Nghiên cứu các dạng đột biến gen gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-hydroxylase

L I CAM OAN
Tôi là V Chí D ng, nghiên c u sinh khóa 29 Tr

ng

i h c Y Hà N i,

chuyên ngành Nhi, xin cam đoan:
ây là lu n án do b n thân tôi tr c ti p th c hi n d

1.

c a các Th y:

is h

ng d n

Giáo s . Ti n s . T Thành V n
Giáo s . Ti n s . Nguy n Thanh Liêm

2. Công trình này không trùng l p v i b t k nghiên c u nào khác đã
đ

c công b t i Vi t Nam.

3. Các s li u và thông tin nghiên c u là hoàn toàn chính xác, trung th c và
khách quan, đã đ

c xác nh n và ch p thu n c a c s n i nghiên c u.

Tôi xin hoàn toàn ch u trách nhi m tr

c pháp lu t v nh ng cam k t này.

Hà n i, ngày 25/3/2017

V Chí D ng


M CL C
L IC M

N

L I CAM OAN
M CL C
DANH M C CÁC CH

VI T T T

DANH M C B NG, HÌNH VÀ BI U
TV N
Ch

.................................................................................................. 1

ng 1 T NG QUAN ................................................................................ 4

1.1. L ch s mô t b nh t ng s n th
1.2.

ng th n b m sinh ............................... 4

nh ngh a, c s hóa sinh, sinh lý b nh h c c a t ng s n th

ng th n

b m sinh thi u 21-OH .................................................................................... 5
1.2.1.

nh ngh a TSTTBS và các enzym tham gia t ng h p cortisol ...... 5

1.2.2. C s hóa sinh c a TSTTBS ............................................................ 5
1.2.3. Sinh lý b nh c a TSTTBS do thi u 21-OH ..................................... 7
1.3. Ki u hình lâm sàng và t l m i m c c a TSTTBS do thi u 21-OH ... 11
1.3.1. Ki u hình lâm sàng c a TSTTBS do thi u 21-OH ........................ 11
1.3.2. T l m i m c c a thi u 21-OH ..................................................... 14
1.4. C s di truy n phân t c a b nh TSTTBS do thi u 21-OH ............... 15
1.4.1. Gen CYP21A2 và c u trúc RCCX (RP-C4-CYP21-TNX) ............ 15
1.4.2. L ch s nghiên c u v di truy n phân t c a b nh TSTTBS trên th
gi i ............................................................................................................ 16
1.5. Các đ t bi n c a gen CYP21A2 gây thi u 21-OH ................................ 19
1.5.1. Các đ t bi n xóa đo n và hoán v l n c a gen............................... 21
1.5.2. Các đ t bi n vô ngh a và đ t bi n gây l ch khung d ch mã
(nonsense và frameshift mutations) ......................................................... 23
1.5.3. Các đ t bi n đi m ph bi n khác ................................................... 24
1.5.4. Các đ t bi n hi m g p .................................................................... 26


1.6. Các ti n b k thu t c a phân tích phân t phát hi n các đ t bi n gen

CYP21A2 ...................................................................................................... 26
1.6.1. Phân tích các đ t bi n xóa đo n và hoán v l n c a gen ............... 26
1.6.2. Các ti n b v phát hi n các đ t bi n đi m và các bi n đ i nh ph
bi n và hi m g p c a gen CYP21A2 ........................................................ 29
1.7. Nghiên c u v vai trò c a phân tích đ t bi n gen CYP21A2 ............... 32
1.7.1. D báo ki u hình ............................................................................ 32
1.7.2. Tính ph c t p c a t v n di truy n đ i v i thi u 21-OH ............... 35
1.7.3. Vai trò c a di truy n phân t đ i v i ch

ng trình sàng l c s sinh

TSTTBS.................................................................................................... 36
1.7.4. Ch n đoán và đi u tr tr

c sinh

nh ng gia đình có nguy c cao

thi u 21-OH .............................................................................................. 37
1.8. Nghiên c u v di truy n phân t trên các b nh nhân TSTTBS

Vi t

Nam .............................................................................................................. 39
Ch

ng 2

2.1.

it

IT

NG VÀ PH

NG PHÁP NGHIểN C U .............. 41

ng nghiên c u ........................................................................... 41

2.1.1. Tiêu chu n ch n b nh nhân............................................................ 41
2.1.2. Tiêu chu n lo i tr ......................................................................... 41
2.2. Trang thi t b , d ng c và hóa ch t s d ng cho phát hi n đ t bi n gen
CYP21A2 ...................................................................................................... 42
2.2.1. Trang thi t b nghiên c u ............................................................... 42
2.2.2. D ng c nghiên c u ....................................................................... 42
2.2.3. Hóa ch t nghiên c u ....................................................................... 42
2.3. Ph

ng pháp nghiên c u ...................................................................... 43

2.3.1. Thu th p và tách chi t m u nghiên c u ......................................... 45
2.3.2. Xác đ nh đ t bi n gen CYP21A2 .................................................... 47
2.3.3. Nh n đ nh và đánh giá các đ t bi n c a gen CYP21A2 ................. 53


