XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM DẦU MÙ U BẰNG HPL

NTTU-NCKH-05

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM DẦU MÙ U
BẰNG HPLC
Số hợp đồng: 2017.01.46

Chủ nhiệm đề tài: ThS.DS. Nguyễn Hoàng Thảo My
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 12 tháng


Luận văn Thạc sĩ Dược học

ii

Mục lục

MỤC LỤC
MỤC LỤC ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. vii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ MÙ U ................................................................................ 3
1.1.1 Sơ lược về cây Mù u ...................................................................................... 3
1.1.2 Tổng quan về Dầu Mù u ................................................................................ 3
1.1.3 Tổng quan về hoạt chất Calophyllolid trong Dầu Mù u ................................ 9
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U .............................................. 10
1.2.1 Các nghiên cứu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u ............................... 10
1.2.2 Phương pháp định lượng hoạt chất trong Dầu Mù u.................................... 11
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 12
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................... 12
2.1.1 Nguyên liệu .................................................................................................. 12
2.1.2 Hóa chất – Dung môi ................................................................................... 12
2.1.3 Trang thiết bị ................................................................................................ 12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................. 13
2.2.1 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ................................................................ 13
2.2.2 Khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình phân tích ............................. 15
2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích ..................................................................... 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 17
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT CALOPHYLLOLID TỪ DẦU
MÙ U .................................................................................................................... 17
3.1.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết calophylloid từ dầu Mù U ....................... 17
3.1.2 Chiết cắn courmarin từ dầu Mù u ................................................................ 18
3.1.3 Xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE).............................................. 19
3.1.4 Khảo sát các điều kiện sắc ký ...................................................................... 20

Luận văn Thạc sĩ Dược học

iii

Mục lục

3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG ............................... 23
3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .................................................... 24
3.3.1 Tính đặc hiệu ................................................................................................ 24
3.3.2 Tính tuyến tính ............................................................................................. 25
3.3.3 Độ lặp lại ...................................................................................................... 26
3.3.4 Độ đúng ........................................................................................................ 27
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ............................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 29


Luận văn Thạc sĩ Dược học

iv

Danh mục từ viết tắt

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

C

Nồng độ

CĐC

Chất đối chiếu

DCM

Dicloromethan

dd

Dung dịch

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

MeOH

Methanol

EtOH

Ethanol

H

Chiều cao pic

HL

Hàm lượng

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

M

Khối lượng

N

Số đĩa lý thuyết

PA

Purity angel

PDA

Photodiode array

PT

Purity threshold
-

ppm
RS

Độ phân giải

S

Diện tích pic

SKC

Sắc ký cột

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM
TLC

Thin layer chromatography

tR

Thời gian lưu

UV

Định lượng Calophyllolide trong dầu Mù u bằng HPLC

-

Nguyễn Hoảng Thảo My


Luận văn Thạc sĩ Dược học

Danh mục hình ảnh

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Một số sản phẩm từ Dầu Mù u .......................................................................8
Hình 1.2. Công thức khai triển của Calophyllolid ..........................................................9
Hình 1.3. Phản ứng mở vòng lacton của Calophyllolid..................................................9
Hình 2.1. Mẫu dầu Mù u nguyên liệu ...........................................................................12
Hình 2.2. Cột chiết pha rắn (SPE ) và cột sắc ký HPLC ..............................................13
Hình 2.3. Hình minh họa quá trình “Thẩm định quy trình phân tích” ..........................16
Hình 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết calophyllolid từ dầu Mù u ........................17
Hình 3.2. SKĐ mẫu thử Dầu Mù u với phương pháp chiết cắn courmarin qua các tỉ lệ
dung môi methanol – nước ............................................................................................18
Hình 3.3. Mẫu chuẩn trước và sau khi xử lý qua SPE. .................................................19
Hình 3.4. SKĐ mẫu dầu Mù u chưa xử lý qua SPE .....................................................19
Hình 3.5. SKĐ mẫu dầu Mù u đã xử lý qua SPE methanol 90% .................................19
Hình 3.6. SKĐ mẫu Dầu Mù u qua SPE methanol 100% ............................................20
Hình 3.7. Kết quả khảo sát Dầu Mù u trên các hệ acetonitril – acid acetic (pH 3,0) ...21
Hình 3.8. Kết quả khảo sát Dầu Mù u trên các hệ methanol – acid acetic (pH 3,0) ....22
Hình 3.9. Phổ overlay khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình định lượng
calophyllolid trong Dầu Mù u bằng HPLC ...................................................................23
Hình 3.10. Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng calophyllolid
trong Dầu Mù u bằng phương pháp HPLC ...................................................................25
Hình 3.11. Đường biểu diễn tương quan nồng độ và diện tích pic calophyllolid ........26

Hình 3.12. SKĐ overlay và dữ liệu SKĐ kết quả Độ lặp lại ........................................27

Định lượng Calophyllolide trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoảng Thảo My


Luận văn Thạc sĩ Dược học

vi

Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Hàm lượng các acid béo trong Dầu Mù u. [13] .............................................4
Bảng 1.2: MIC (µg/ml) của dầu Mù u trên một số vi khuẩn ..........................................5
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình định lượng
calophyllolid trong Dầu Mù u (n=6) .............................................................................23
Bảng 3.2: Kết quả thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu calophyllolid ..................25
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định lượng calophyllolid trong
Dầu Mù u bằng phương pháp HPLC (n=6) ...................................................................26
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng .............................................................................27
Bảng 3.5: Kết quả thẩm định quy trình định lượng calophyllolid trong dầu Mù u ......28

Định lượng Calophyllolide trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoảng Thảo My


Luận văn Thạc sĩ Dược học

Lời cam đoan

vii

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sản phẩm đạt được

Sản phẩm đăng ký tại thuyết minh

01 quy trình định lượng Calophyllolid

01 quy trình định lượng Calophyllolid trong

trong dầu Mù u bằng phương pháp sắc ký

dầu Mù u bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

lỏng hiệu năng cao

năng cao

01 báo cáo tổng kết đề tài

01 báo cáo tổng kết đề tài

01 bài báo

01 bài báo

.

