus cereus
và Bacillus subtilis. Còn dịch chiết MeOH cho thấy hoạt tính nổi bật
chống oxy hóa dựa trên khảo nghiệm DPPH (1,1-diphenyl-,2picrylhydrazyl) ở nồng độ là 4,64. 10-4; 5,13.10-3 và 4,73.10-4 mg/ml.
Định lượng mật độ hấp phụ của DPPH, xác định được nồng độ chất
quercetin là 2,88.10-5 mg/ml cho hoạt tính chống oxy hóa tốt [23, 24, 25].
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học về các hợp chất phenolic
có trong loài Agrimonia asiarica, khi thử hoạt tính độc tế bào, chống u
bướu của các chất trên chuột thử nghiệm, kết quả cho thấy các hợp chất
này có hoạt tính rất khả quan khi giảm khoảng 60% khối u thử nghiệm
trong 10 ngày [16, 26].
Các loài thực vật thuộc chi Agrimonia đều chứa các lớp chất có
hoạt tính tốt và đa dạng, đặc biệt là các lớp chất flavonoit, phenolic và
tritecpen. Trên thế giới đã có nhiều nhóm nghiên cứu về chi này, tuy
nhiên ở Việt Nam chi Agrimonia này chưa được nghiên cứu sâu về thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học mà mới chỉ được sử dụng trong các
bài thuốc dân tộc để điều trị và chữa bệnh cho con người. Vì vậy chúng
tôi chọn loài thực vật Agrimonia pilosa Ledeb. thuộc chi Agrimonia có ở
Việt Nam để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học của chúng góp phần hiểu biết sâu hơn về loài thực vật chi Agrimonia
với mục đích tìm ra các chất, nguồn dược liệu để điều trị và chữa bệnh
hiệu quả cho con người.
22


CHƢƠNG 2. ĐỒI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, nhiệm vụ nghiên cứu:
Đối tượng là cây thuốc dân gian Long nha thảo (Agrimonia pilosa
Ledeb.), được chúng tôi thu hái cả cây để nghiên cứu. Ở Việt Nam cây có
nhiều ở Lào cai, Lai châu, Hà giang, Cao bằng, Lạng sơn, Hòa bình, Tam
đảo[1].
Các nhiệm vụ của luận văn là:
- Chiết tách mẫu với các loại dung môi khác nhau.
- Khảo sát hoạt tính sinh học của các cặn dịch chiết.
- Phân lập và tinh chế các hợp chất.
- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất:
Các phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất bao gồm các
phương pháp sắc ký như:
- Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng
sẵn 60 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng λ
254 nm và 365 nm; dùng thuốc hiện là dung dịch H2SO4 10% hoặc dung
dịch xeri sunfat.
- Sắc kí cột thường (CC), chất hấp phụ là silica gel Merck cỡ hạt

40-63µm.
- Sắc kí cột nhanh (FC), chất hấp phụ là silicagel Merck cỡ hạt 1540µm.
- Sắc ký cột gel (sephadex LH-20 ) hoặc nhựa trao đổi ion Diaion
HP-20; Sắc ký ngược pha RP-18 và sắc ký bản mỏng điều chế hoặc kết
tinh.

23


2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất:
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định bằng sự kết hợp
giữa các phương pháp vật lý và các phương pháp phổ hiện đại như: phổ
hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI-MS, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ
hạt nhân một chiều (1H-NMR,

13

C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC,

HMBC, 1H-1H COSY…).
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học:
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử trên 7 chủng vi khuẩn
và nấm theo phương pháp pha loãng nồng độ của Hadacek F. Greger H.
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D. A.
và cộng sự trên 2 dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư vú (MCF7)
và đối chiếu với các chất chuẩn. Hoạt tính kháng oxi hóa được thử theo
phương pháp DPPH của Shela G. và cộng sự.

24

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm thực vật của cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa
Ledeb.)
Cây Long nha thảo là loại cây thảo sống lâu năm cao khoảng 60120cm, toàn thân rậm lông nhung dài màu trắng. Lá do 5-9 lá chét to và
lá phụ nhỏ, hình bầu dục hay trái xoan ngược, mép có răng có lông nhung
như len ở cả hai mặt, có tuyến, lá bắc xoan to, có răng. Chùm hoa thưa
cao 10-30cm, cuống hoa ngắn, đài có thuỳ nhọn; cánh hoa màu vàng, nhị
5-15, nhụy hai lá noãn rời. Ðài ở quả có gai móc đứng, rãnh 10, quả bế 2,
ra hoa tháng 4-7, quả tháng 8-10.
Hình 1. Cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.)

3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất
3.2.1. Thu hái và xử lý mẫu thực vật:
Chúng tôi chọn thời điểm cây phát triển nhất khi chúng có cả hoa
và quả để thu hái. Mẫu thực vật được chúng tôi thu hái vào tháng 8 tại
Sapa - Lào cai - Việt nam. Tên cây được nhà thực vật học Nguyễn Kim
Đào (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật) thẩm định, tiêu bản được lưu
giữ tại phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học,
Viên Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
25