2.3.4. ánh giá ki u hình c a các b nh nhân và m i t

ng quan gi a ki u

gen - ki u hình ......................................................................................... 54
2.3.5. X lý s li u th ng kê .................................................................... 57
2.4.
Ch

o đ c trong nghiên c u .................................................................... 57
ng 3. K T QU .................................................................................... 59

3.1. K t qu xác đ nh đ t bi n gen CYP21A2 và b n đ đ t bi n gen
CYP21A2 c a b nh nhân TSTTBS th thi u 21-OH ................................... 59
3.1.1.

c đi m chung c a nhóm nghiên c u .......................................... 59

3.1.2. K t qu xác đ nh đ t bi n gen CYP21A2 ....................................... 61
3.2. M i t

ng quan gi a ki u gen và ki u hình c a b nh nhân TSTTBS

thi u 21-OH ................................................................................................. 77
3.2.1. Ki u hình c a các nhóm ki u gen khác nhau và giá tr d báo
d

ng tính ................................................................................................ 77

3.2.2. Ki u gen ph bi n c a các ki u hình khác nhau ............................ 82
3.2.3. T

ng quan ki u gen - ki u hình c a m t s đ t bi n đi m ph

bi n ........................................................................................................... 82
3.2.4. Tri u ch ng lâm sàng và hóa sinh c a các b nh nhân không phù
h p gi a ki u gen và ki u hình ................................................................ 83
3.2.5. Ki u hình c a các b nh nhân có đ t bi n m i c a gen CYP21A2 . 85
3.2.6. Ki u hình c a nh ng b nh nhân có ki u gen g m h n 2 đ t bi n. 86
3.2.7. Ki u gen và ki u hình c a các b nh nhân thi u 21-OH có kh i u v
th

ng th n ............................................................................................... 87

3.2.8. Ki u gen - ki u hình th c đi n MM c a các b nh nhân đ

c ch n

đoán s m < 5 ngày tu i khi ch a có tri u ch ng m t mu i..................... 89
3.2.9. T

ng quan gi a m c đ n ng nam hóa Prader v i ki u gen ....... 91

3.2.10. T

ng quan gi a m c đ m t mu i và t ng kali v i ki u gen .... 92


3.2.11. T

ng quan gi a m c đ t ng c a n ng đ trong huy t thanh c a

17-OHP, testosterone và progesterone v i ki u gen ................................ 93
3.2.12. Minh h a ph h và nh c a các b nh nhân nghiên c u .............. 95

Ch

ng 4. BÀN LU N ............................................................................... 104

4.1. Các đ t bi n và b n đ đ t bi n gen CYP21A2

các b nh nhân nghiên

c u.............................................................................................................. 105
4.1.1.

t bi n xóa đo n l n c a gen CYP21A2

các b nh nhân nghiên

c u .......................................................................................................... 108
4.1.2. Các đ t bi n đi m ph bi n có ngu n g c t CYP21A1P

các b nh

nhân nghiên c u ..................................................................................... 109
4.1.3. Các đ t bi n hi m phát sinh t i gen CYP21A2 và không do hoán v
gen

các b nh nhân nghiên c u ........................................................... 115

4.1.4. Các đ t bi n m i c a gen CYP21A2

các b nh nhân nghiên c u

................................................................................................................ 121
4.2. Ki u gen c a các b nh nhân thi u 21-OH .......................................... 122
4.3. T

ng quan ki u gen - ki u hình ........................................................ 127

4.3.1. Ki u hình c a các b nh nhân thi u 21-OH .................................. 127
4.3.2. T

ng quan ki u gen - ki u hình c a thi u 21-OH

các b nh nhân

nghiên c u .............................................................................................. 128
4.3.3. Ki u gen và ki u hình c a các b nh nhân TSTTBS có u v th

ng

th n ......................................................................................................... 134
4.3.4. T

ng quan gi a ki u gen và m c đ nam hóa Prader

4.3.5. T

ng quan gi a ki u gen và n ng đ 17-OHP huy t thanh ...... 136

tr gái . 135

4.4. Giá tr c a phân tích đ t bi n gen CYP21A2 trong th c hành lâm sàng

.................................................................................................................... 136
4.4.1. D báo ki u hình d a trên ki u gen ............................................. 136


4.4.2. D báo ki u hình

các b nh nhân đ

tri u ch ng lâm sàng và trong đi u tr tr

c ch n đoán s m khi ch a có
c sinh .................................. 138

K T LU N .................................................................................................. 141
KI N NGH VÀ H