Thời gian đăng ký : từ ngày

đến ngày

Thời gian nộp báo cáo: ngày

Định lượng Calophyllolide trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoảng Thảo My


Đặt vấn đề

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
-Dầu Mù u, nguyên liệu được ép từ quả của cây Mù u (Calophyllum inophyllum Linn.,
Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae).
Dầu Mù u là nguyên liệu đã được dân gian sử dụng từ những thập niên 20 của thế kỷ
trước để điều trị các bệnh về thần kinh tọa. Từ năm 1918, các nhà khoa học Pháp đã
bắt đầu nghiên cứu tác dụng tại chỗ đối với da và khả năng làm lành da của dược liệu.
Khoa học hiện đại cũng đã có nhiều công trình chứng minh các tác dụng dược lý của
dầu này như tính kháng viêm, kháng khuẩn [25], [20], trị sẹo [34],[42] chữa bỏng [18]
và mau lành vết thương [35], [38],. Y học không ngừng phát triển, các sản phẩm điều
trị vết thương ngoài da càng được cải tiến, nguyên liệu dầu Mù u vẫn là vị thuốc thu
hút sự quan tâm của các nhà Dược học trong và ngoài nước đối với các sản phẩm này
[6], [7], [22], [31]

-Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA cho phép định lượng hàm lượng
hoạt chất lẫn độ tinh khiết của đỉnh sắc ký để xác định chính xác hàm lượng mẫu phân
tích đã mang lại nhiều ứng dụng trong ngành phân tích, kiểm nghiệm
Việc xác định hàm lượng Calophyllolid trong dầu Mù u vẫn chưa có tại DĐVN IV và
là hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên chế phẩm dạng dầu.
Trên cơ sở đó; tôi tiến hành đề tài “Định lượng calophyllolid trong chế phẩm
dầu Mù u bằng HPLC ” nhằm giới thiệu kỹ thuật kiểm nghiệm dạng bào chế mới và
cách xử lí mẫu để làm cơ sở cho việc đánh giá, quản lý chất lượng các sản phẩm từ
dược liệu Mù u. Trong đó, đặc biệt chú trọng việc định lượng với chất đối chiếu là
marker bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Định lượng Calophyllolide trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoảng Thảo My


3

Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ MÙ U
1.1.1 Sơ lược về cây Mù u
Tên khoa học: Calophyllum inophyllum Linn. (Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc
chi Calophyllum là một trong những chi lớn nhất của họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae).
Tên gọi khác: Hồ đồng, Kungtung, Khchyong (Campuchia),YaraboTetihabocu (Nhật
Bản), Alexandrian Laurel (Pháp), Dilo (Fiji), Kamanu (Hawail)... [1], [3], [9]
Mù u phân bố rộng rãi từ Thái Lan, Malaysia đến Lào, Campuchia, Indonesia
và một số đảo ở Nam Thái Bình Dương cũng như một số tỉnh ở miền Nam của Trung
Quốc, đặc biệt là rất nhiều ở Ấn Độ. Mù u là cây thân mộc , có thể cao đến 20 – 25 m,

đường kính trung bình 30 – 35 cm. Lá mọc đối, phía lá hơi cuống lại, đầu lá hơi tù,
phiến lá dài 10 – 17 cm, gân rất nhỏ, chạy song song và nổi rõ ở hai mặt lá. Hoa khá
to, thơm, có màu trắng, mọc thành xim hay kẽ lá ở đầu cành và chính là đặc điểm nổi
bật phân biệt Mù u với các loại cây thân mộc khác. [5]
Tại Việt Nam, dược liệu dân gian này được phân bố chủ yếu ở các vùng núi
thấp của miền Bắc, miền Trung và đặc biệt là khu vực Tây Nam Bộ. Khu vực miền
Tây Nam Bộ với một số tỉnh điển hình như: Tiền Giang, Long An, Bến Tre, Vĩnh
Long, Đồng Tháp, Cần Thơ… thường gặp cây Mù u dọc theo các bờ kênh rạch cao
hoặc vùng cát ven bờ biển. [5], [11]

1.1.2 Tổng quan về Dầu Mù u
Theo chuyên luận Mù u của DĐVN IV; dầu Mù u (Oleum calophylii inophylii) được
định nghĩa là dầu ép từ hạt của cây Mù u đã được tinh chế loại bỏ phần “nhựa” với thể
chất dầu lỏng, sánh, màu vàng tới vàng sậm, mùi thơm hắc đặc trưng.[14]
Các nghiên cứu trong nước về việc ly trích Dầu Mù u từ hạt với các phương
pháp khác nhau sẽ cho hàm lượng hoạt chất và thành phần hóa học có sự khác biệt.
Năm 2016, Nguyễn Hữu Hiếu và các cộng sự tại khoa Kỹ thuật Hóa học – trường Đại
học Bách Khoa TP.HCM đã tối ưu hóa quá trình bằng kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn
(SCF – CO2) và phân tích thành phần trên hệ thống GC – MS so sánh với phương pháp
ép cơ học và chiết với ether dầu hỏa.[8]. Trước đó, xét trên quy mô công nghiệp, luận
án của Đinh Văn Trạch (2013) đã đi sâu vào phương pháp ép lạnh cơ học với hệ thống
Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


4

Tổng quan tài liệu

cô thu hồi dung môi nhằm nâng cao hiệu suất chiết và xác định một số thành phần
bằng kỹ thuật GC – MS và HPLC.[21]
Nghiên cứu được công bố vào tháng 8/2017 của Malaysia đã dùng kỹ thuật
chiết siêu âm (Ultrasonic – assisted extraction, gọi tắt là UAE) và dùng mô hình
Patricelli để đánh giá động học của quá trình chiết xuất và tối ưu hóa quy trình.[36]
1.1.2.1 Thành phần hóa học
Từ năm 1985, các nghiên cứu về Mù u tại Khoa Dược – Đại học Y Dược
TP.HCM của PGS.TS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ cho thấy hạt Mù u chứa 41-51 % dầu
thô, trong đó hàm lượng dầu béo và chất nhựa trong dầu thô lần lượt là 71,5% và
28,5%. Các nghiên cứu tiếp nối tại Khoa Dược năm 2009 cũng xác định rõ hơn các
thành phần bằng kỹ thuật GC-FID.[13] [17]
Bảng 1.1: Hàm lượng các acid béo trong Dầu Mù u. [13]
Thành phần acid béo

Hàm lượng (%)

Acid oleic

37,35

Acid linoleic

28,67

Acid palmitic

18,34

Acid stearic

15,32

Hoạt chất chính trong hạt Mù u thuộc nhóm 4-phenyl courmarin; hàm lượng
courmarin được xác định trong dầu Mù u thô là 0,77% ; trong Dầu Mù u tinh chế là
0,5% ; trong nhựa dư phẩm là 0,15% và trong bã của phương pháp ép lạnh để chiết
xuất dầu là 1,75 – 2,13 %. Các dẫn xuất courmarin quan trọng được biết đến bao gồm:
calophyllolid (C25H22O5), inophyllolid (C25H22O5), acid calophyllolid (C25H24O6), acid
inophyllolid (C17H22O3)… [12], [13], [14].
Theo dữ liệu về chuyên mục Mù u trong “Những cây thuốc và vị thuốc Việt
Nam (2007)” cũng như chuyên đề về dầu Mù u (Tamanu oil) của nhóm tác giả
A.C.Dweck về thành phần hóa học trong các loại dầu Mù u thuộc khu vực Châu Á và
châu Phi cho thấy Tocopherol và Tocotrienol được xem là những chất chống oxi hóa
tự nhiên tạo nên sự ổn định của dầu. Trong Calophyllum inophyllum L. thì thành phần
chính là D-Tocotrienol (236,0 mg/kg), sau đó là C-Tocotrienol với hàm lượng khá cao
(64-130mg/kg). [5], [32].

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


5

Tổng quan tài liệu

Nhìn chung, thành phần hóa học của Dầu Mù u được chia làm 3 nhóm chính: nhóm
lipid, những chất có hoạt tính chống oxi hóa và thành phần không lipid (các hợp chất
courmarin, flavonoid…).
1.1.2.2 Tác dụng dược lý
Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Các thực nghiệm của nhóm nghiên cứu tại Đại học Paris Descartes (Pháp) cuối
năm 2015 cho thấy nhóm hoạt chất phenyl courmarin cho hoạt tính kháng khuẩn điển
hình nhất, kể cả trên vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis. Hoạt tính kháng khuẩn
của dầu Mù u thể hiện mạnh trên vi khuẩn gram dương và khá yếu trên vi khuẩn gram
âm. Dầu Mù u có hoạt tính kháng khuẩn rõ trên chủng Staphylococcus aureus và
Bacteroides fragilis do tác dụng ức chế trực tiếp sự phân bào. Các phân đoạn của quy
trình cho thấy tác động của dầu Mù u tương tự như ofloxacin và được khuyến nghị sử
dụng trong điều trị các bệnh ngoài da gây bởi nhóm vi khuẩn gram dương.[35]
Các nghiên cứu tại Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM những năm 2000
cũng cho thấy hiệu quả diệt khuẩn tốt trên dòng vi khuẩn gram dương và xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cả dầu Mù u thô và tinh chế. Kết quả cho thấy dầu
Mù u thô cho hiệu quả ức chế gấp đôi so với dầu đã qua tinh chế hay trong thành
phẩm.[2]
Bảng 1.2: MIC (µg/ml) của dầu Mù u trên một số vi khuẩn
MIC Dầu Mù u thô

MIC Dầu Mù u tinh chế

(µg/ml)

(µg/ml)

Streptococcus faecalis

64

128

Streptococcus aureus

32

64

MRSA

64

128

Vi khuẩn

Trong nhóm courmarin, calophyllolid có tác dụng ức chế toàn bộ sự tăng
trưởng của Mycobacterium tubeculosis H37RV khi pha loãng ở nồng độ 1/20000
không có huyết thanh , và nồng độ 1/7500 với sự hiện diện của 5% huyết thanh. Acid
calophyllic có hoạt tính kém hơn với việc kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn ở nồng
độ 1/7500 khi không có huyết thanh và 1/1000 khi có 5% huyết thanh.[16]. [27]