NG NGHIÊN C U TI P THEO

DANH M C CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG B
QUAN

N

TÀI LU N ÁN

TÀI LI U THAM KH O
PH L C

V

N I DUNG LIÊN


DANH M C CÁC CH
Ch vi t t t

VI T T T

Ti ng Anh

17-OHP

17-hydroxyprogesterone

21-OH

21-hydroxylase

ABS

Antley-Bixler syndrome

AD

Androstenedione

ACTH

Adrenocorticotroph hormone

Ti ng Vi t

H i ch ng Antley-Bixler

Hormon
th

kích

thích

v

ng th n

AMH

Anti-Mullerian hormone

Hormon kháng Muller

ARMS

Allele-specific PCR

Ph n

amplification

đ c bi t

ASOs

Allele-specific oligonucleotides

Các oligo allele đ c bi t

cDNA

Complementary DNA

DNA b xung

cffDNA

Cell-free fetal DNA

DNA t do c a thai nhi

CRH

Corticotropin releasing

Hormon

gi i

hormone

hormon h

ng v

ng nhân b n allele

phóng
th

ng

th n
t bi n xóa đo n l n

Del

Deletion

DHEA

Dehydroepiandrosterone

DHEAS

Dehydroepiandrosterone sulfate

DHPLC

Denaturing high pressure liquid

S c ký l ng cao áp bi n

chromatography

tính

DHT

Dihydrotestosterone

DNA

Deoxyribonucleic acid

DOC

11-deoxycorticosterone

ELISA

enzyme-linked immunosorbent

Mi n d ch enzym


assay
FSH

Follicle stimulating hormone

Hormon kích thích nang

tr ng

HGMD

Human gene mutation database

D li u đ t bi n gen ng

HLA

Human leukocyte antigens

Kháng nguyên b ch c u
ng

I2g

IVS2-13A/C>G

kb

kilobase

LDL

Low-density lipoprotein

i

i

t bi n trên intron 2

Lipoprotein tr ng l

ng

th p
LDR

Ligation detection reaction

Ph n ng phát hi n n i

LH

Luteinizing hormone

Hormon kích thích th
vàng

MHC

Major histocompatibility

Ph c h p t

ng thích mô

chính
MLPA

Multiplex ligation-dependent

K thu t khu ch đ i đ u dò

probe amplification

đa m i d a vào ph n ng
n i

MM

Salt wasting

M t mu i

NH T

Siple virilizing

Nam hóa đ n thu n

NST
OMIM

Nhi m s c th
Online Mendelian Inheritance in C s d li u c a d án di
ng

man

truy n Mendel

i

PCR

Polymerase chain reaction

Ph n ng khuy ch đ i chu i

PPV

Positive predictive value

Giá tr d báo d

RCCX

RP-C4-CYP21-TNX

Trình t s p x p c a 4 gen

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

ng tính

SNP

Single nucleotide

a hình nucleotide đ n

polymorphism
STAR

Steroidogenic acute regulatory Protein đi u hoàn s n xu t
protein

steroid c p tính

T

Testosterone

TMC

Tandem mass spectrometry

Ph kh i r ng

TSTTBS

Congenital adrenal hyperplasia

T ng s n th
sinh

ng th n b m


DANH M C B NG, HÌNH VÀ BI U
B ng 1.1. Các th b nh TSTTBS và thi u h t t ng h p cortisol do thi u
enzym v th

ng th n .................................................................................... 10

B ng 1.2. Bi u hi n lâm sàng c a b nh nhân TSTTBS thi u 21-OH ........... 14
B ng 1.3. Các đ t bi n ph bi n

CYP21A2 gây thi u 21-OH ..................... 20

B ng 1.4. Bi u hi n nam hoá b ph n sinh d c ngoài theo m c đ n ng c a
Prader (0-V) c a t ng nhóm ki u gen ............................................................. 33
B ng 2.1. Trình t m i dùng cho ph n ng PCR và gi i trình t gen ............ 48
B ng 2.2. Tên, kích th

c và v trí c a các s n ph m PCR trong Kit MLPA

P050B2 (MRC- Holland) ................................................................................ 51
B ng 3.1.

c đi m chung c a nhóm nghiên c u .......................................... 60

B ng 3.2. T n s và t l các đ t bi n c a gen CYP21A2 .............................. 71

B ng 3.3. Ki u gen c a 202 b nh nhân TSTTBS thi u 21-OH ...................... 73
B ng 3.4. Ki u gen - ki u hình c a b nh nhân TSTTBS có ki u gen thu c
nhóm “null”, A, B và C ................................................................................... 78
B ng 3.5. Ki u gen và ki u hình c a các b nh nhân có ki u gen thu c nhóm D
......................................................................................................................... 81
B ng 3.6. Tri u ch ng lâm sàng và hóa sinh c a các b nh nhân không phù
h p gi a ki u gen - ki u hình.......................................................................... 84
B ng 3.7: Ki u hình (tri u ch ng lâm sàng và hóa sinh) c a các b nh nhân có
đ t bi n m i c a gen CYP21A2 ...................................................................... 85
B ng 3.8. Ki u gen và ki u hình c a b nh nhân có ki u gen ph c t p .......... 86
B ng 3.9. Ki u gen và ki u hình c a các b nh nhân có u v th

ng th n khi

ch n đoán ho c xu t hi n u trong quá trình đi u tr ........................................ 88
B ng 3.10. Ki u gen và di n bi n lâm sàng c a các b nh nhân ki u hình MM
đ

c ch n đoán s m khi ch a có suy th

ng th n c p .................................. 89


B ng 3.11. N ng đ đi n gi i đ huy t thanh c a các nhóm ki u gen ........... 92
B ng 3.12. N ng đ trong huy t thanh c a 17-OHP, testosterone và
progesterone c a các nhóm ki u gen khác nhau ............................................. 93
B ng 4.1: T n su t c a các đ t bi n trong các nghiên c u khác nhau ......... 112
B ng 4.2: Giá tr d báo ki u hình d
nhau

ng tính c a các nhóm ki u gen khác

m t s nghiên c u ............................................................................. 137