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


6

Tổng quan tài liệu

Các xanthon phân lập được từ Mù u cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều
chủng vi sinh vật khác nhau trong đó có Staphylococcus aureus theo thứ tự giảm dần
là 6-deoxyjacareubin, jacareubin và calophyllin B. 1,5-dihydoxyxanthon có tác dụng

kháng Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, ức chế sự phát triển của
Cladosporium cucumerum với MIC là 0,25 (µg/ml) và 200 (µg/ml) với
Staphylococcus aureus. Hoạt chất này cũng thể hiện tác dụng kháng nấm trên
Aspergillus fumigatus. Tác dụng mạnh trên các vi nấm được biết đến là 1,3,5 –
trihydroxy – 2- methoxyxanthon với tác dụng ức chế cả Aspergillus flavus,
Aspergillus niger , Aspergillus fumigatus và Candida albicans.[30], [33]
Hoạt tính kháng viêm
Các nghiên cứu mới tại Bangladesh vào năm 2017 cho thấy dịch chiết ethanol
từ lá Mù u chứa các flavonoid tương tự như trong thành phần Dầu Mù u cho tác động
kháng viêm, giảm đau rõ do cơ chế tác động trên cyclooxygenase làm giảm việc tiết
prostaglandins gây đau. Tác dụng giảm đau và kháng viêm được so sánh với chất đối
chiếu Diclofenac.[25]
Năm 2014, Muhamad Bin Zakaria và các cộng sự tại trường đại học quốc gia
Malaysia đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của dầu Mù u thô cho việc
chiết xuất dầu Mù u thô ở nồng độ 50µg/ml sẻ ức chế 77% cyclooxygenase và 88%
lipooxygenase cho thấy tác dụng kháng viêm tiềm năng của dầu.[28]
Trước đây, các thử nghiệm trên thỏ cho thấy Dầu Mù u có tác dụng làm mau
lành vết thương. Gây vết thương bằng cách cắt bỏ miếng da ở đầu thỏ, hàng ngày bôi
Dầu Mù u lên vết thương, theo dõi đo đường kính vết thương và thực hiện các xét
nghiệm vi khuẩn và giải phẫu bệnh lý. [24]
Hoạt tính kháng virus
Quả và dịch chiết từ lá Calophyllum inophyllum đã phân lập được hai
courmarin có hoạt tính chống lại sự phiên mã ngược của virus HIV là (+) –
Inophyllum B và (+) – Inophyllum P.[38]. Thử nghiệm in vitro của các xanthon phân
lập được từ rễ cũng cho hoạt tính kháng virus với hoạt chất có giá trị nổi bật là
caloxanthon với việc chữa trị nhiễm coronavirus.[26], [29]
Nhóm nghiên cứu phối hợp của Singapore và Trung Quốc đầu năm 2017 cho
thấy lá của Mù u là bộ phận chính chứa hoạt chất amentoflavon là một nhân tố tiềm
Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


7

Tổng quan tài liệu

năng trong kháng virus lẫn hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khối u và tác
động trên hệ thần kinh trung ương lẫn tim mạch. Amentoflavone thể hiện khả năng

chống lại bệnh sốt xuất huyết bằng cách ức chế RNA polymerase. Amentoflavone
đã được chứng minh là chất chủ động ức chế coronavirus hô hấp cấp tính nghiêm
trọng (SARS-CoA) với IC50 là 8,3 μM. Hiệu quả được kết luận tương ứng với sự ức
chế protease giống chymotrypsin. Hơn nữa, trong trường hợp suy giảm miễn dịch ở
người, virus (HIV) và virus đồng hợp hô hấp (RSV), Amentoflavone có kết quả tốt
với IC50 lần lượt là 119 μM và 5,5 μg / mL.[42]
Hoạt tính bảo vệ chống tia UV
Dầu Mù u có đặc tính hấp thụ tia UV đáng kể hay các tác nhân quang học.
Shanmugapriya và các cộng sự (2016) đã làm rõ hoạt tính này cũng như các giá trị của
Mù u về phương diện kháng khuẩn, kháng ung thư, chống lão hóa hay trị đái tháo
đường. Dữ liệu của nghiên cứu cho thấy nồng độ dầu ở mức 1/10000 (v/v) có tác dụng
trên tế bào nhằm chống lại việc gây tổn thương DNA của tia cực tím. Nồng độ dầu ở
mức 1% không có tác dụng gây hại trên tế bào biểu mô người nên thường được sử
dụng ngoài da như tác nhân chống nắng. [38]. Các hợp chất tự nhiên trong dầu điển
hình cho hoạt tính này là các flavonoid và polyphenol với khả năng hấp thụ bức xạ cao
nhất là khu vực UV–C đến UV–B và cuối cùng là UV–A. [40]
1.1.2.3 Công dụng trị liệu
- Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy Dầu Mù u ép từ hạt già có tác dụng tốt để trị ghẻ
và thuốc mỡ bào chế từ Dầu Mù u có tác dụng trị bỏng, mụn nhọt, lở loét. Tác dụng
này đã được áp dụng điều trị 350 ca lộ tuyến và lộ tuyến viêm tử cung và đạt kết quả

lành tính 92%. [10]
- Dân gian dùng dầu mù u xoa bóp chữa tê thấp, bôi trị mụn trứng cá, trĩ. Dầu Mù u
bôi ngoài da làm tan các chỗ sưng tấy, mụn nhọt hay vết loét nhiễm trùng, chữa đau
họng, làm lành sẹo, nhất là để trị bỏng.[14], [23]
- Ngoài ra dầu Mù u còn giúp dưỡng da, chống nắng, giữ ẩm cho da, đặc biệt còn có
tác dụng trị vết thâm, thẹo, vẩy nến cực kỳ hiệu quả. [10]