Hình 1.1. A) T ng h p steroid th
B) T ng h p steroid trong tr

ng th n

thai nhi bình th

ng. ................ 8

ng h p thi u 21-OH ......................................... 8

Hình 1.2. Các ph n ng xúc tác b i P45021A2 ................................................ 9
Hình 1.3. Vùng nhi m s c th 6p21.3 bao g m gen CYP21A2 c a c u trúc
RCCX module ................................................................................................. 16
Hình 1.4. CYP21A2 và CYP21A1P ................................................................. 21
Hình 1.5. Hi n t

ng tái c u trúc gen CYP21A2 ............................................ 22

Hình 1.6. Xóa đo n c a gen CYP21A2 ........................................................... 23
Hình 1.7. Ho t đ enzym theo các nghiên c u in vitro c a gen CYP21A2 .... 33
Hình 2.1. S đ thi t k nghiên c u................................................................ 45
Hình 2.2. V trí các m i s d ng cho PCR và gi i trình t gen ...................... 47
Hình 2.3. Các giai đo n c a k thu t MLPA ................................................. 49
Hình 2.4. S đ và v trí m t s probe c a Kit MLPA P050B2 ..................... 51
Hình 2.5. Hình nh minh h a k t qu MLPA ................................................. 52

Hình 3.1. Hình nh xóa đo n exon 1-3 (exon 1-3 del) gen CYP21A2 ............ 61
Hình 3.2. Hình nh xóa đo n t gen C4B đ n exon 8 c a gen CYP21A2 ...... 62
Hình 3.3. Hình nh s n ph m PCR khuy ch đ i gen CYP21A2 ..................... 64
Hình 3.4. Hình nh đ t bi n đ ng h p t g.655A/C>G.................................. 65
Hình 3.5. Hình nh đ t bi n d h p t p.I172N và p.R426C k t h p ............. 65
Hình 3.6. Hình nh đ t bi n đ ng h p t p.Q318X và p.R356W .................. 66


Hình 3.7. Hình nh đ t bi n d h p t p.Q318X và đ ng h p t p.R356W... 66
Hình 3.8. Hình nh 3 đ t bi n d h p t g.655A/C>G, p.Q318X và p.R356W
......................................................................................................................... 67
Hình 3.9. Hình nh đ t bi n p.I236N, p.V237E, p.M239K cluster E6 .......... 68
Hình 3.10. Hình nh đ t bi n l p đo n p.P459_L464dup .............................. 69
Hình 3.11. Hình nh đ t bi n d h p t p.Y112X và p.I172N ....................... 69
Hình 3.12. B n đ v trí đ t bi n gen CYP21A2 gây b nh TSTTBS thi u 21OH

các b nh nhân nghiên c u ..................................................................... 76

Hình 3.13. Ph h gia đình có 4 con m c th c đi n MM do đ t bi n đ ng
h p t xóa đo n toàn b gen CYP21A2 .......................................................... 95
Hình 3.14. Ph h gia đình có 2 con m c th NH T do đ t bi n đ ng h p t
p.I172N/p.I172N ............................................................................................. 95
Hình 3.15. Ki u hình b ph n sinh d c ngoài th MM c a b nh nhân n s
192 có ki u gen xóa đo n đ ng h p t toàn b gen CYP21A2 (Del/Del). ..... 96
Hình 3.16. Ki u hình b ph n sinh d c ngoài th MM c a b nh nhân n s
167 có ki u gen d h p t kép xóa đo n toàn b gen CYP21A2 và đ t bi n ph
bi n nhóm A (I2g). .......................................................................................... 96
Hình 3.17. Ki u hình b ph n sinh d c ngoài th MM c a b nh nhân n s
132 có ki u gen đ ng h p t nhóm “null” p.R356W/p.R356W. .................... 97
Hình 3.18. Ki u hình b ph n sinh d c ngoài th MM c a b nh nhân n s

160 có ki u gen d h p t kép m t allele xóa đo n toàn b gen CYP21A2 và
m t allele đ t bi n đi m n ng và hi m g p .................................................... 97
Hình 3.19. Ki u hình b ph n sinh d c ngoài th MM c a b nh nhân n s
119 có ki u gen mang 3 đ t bi n khác nhau ................................................... 98
Hình 3.20. Ki u hình b ph n sinh d c ngoài th MM

b nh nhân n s 131

có ki u gen ph c t p nhóm “null”................................................................... 98


Hình 3.21. Ki u hình th MM c a b nh nhân nam s 173 có ki u gen d h p
t kép m t allele xóa đo n toàn b gen CYP21A2 (nhóm “null”) và m t allele
đ t bi n ph bi n nhóm A ............................................................................... 99
Hình 3.22. Ki u hình th MM c a b nh nhân nam s 177 có ki u gen d h p
t kép hai đ t bi n hi m và n ng .................................................................... 99
Hình 3.23. Ki u hình lúc 5,4 tu i có d y thì s m c a b nh nhân nam s 149
có ki u gen đ ng h p t đ t bi n nhóm “null”. ............................................ 100
Hình 3.24. Ki u hình NH T c a b nh nhân n s 165 có ki u gen đ t bi n
đ ng h p t nhóm B ...................................................................................... 100
Hình 3.25. Ki u hình th c đi n NH T c a b nh nhân n s 172 có ki u gen
ch phát hi n đ

c 1 allele đ t bi n trên intron 2 ......................................... 101

Hình 3.26. Ki u hình NH T c a b nh nhân nam s 158 có ki u gen d h p t
kép m t allele xóa đo n toàn b gen CYP21A2 và m t allele khác là đ t bi n
nhóm B .......................................................................................................... 101
Hình 3.27. Ki u gen, ki u hình c a b nh nhân n s 191 m c th không c
đi n có mang allele đ t bi n p.P30L và m t allele đ t bi n m i l p đo n. .. 102

Hình 3.28. Ki u hình nam hóa c a b nh nhân n s 189 m c th c đi n
NH T có ki u gen nhóm “null” ................................................................... 103
Hình 3.29. Ki u hình NH T c a b nh nhân nam s 150 có ki u gen không
phù h p v i ki u hình là đ t bi n đ ng h p t nhóm A ............................... 103
Bi u đ 3.1. Phân b t n su t theo các d ng đ t bi n gen CYP21A2 ............. 71
Bi u đ 3.2. Ki u hình c a các ki u gen thu c nhóm “null” .......................... 79
Bi u đ 3.3. Ki u hình c a các ki u gen thu c nhóm A................................. 80
Bi u đ 3.4. Ki u hình c a các ki u gen thu c nhóm B. ................................ 80
Bi u đ 3.5. Ki u hình c a các ki u gen có ít nh t 1 trong 3 đ t bi n đi m ph
bi n. ................................................................................................................. 83


Bi u đ 3.6. T l (%) c a các m c đ nam hóa theo phân lo i Prader c a
t ng nhóm ki u gen khác nhau ....................................................................... 91
Bi u đ 3.7. N ng đ 17-OHP huy t thanh c a các b nh nhân có các nhóm
ki u gen khác nhau. ......................................................................................... 94


1

TV N
T ng s n th

ng th n b m sinh (TSTTBS) (Congenital adrenal

hyperplasia - CAH) là m t nhóm các b nh di truy n l n nhi m s c th th

ng

do thi u m t trong các enzym c n thi t cho quá trình t ng h p cortisol t

cholesterol c a v th

ng th n. Kho ng 95% các tr

ng h p là do thi u h t

21-hydroxylase (21-OH) d n đ n thi u cortisol kèm theo (ho c không) thi u
h t aldosterone và t ng ti t androgen th
b nh đ

ng th n. Bi u hi n lâm sàng c a

c chia ra thành hai th là th n ng (th c đi n) và th nh h n

(không c đi n). Th c đi n có t l m i m c là 1:10 000 ÷ 1:16 000 tr đ
s ng đ i v i h u h t các ch ng t c và bao g m th m t mu i (MM) và th
nam hóa đ n thu n (NH T) 1,2,3.
Nh ng ti n b c a khoa h c đã giúp chúng ta hi u bi t và đ t đ

c

nh ng thành t u quan tr ng v ch n đoán và đi u tr TSTTBS. T mô t lâm
sàng đ u tiên c a De Crecchio v m t b nh nhân n m c TSTTBS (1865),
ti p theo là các m c quan tr ng bao g m đi u tr n i khoa đ u tiên đ

c ti n

hành b i Wilkins và c ng s (1950). Các phân tích di truy n đ u tiên đ

c

ti n hành b i Levine và c ng s b ng phân tích liên k t HLA halotype (1978),
t i vi c xác đ nh h u h t các gen mã hóa cho các enzym t ng h p steroid vào
nh ng n m 1980 2,4,5,6. Phân tích di truy n gen CYP21A2 mã hóa cho
21-OH là ph

ng pháp chu n m c đ góp ph n ch n đoán, đi u tr và phòng

b nh. Các ti n b v phân tích di truy n không nh ng giúp c i thi n kh n ng
ch n đoán các th nh nh t c a b nh mà còn cho phép hi u bi t rõ h n v
t

ng quan ki u gen - ki u hình trong b nh TSTTBS. Ti n b h n n a là vi c

phân tích gen CYP21A2 s d ng b nh ph m là các gi t máu th m khô t các
đ a c a gi y th m trong ch
b

ng trình sàng l c s sinh, nh là xét nghi m

c 2 đ t ng tính tin c y và gi m t l d

ng tính gi . Ch n đoán và đi u tr


2

tr

c sinh cho các gia đình có nguy c m c th c đi n c a b nh c n đ

hành ch đ ng mang ý ngh a d phòng. Nh ng khía c nh nêu trên đ
c u r ng rãi nhi u n

đ

c xác đ nh do t l

c sàng l c s sinh. Nh ng b nh nhân đ u tiên m c TSTTBS

c ch n đoán t đ u nh ng n m 1980, và s l

ng b nh nhân t ng lên rõ

r t do m i n m có kho ng t 40 - 60 b nh nhân m i đ
vi n Nhi Trung
s l

c nghiên

c trên th gi i t h n 30 n m nay 7,8,9,10,11.