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


8

Tổng quan tài liệu

1.1.2.4 Các sản phẩm từ Dầu Mù u
Trong nước
Một số chế phẩm với nguyên liệu từ dầu Mù u được biết đến như: “Dầu Mù u”
của công ty cổ phần dược Minh Hải, thuốc mỡ “Trăn Mù u” của công ty cổ phần dược
phẩm Quang Minh, chế phẩm “Dầu Mù u Inopilo” của công ty trách nhiệm hữu hạn
thương mại và sản xuất dược phẩm Bình Minh, chế phẩm “Dầu Mù u SP” của công ty
dược phẩm Phương Nam …với mức TCCS gần tương đương tiêu chuẩn DĐVN IV.
Dạng chế phẩm khác với tác dụng trị viêm loét hay nấm da được biết đến phổ
biến như dạng kem (Balsino) hay thuốc mỡ (Mecalin).[19].
Hướng nghiên cứu của PGS.TS.Võ Thị Bạch Huệ đã mở rộng trên một số dạng
bào chế ứng dụng khác từ dầu Mù u như xà bông, gạc tẩm, gel, dạng dầu phối hợp
dược liệu…cũng đã được nghiên cứu thực nghiệm và tiêu chuẩn hóa.[8], [13], [25].
Ngoài nước
Một số chế phẩm từ Dầu Mù u được lưu hành ở Pháp như Inocalo huile (dạng

ống, thuốc mỡ hoặc thuốc trứng) có tác dụng mau làm lành sẹo, tái sinh mô, viêm da
hay bỏng; ngoài ra Inocalo có iod phối hợp hỗ trợ trong việc phòng phong thấp. Dạng
phối hợp giữa Calophyllum inophyllum với morphin bazơ trong viên nén 1mg, thuốc
đạn 3mg hay thuốc ống 5ml nhằm chữa các rối loạn về thần kinh hay triệu chứng ho
lâu ngày. Ngoài ra, các dòng sản phẩm dưỡng da như lotion, kem, sữa rửa mặt hay xà
bông..từ dầu Mù u của Hoa Kỳ cũng đem lại hiệu quả sử dụng rõ rệt.

Hình 1.1. Một số sản phẩm từ Dầu Mù u

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


9

Tổng quan tài liệu

1.1.3 Tổng quan về hoạt chất Calophyllolid trong Dầu Mù u
Calophyllolid là những tinh thể hình trụ, không màu, dễ tan trong aceton, n –
hexan, benzen, ether ethylic hay alcol… Nhiệt độ nóng chảy: 158 – 159 oC, không có
tính quang hoạt. Các nghiên cứu trong và ngoài nước dựa trên phổ UV, phổ NMR, phổ
tia X đã xác định được công thức khai triển của calophyllolid.[22], [34]
Tính chất hóa học
Calophyllolid thuộc nhóm courmarin nên những phản ứng đặc trưng cho nhóm
chức được biết đến bao gồm: phản ứng mở vòng lacton, phản ứng diazo hóa, phản ứng
phát huỳn quang, phản ứng FeCl3 hay phản ứng vi thăng hoa.
Với phản ứng mở vòng lacton, calophyllolid trong môi trường kiềm cho acid
calophyllolid và khi đun nóng sẽ lacton hoá trở lại cho dạng ester vòng .

Hình 1.2. Công thức khai triển

Hình 1.3. Phản ứng mở vòng lacton của

của Calophyllolid

Calophyllolid

Chiết xuất calophyllolid
Calophyllolid thuộc nhóm coumarin là những chất phân cực yếu nên đa số tan
trong ether dầu và ether ethylic. Nhiều trường hợp có thể thu được tinh thể coumarin
ngay trong dung dịch ether hoặc dung môi ether dầu. Do sự có mặt của nhóm lacton,
một số coumarin tan được trong kiềm nóng, dịch kiềm khi acid hoá sẽ thu lại
courmarin. Các glycosid coumarin có thể chiết bằng dung dịch cồn loãng (EtOH,
Methanol 60-80%). Dược liệu có nhiều chất béo nên sơ bộ loại chất béo bằng ether
dầu. Dịch chiết cồn đã loại chất béo có thể kết tinh coumarin ngay sau khi bốc hơi
dung môi.[30]
Năm 2002, Trần Thanh Thạo và nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp
của Spath và Socias dựa vào sự đóng mở vòng lacton để chiết xuất calophyllolid.

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


10

Tổng quan tài liệu

Nghiên cứu sử dụng NaHCO3 làm tác nhân mở vòng rồi acid hóa lại bằng HCl 10%

và chiết với benzen để thu cắn courmarin. Sau đó, sử dụng sắc ký cột để phân lập hoạt
chất.[23]. Đối với các dẫn chất coumarin có nhiều nhóm OH hoặc các coumarin
glycosid thì khó tan trong dung môi hữu cơ, hơn nữa các phenol coumarin dễ bị oxy
hoá bởi không khí trong môi trường kiềm, các acyl coumarin cũng dễ bị cắt nhóm acyl
trong môi trường kiềm nên phương pháp Spath bị hạn chế. Trong trường hợp này nên
chiết bằng dung môi kém phân cực rồi tăng dần độ phân cực. Bốc hơi từng dung môi,
kiểm tra sự có mặt của coumarin rồi tách biệt từng dẫn chất coumarin bằng sắc kí cột.
Năm 2003, Chen và các cộng sự đã chiết từ dầu với EtOH rồi phân bố trong
EtOAc và dùng sắc ký cột lẫn sắc ký lớp mỏng điều chế để phân lập. [67]. Năm 2009,
Leu và cộng sự đã phân lập calophyllolid từ nhựa trung tính và nhựa acid thu được khi
tinh chế dầu thô ép từ hạt của Calophyllum inophyllum ở vùng Polynesia (Pháp).[28]