Vi t Nam, t l m i m c c a TSTTBS ch a đ
th p các tr đ

c ti n

c ch n đoán t i B nh

ng. ây c ng là m t trong các trung tâm hi n đang qu n lý

ng l n nh t các b nh nhân m c TSTTBS trên th gi i. Trong s 842 b nh

nhân đ

c ch n đoán và đi u tr trong 17 n m (1999-2016) thì th thi u 21-OH

chi m 98,3% (828 b nh nhân); thi u 11 -hydroxylase chi m 1,3% (11 b nh
nhân) và thi u 3 -hydroxysteroid dehydrogenase chi m 0,4% (3 b nh nhân) (V
Chí D ng và c ng s ).
Các nghiên c u v di truy n phân t trong đó có xác đ nh các đ t bi n
c a gen CYP21A2

các b nh nhân Vi t Nam c ng đ

n m 2000, tuy nhiên h n ch ch

c b t đ u t nh ng

ng d ng k thu t PCR đ sàng l c m t s

đ t bi n ph bi n. Các k thu t sinh h c phân t tiên ti n đã b t đ u đ
nghiên c u ng d ng trong ch n đoán tr
nhiên ch a có nghiên c u nào trên s l

c

c sinh và sau sinh TSTTBS. Tuy
ng đ l n các b nh nhân Vi t Nam

m c TSTTBS đ phát hi n các d ng đ t bi n gen và phân b c a các đ t bi n
trên gen CYP21A2, và c ng ch a có nghiên c u nào v ki u gen và t
quan gi a ki u gen - ki u hình c a các b nh nhân TSTTBS v i s l

ng

ng b nh

nhân đ l n. H n n a, vi c phân tích đ t bi n gen gây b nh TSTTBS là c n
thi t trong th c hành lâm sàng đ : i) kh ng đ nh ch n đoán và cho phép đi u
tr s m, phòng tránh đ

c c n suy th

ng th n c p trong các tr

nghi m v hormon không rõ ràng; ii) ch n đoán tr

ng h p xét

c sinh và đi u tr tr

c

sinh cho thai nhi gái m c b nh đ phòng và làm gi m nam hóa gây m h gi i


3

tính sau sinh; iii) xác đ nh ng

i lành mang gen, ph c v t v n di truy n; iv) áp

d ng các li u pháp m i đ t i u hóa đi u tr bao g m vi c quy t đ nh li u
l

ng steroid thay th trên c s m i t

giúp gi m đ

c h u qu

c ch t ng tr

ng quan ki u gen - ki u hình, do đó
ng do quá li u streroid.

Xu t phát t các lý do trên đây, nghiên c u này đ

c ti n hành v i các

m c tiêu sau đây:
M c tiêu 1: Phát hi n các đ t bi n c a gen CYP21A2 và mô t b n đ
đ t bi n gen CYP21A2

các b nh nhân m c t ng s n th

ng th n b m sinh

th thi u 21-OH.

M c tiêu 2: Phân tích m i t
b nh nhân t ng s n th

ng quan gi a ki u gen và ki u hình c a

ng th n b m sinh th thi u 21-OH.


4

Ch

ng 1

T NG QUAN
1.1. L ch s mô t b nh t ng s n th

ng th n b m sinh

B nh nhân đ u tiên có các tri u ch ng lâm sàng c a TSTTBS đ
t trong y v n vào n m 1865 b i nhà gi i ph u ng

c mô

i Ý là Luigi de Crecchio;

ông đã đ c p đ n m t b nh nhân ngo i hình nam, t vong lúc 44 tu i v i các
bi u hi n đ t c p suy th
tuy n th

ng th n Addison. K t qu gi i ph u b nh cho th y

ng th n có kích th

c l n, chi u dài d

ng v t là 10 cm, t t l ti u

th p đ I, không có tinh hoàn, hai bu ng tr ng bình th

ng, có vòi tr ng, có

t cung và âm đ o [1],[2],[3]. K t khi ca b nh đ u tiên này đ
cho đ n nay có h n 5 th b nh TSTTBS đ

c công b

c mô t , trong đó th thi u 21-

OH là ph bi n nh t. Cu c s ng c a các b nh nhân m c TSTTBS đã đ
thi n rõ r t k t khi hydrocortisone đ

cc i

c s d ng trong đi u tr m t cách có

hi u qu vào nh ng n m 1950 [4]. Nh ng n m sau đó c a cùng th p k thì
vi c đi u tr thay th b ng mineralocorticoid c ng đ