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U
1.2.1 Các nghiên cứu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u
1.2.1.1 Trong nước
Các nghiên cứu trong nước về tiêu chuẩn hóa trên dầu được nhiều nhóm nghiên cứu
trên các chuyên ngành khác nhau thực hiện. Nhóm tác giả thường tinh chế hoặc xây
dựng quy trình điều chế và đưa ra tiêu chuẩn sơ bộ cho thành phẩm.[19]. Các chỉ tiêu
chung của dạng dầu được quan tâm là: chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa. Chỉ số
peroxyd, chỉ số iod, độ nhớt, tỷ trọng và định tính, định lượng hàm lượng hoạt chất
theo các phương pháp thử của DĐVN IV. [28]
1.2.1.2 Nước ngoài
Các chỉ tiêu được quan tâm trong tiêu chuẩn hóa dạng dầu bao gồm các chỉ tiêu lý hóa
như các nghiên cứu tại Việt Nam và bổ sung một số tiêu chí phù hợp với khu vực như
độ ẩm, tỷ trọng ở các mức nhiệt độ khác nhau. Những nghiên cứu mới đầu năm 2017
đã hướng đến điều chế dạng nhiên liệu sinh học là dạng ester của dầu Mù u, vì thế các
thông số ban đầu để xác định đúng nguyên liệu và không bị pha lẫn là hết sức cần
thiết.[41] Ngoài ra, các nghiên cứu trên dầu Nghệ cũng chú trọng vào việc xác định
thành phần dựa vào kỹ thuật sắc ký.[37]

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


11

Tổng quan tài liệu

1.2.2 Phương pháp định lượng hoạt chất trong Dầu Mù u
1.2.2.1 Phương pháp định lượng hoạt chất calophyllolid bằng phương pháp

HPLC
Calophyllolid thuộc nhóm courmarin nên hướng nghiên cứu thường hướng đến
chiết xuất và định lượng nhóm chức này. Tùy vào loại mẫu khác nhau mà cách xử lí
mẫu có sự khác biệt.
Frederic và cộng sự đã dùng cột silica (Uptisphere), lỗ sốp 120 Ao, hạt 5 µm, kích
thước 250 mm x 4,6 mm để tách các coumarin khác nhau có trong lá Mù u
Calophyllum inophyllum bằng hệ thống HPLC tiêm mẫu tự động với đầu dò UVDAD.[23].
Những nghiên cứu về sau đã xác định hàm lượng calophyllolid trong các mẫu dầu Mù
u khác nhau theo hai hướng: tạo cắn courmarin hoặc bơm mẫu trực tiếp. [6], [15], [21]
Kỹ thuật HPLC thường được dùng phối hợp với một số kỹ thuật khác như GC,
NMR, IR…trong việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu calophyllolid. [4], [7]
1.2.2.2 Định lượng hoạt chất trong chế phẩm bằng các phương pháp khác
Kỹ thuật GC-MS là kỹ thuật thứ hai sau HPLC được lựa chọn trong các nghiên
cứu định lượng hoạt chất như calophyllolid. Bên cạnh đó, phổ UV, IR , NMR giúp xác
định cấu trúc chất phân lập được. Ngoài ra, kỹ thuật DSC góp phần xác định độ tinh
khiết của chất. Một số nghiên cứu đã tiến hành so sánh hai kỹ thuật trên để đưa ra mức
chất lượng chung cho chỉ tiêu về hàm lượng. [7], [29]

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


12

Phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên liệu
Nguyên liệu thử nghiệm: chế phẩm dầu Mù u do nhóm nghiên cứu điều chế

Hình 2.1. Mẫu dầu Mù u nguyên liệu

2.1.2 Hóa chất – Dung môi
Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm các chỉ số của dầu Mù u, SKLM:
benzene, diethyl ether, chloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol, methanol, natri
carbonat, acid acetic, hydrocloric, kali hydroxyd, natri hydroxyd phân tích do Trung
quốc sản xuất.
Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm phương pháp HPLC và SPE: methanol,
acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC; acid phosphoric, acid acetic và acid formic đạt tiêu
chuẩn phân tích do Merck sản xuất.
Chất đối chiếu:
Calophyllolid (92,93%), số lô Cal03/0-1/17
Dầu Mù u chuẩn
do Viện Kiểm nghiệm thuốc TpHCM cung cấp.

2.1.3 Trang thiết bị

Các trang thiết bị chính
Hệ thống HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA
Bản sắc ký silica gel F254 (Merck)
Cân phân tích Sartorius PB 221S độ nhạy 0,1mg
Cân phân tích Sartorius 255D độ nhạy 0,01mg
Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


13

Phương pháp nghiên cứu

Máy đo pH Metrohm 744
Cột sắc ký Inerstil (250 x 4,6 mm; 5 μm)
Cột chiết mẫu pha rắn SPE C18-E (Agilent)
Cột chiết mẫu pha rắn SPE Strata C18-E (Phenomenex)
Bể siêu âm Elma S30H, tần số 37kHz, công suất 280W
Bếp cách thủy Memmert WNB29
Và các trang thiết bị – dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm.

Hình 2.2. Cột chiết pha rắn (SPE ) và cột sắc ký HPLC

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu được thực hiện trên mẫu Dầu Mù u (NCLo1016)
theo các bước như sau:
- Khảo sát dung môi hòa tan mẫu: methanol và acetonitril, chọn dung môi hòa tan
được calophyllolid, ít tạp và đường nền trên SKĐ HPLC ổn định.

- Chiết cắn courmarin: sử dụng dung môi hòa tan đã khảo sát để chiết coumarin toàn
phần từ dầu Mù u.
- Chiết bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE): mẫu coumarin toàn phần được xử lý bằng
kỹ thuật SPE. Khảo sát các dung môi rửa giải qua SPE, chọn phân đoạn có tín hiệu
tương đương với pic calophlloid trên SKĐ SKLM hoặc HPLC.
Tiến hành song song với mẫu chuẩn để đảm bảo tỷ lệ phục hồi calophyllolid >
98%.
Quy trình kiến nghị:

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


14

Phương pháp nghiên cứu

- Khảo sát dung môi chiết: cân khoảng 2,0 g dầu Mù u cho vào bình định mức 20 ml,
làm ấm mẫu 60 oC trong 10 phút, thêm 12 ml methanol hoặc acetonitril, siêu âm 15
phút, điền đến vạch, thu được dung dịch thử, lọc qua màng lọc 0,45 µm và triển khai
HPLC với các điều kiện dự kiến như trình bày ở Mục 3.2.1.2.
Chọn dung môi chiết cho SKĐ có độ phân giải (Rs) giữa pic calophyllolid > 1,5; ít pic
tạp, đường nền ổn định.
- Chiết cắn courmarin toàn phần: chọn dung môi chiết ở thử nghiệm trên để chiết
coumarin toàn phần từ Dầu Mù u.
Cân chính xác khoảng 2 g dầu Mù u, thêm 15 ml methanol, khuấy từ 10 phút có gia
nhiệt 60 oC (x 3 lần). Để nguội, lọc lấy dịch cồn. Gộp chung các dịch chiết, thu hồi
dung môi đến cắn.
Hoà tan cắn với 1,5 ml natri carbonat 10%, chuyển toàn bộ lớp natri carbonat vào bình

lắng 60 ml, chiết tiếp với 10 ml ether ethylic (x 3 lần). Để yên cho tách lớp, rút và gộp
chung các dịch ether ethylic, rửa bằng nước cất đến trung tính. Thu hồi dung môi đến
cắn courmarin toàn phần.
- Xử lý mẫu coumarin bằng kỹ thuật SPE:
- Cột SPE C18-E (Agilent).
- Tiến hành: cho toàn bộ lượng cắn courmarin thu được qua SPE. Dung môi rửa
giải được khảo sát lần lượt có độ phân cực kém dần từ nước (điều chỉnh pH) phối hợp
với acetonitril hoặc methanol. Dịch rửa giải thu được từ các phân đoạn (PĐ) sau SPE
được tiêm vào hệ thống HPLC với các điều kiện dự kiến như trình bày ở Mục 3.2.1.2.
Trên các SKĐ HPLC thu được, lựa chọn PĐ rửa giải được > 98% calophylloid.
Từ các dữ liệu thực nghiệm, hoàn chỉnh quy trình xử lý mẫu dầu Mù u để phân tích
định tính và định lượng calophyllolid bằng phương pháp HPLC.
Khảo sát các điều kiện sắc ký
Khảo sát các điều kiện sắc ký như sau:
- Thành phần và pH pha động: methanol và acetonitril được phối hợp với nước hoặc
dung dịch acid ở các tỷ lệ phù hợp cho sự tách và độ cân đối của pic calophyllolid đạt
yêu cầu.
- Kỹ thuật rửa giải: sau khi lựa chọn được các điều kiện sắc ký cho SKĐ đạt yêu cầu
về độ phân giải, tiến hành khảo sát thêm hai kỹ thuật rửa giải đẳng dòng và chương
Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


15

Phương pháp nghiên cứu

trình dung môi để chọn điều kiện sắc ký cho thời gian phân tích phù hợp với mẫu thử
có nền mẫu phức tạp như Dầu Mù u.

Điều kiện sắc ký kiến nghị:
Cột sắc ký: Inerstil C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm)
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
Nhiệt độ cột 40 oC
Bộ phận phát hiện: detector PDA
Bước sóng phát hiện: 234 nm
Pha động: methanol – acid acetic pH 3,0 (70 : 30)

2.2.2 Khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình phân tích
Tiến hành sắc ký trên 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện.
Yêu cầu: RSD% của thời gian lưu và diện tích của pic calophyllolid ≤ 2%; hệ số AF từ
0,8 ≤ AF ≤ 1,5 và độ phân giải giữa các pic calophyllolid và các pic lân cận Rs ≥ 1,5.

2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích
Tính đặc hiệu: tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử.
- SKĐ mẫu trắng không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng
trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu.
- SKĐ mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với SKĐ mẫu đối chiếu.
- Độ tinh khiết pic của pic cần định lượng trong mẫu thử phải đạt yêu cầu theo cách
xác định độ tinh khiết pic tính từ phần mềm của hệ thống.
Tính tuyến tính: pha chế các dung dịch đối chiếu calophyllolid có nồng độ tăng dần
trong khoảng 50% đến 150% so với nồng độ 100% trong mẫu thử.
Tiến hành sắc ký, ghi nhận diện tích pic.
Sử dụng phân tích hồi qui “Regression” trong Ms - excel với trắc nghiệm F để kiểm tra
tính thích hợp của phương trình hồi qui ŷ = Ax + B và trắc nghiệm t để kiểm tra ý
nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi qui.
Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ ở khoảng nồng độ
khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995.