c áp d ng và ti p t c

c i thi n k t qu đi u tr [5]. Vi c làm sáng t c s phân t c a b nh lý di
truy n đ n gen này vào nh ng n m 1980 và 1990, c ng nh phát tri n các k
thu t và quy trình xác đ nh các đ t bi n gây b nh đã là công c trong ch n
đoán c ng nh giúp hi u bi t v sinh lý b nh h c c a b nh. Các phân tích di
truy n c a b nh đ

c ti n hành l n đ u vào nh ng n m 1980 và d a trên c

s v m t liên k t các gen HLA [6]. Trong nh ng n m 1990 thì vi c xác đ nh
nhanh ki u gen c a b nh đ i v i các đ t bi n ph bi n và gi i trình t toàn b
gen CYP21A2 đã đ

c nghiên c u r ng rãi [7],[8]. Vi c ch n đoán b nh đi t

mô t , th m khám lâm sàng đ n xét nghi m các d u n sinh h c và phân tích
phân t . Nh v y, tr i qua h n 60 n m, đ n nay khoa h c đã có nh ng b

c

ti n n i b t v hi u bi t TSTTBS, đ c bi t v di truy n, sinh lý b nh, lâm
sàng, đi u tr và phòng b nh.


5

nh ngh a, c s hóa sinh, sinh lý b nh h c c a t ng s n th

1.2.

ng

th n b m sinh thi u 21-OH
1.2.1.

nh ngh a TSTTBS và các enzym tham gia t ng h p cortisol
T ng s n th

ng th n b m sinh (TSTTBS) (congenital adrenal

hyperplasia - CAH) bao g m m t nhóm các b nh di truy n l n nhi m s c th
th

ng, do khi m khuy t m t ph n ho c hoàn toàn c a m t trong s các
tuy n th

enzym tham gia t ng h p cortisol t cholesterol

ng th n. Ki u

hình lâm sàng và hóa sinh ph thu c vào khi m khuy t enzym đ c hi u và
gi m ho t đ c a enzym đ c hi u.
Các enzym sau đây tham gia t ng h p cortisol v th
(CYP11A1),

P450c17

(CYP17A1),

P450c21

(CYP11B1), 3 HSD (HSD3B2). Ngoài ra ngay
steroid th

b

ng th n: P450scc

(CYP21A2),

P450c11

c đ u tiên c a t ng h p

ng th n, cholesterol đi vào trong ty th là nh m t protein v n

chuy n tên là StAR (steroidogenic acute regulatory protein) (STAR). H n n a,
đ t bi n b t ho t gen POR mã hóa enzym cho đi n t P450 oxidoreductase
c ng gây ra các bi u hi n c a TSTTBS v i các tri u ch ng k t h p c a thi u
P450c17 và P450c21 (hình 1.1 và b ng 1.1) [3],[9],[10],[11]. Thi u h t 21OH (CYP21A2) và 11 -hydroxylase (CYP11B1) ch gây t n th
steroid th

ng t ng h p

ng th n, trong khi thi u 17 -hydroxylase (CYP17A1) và 3 -

hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSD3B2) c ng gây t n th
h p steroid

ng t ng

tuy n sinh d c.

1.2.2. C s hóa sinh c a TSTTBS
Cytochrome P450 là thu t ng chung ch m t nhóm các enzym oxy
hóa, t t c các enzym nhóm này đ u có kho ng 500 axit amin và có m t
nhóm HEME đ n đ c. Các enzym này đ
c đ u h p th ánh sáng

b

c g i là P450 (pigment 450) vì t t

c sóng 450 nm. H gen ng

i bao g m 57

enzym thu c nhóm cytochrome P450. M t vài h th ng danh pháp qu c t đã


6

đ

c đ xu t cho các gen và các enzym nhóm này trong các th p k qua. Hi n

nay, các gen có thu t ng chính th c là các gen CYP và có m t h th ng danh
pháp h p lý cho các enzym và các gen này đã đ

c mô t

( các protein đ

c mã hóa

b i các gen có th có cùng tên nh ng không vi t nghiêng [10].
Sinh t ng h p steroid đ

c b t đ u v i nguyên li u là cholesterol

không ester hóa, m t phân t g m 27 carbon có ngu n g c t lipoprotein
phân t th p (low-density lipoprotein: LDL) l u hành trong tu n hoàn [12].
Cholesterol đ

c v n chuy n t bào t

ng vào màng trong c a ty th thông

qua protein phosphor (steroidogenic acute regulatory protein - StAR) [13].
Enzym tách nhánh bên P450 (CYP450scc) có tên gen là CYP11A1 xúc tác
chuy n cholesterol thành steroid trung gian là pregnenolone b ng cách
hydroxyl hóa carbon 20 và 22 sau đó tách liên k t gi a hai carbon hydroxyl
hóa này [14]. Pregnenolone vì không ph i là c ch t trong ty th nên đi ra
l

i n i bào và t i đây đ

c chuy n thành các steroid đ c hi u ph thu c vào

enzym và các y u t đ ng v n đ c hi u. Tuy n th

ng th n có vai trò thi t

y u cho s s ng s s n xu t ra các steroid t i ph n v . V m t c u trúc mô
h c thì v th