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


Phương pháp nghiên cứu

16

Độ chính xác:
- Độ lặp lại: thực hiện định lượng trên 6 mẫu thử khác nhau ở nồng độ 100 % chất cần
phân tích có trong mẫu thử. Mỗi mẫu định lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình.
- Độ chính xác trung gian: triển khai sắc ký trên 6 mẫu ở các ngày khác nhau hoặc trên
hai hệ thống sắc ký. Mỗi mẫu định lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình.
Yêu cầu: RSD % giữa các kết quả định lượng phải ≤ 2,0%
Độ đúng: thêm vào mẫu thử một lượng chất đối chiếu tương ứng với 50 %, 100 % và
150 % của nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu thử.
Tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ thực hiện lặp lại trên 3 mẫu.
Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 98 – 102%.

Hình 2.3. Hình minh họa quá trình “Thẩm định quy trình phân tích”
Khi các kết quả thực nghiệm chứng minh quy trình đạt các yêu cầu về thẩm định, tiến
hành xác định hàm lượng của calophyllolid trong mẫu dầu theo công thức:

Trong đó:
- St, Sc: lần lượt là diện tích pic của

- C%: hàm lượng % của chất đối chiếu

mẫu thử, chất đối chiếu

- mt: khối lượng cân mẫu thử (g)

- Cc: nồng độ chất đối chiếu (µg/ml)
Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


17

Kết quả nghiên cứu

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT CALOPHYLLOLID TỪ
DẦU MÙ U
3.1.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết calophylloid từ dầu Mù U
Thử nghiệm khảo sát dung môi chiết được thực hiện bằng SKLM và HPLC.
Mẫu thử: cân 0,5 g dầu cho vào bình định mức 10 ml, cho 5 ml acetonitril hoặc
methanol, siêu âm trong 10 phút. Điền đầy dung môi đến vạch, lắc đều, lọc qua màng
lọc 0,45 µm.
Mẫu chuẩn: calophyllolid
Hệ dung môi: Benzen – ethyl acetat (80 : 20), Phát hiện: đèn UV 254 và 365 nm.

SKĐ HPLC chiết bằng acetonitril

SKĐ tại 254 nm

SKĐ tại 365 nm

C: calophyllolid đối chiếu
MeOH: mẫu thử chiết bằng methanol

SKĐ HPLC mẫu thử chiết methanol

ACN: mẫu thử chiết bằng acetonitril
Rfcalo chuẩn (0,518) ≈ Rf calo thử (0,520)
Hình 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết calophyllolid từ dầu Mù u
Nhận xét: trên các SKĐ SKLM và SKĐ HPLC đều chứng tỏ có thể chọn methanol làm
dung môi chiết calophylloid từ dầu Mù u.

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


18

Kết quả nghiên cứu

3.1.2 Chiết cắn courmarin từ dầu Mù u
Cho toàn bộ lượng cắn coumarin chiết từ dầu Mù u (theo Mục 2.2.1) vào bình định
mức 10 ml, hoà tan bằng methanol đến vạch (dịch thử DT1), siêu âm 10 phút.
Lấy chính xác 500 µl dịch thử DT1 cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung methanol đến
vạch, thu được dịch thử DT2. Tiếp tục pha loãng 10 lần thu được dung dịch thử có
nồng độ khoảng 20 µg/ml. Lọc qua màng lọc milipore 0,45 µm.

Tỉ lệ 65 : 35

Tỉ lệ 70 : 30

Tỉ lệ 75 : 25

Tỉ lệ 80 : 20

Hình 3.2. SKĐ mẫu thử Dầu Mù u với phương pháp chiết cắn courmarin qua các tỉ lệ
dung môi methanol – nước
Nhận xét: các SKĐ Hình 4.2 cho thấy pic calophylloid chưa đạt độ tinh khiết tại thời
gian lưu, mẫu phân tích cần được xử lý để loại bớt các tạp.

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Nguyễn Hoàng Thảo My


19

Kết quả nghiên cứu

3.1.3 Xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)
- Mẫu thử: cắn coumarin chiết từ dầu Mù u
Tiến hành rửa giải với các dung môi tương ứng với các phân đoạn (PĐ) sau:
PĐ1: nước (1,5 ml x 3 lần).
PĐ2 đến PĐ11: 10 ml hỗn hợp methanol – nước theo tỉ lệ tăng dần methanol từ
10% đến 100% (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% và 100%).
Dịch rửa giải của 11 PĐ được kiểm tra bằng SKLM để xác định các PĐ có
calophylloid. Các SKĐ SKLM cho nhận xét:
- Các PĐ 1 đến 6 (tỷ lệ methanol từ 0% đến 50%) không chiết được calophyllolid.
- Từ PĐ 7  10: chiết được calophyllolid.
- PĐ 11 (100% methanol) bắt đầu xuất hiện các vết tạp.

- Tỷ lệ phục hồi sau khi xử lý qua SPE được thực hiện trên mẫu đối chiếu:
Dựa trên diện tích mẫu chuẩn calophyllolid trước và sau khi xử lý qua SPE, tỷ lệ phục
hồi đạt được là 99,43%. (S pic calophyllolid chưa qua xử lý SPE = 4520858, S pic sau
khi xử lý qua SPE = 4495164)

Mẫu chuẩn chưa qua SPE

Mẫu chuẩn đã qua SPE theo quy trình

Hình 3.3. Mẫu chuẩn trước và sau khi xử lý qua SPE.

Hình 3.4. SKĐ mẫu dầu Mù u chưa xử
lý qua SPE

Định lượng calophyllolid trong dầu Mù u bằng HPLC

Hình 3.5. SKĐ mẫu dầu Mù u đã xử lý
qua SPE methanol 90%

Nguyễn Hoàng Thảo My