ng th n đ

c chia thành 3 l p riêng bi t: m i l p này l i s

h u ho c b thi u nh ng enzym c n thi t đ t ng h p steroid đ c hi u: l p c u
ngoài cùng khi b thi u 17 -hydroxylase thì chuy n pregnenolone sang h
s n xu t mineralocorticoid 21 carbon là aldosterone. S
hydroxylase

ng

có m t c a 17 -

l p bó (l p gi a) s cho phép s n xu t ra cortisol (bao g m 21

carbon); ho t đ c a 17,20-lyase

l p l

i cho phép s n xu t steroid 19

carbon là dehydroepiandrosterone (DHEA) và testosterone (T) (hình 1.1)
[11]. S n xu t steroid th

ng th n b kích thích b i hormon thùy tr

c tuy n

yên là adrenocorticotroph hormon (ACTH). Hormon gi i phóng hormon
h

ng v th

ng th n (corticotropin releasing hormone - CRH) đ

c s n xu t


7

b i vùng d

i đ i đi u khi n ho t đ ng c a thùy tr

c tuy n yên ti t ACTH

theo nh p [15].
1.2.3. Sinh lý b nh c a TSTTBS do thi u 21-OH
Khi thi u h t enzym đ c hi u t ng h p cortisol thì n ng đ th p c a
vùng d

cortisol kích thích s n xu t quá m c CRH
tuy n yên, và kích thích liên t c tuy n th

i đ i và ACTH c a

ng th n gây t ng sinh c a mô

tuy n. Tu thu c vào enzym nào b thi u h t mà vi c t ng h p các hormon
steroid b t n th

ng khác nhau. H n 95% các b nh nhân TSTTBS là do thi u

steroid 21-hydroxylase (21-OH, OMIM +201910). Steroid 21-hydroxylase
còn có tên P450c21 là m t enzym cytochrome P450 có m t

l

i n i bào.

21-OH xúc tác chuy n 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) thành 11deoxycortisol, m t ti n ch t c a cortisol, và chuy n progesterone thành
deoxycorticosterone, m t ti n ch t c a aldosterone (hình 1.1 và 1.2).
th

ng th n, enzym này hydroxyl hóa steroid

v

v trí 21. Thi u h t 21-OH

gây thi u h t t ng h p cortisol và thêm vào là thi u h t mineralocorticoids
các b nh nhân m c th n ng. Các ti n ch t steroid ngay phía tr

c v trí

enzym b thi u h t (progesterone và 17-OHP) b tích t và chuy n h

ng sang

t ng h p androgen c a th
th

ng th n, d n đ n s n xu t quá m c androgen

ng th n (hình 1.1) [11],[16],[17],[18].


8

Hình 1.1. A) T ng h p steroid th

ng th n

B) T ng h p steroid trong tr
A) 21-OH th
đ

đ

ng th n, P450c21, là enzym thi t y u cho c hai con

ng nh testosterone d

B) trong tr

ng.

ng h p thi u 21-OH

ng t ng h p aldosterone và cortisol. Tuy n th

m tl

thai nhi bình th

ng th n có th t ng h p

i tác d ng c a 17 -HSD.

ng h p thi u ho t đ 21-OH c a P450c21 thì có ba con

ng d n đ n t ng h p androgen: i/ con đ

ng t cholesterol đ n DHEA


9

v n còn ho t đ ng, t ng s n xu t DHEA s d n đ n m t l
chuy n thành testosterone và dihydrotestosterone (DHT). ii/ l
OHP đ

c s n xu t

th

ng DHEA b
ng l n 17-

ng th n b nh nhân TSTTBS s cho phép m t l

ng

17-OHP chuy n thành androstenedione và sau đó thành testosterone. iii/ con
đ

ng ph

thu c vào 5

và 3

reduction c a 17-OHP thành 17OH-

allopregnanolone. Steroid này d dàng đ

c chuy n thành androstanediol, mà

sau đó có th b oxy hóa thành DHT b i enzym 3 -HSD [11].

Hình 1.2. Các ph n ng xúc tác b i P45021A2 (21-hydroxylase) [19]


10

B ng 1.1. Các th b nh TSTTBS và thi u h t t ng h p cortisol do thi u
enzym v th ng th n [3]
Enzym thi u h t Gen/ NST

T l m im c
và ch ng t c

Tri u ch ng
lâm sàng

D u n sinh h c

21-hydroxylase
(P450c21)

CYP21A2/ C đi n 1:16 000
6p21.3
Không c đi n <
1:1000
G p nhi u h n
Ashkenazi Jews,
và Yupik
Eskimos

Suy th ng th n th 17OHP; AD; T
c đi n, nam hóa các
m c đ khác nhau

11 -hydroxylase

(P450c11 )

CYP11B1/ 1:100 000
8q24.3
ch ng t c da
tr ng; 1:7000
Moroccan Jews

T ng huy t áp
h u DOC,
h t các b nh nhân; h 11-deoxycortisol,
kali máu; nam hóa
AD, T

3 hydroxysteroid
dehydrogenase
type 2

HSD3B2/
1p13.1

M t n c, h natri
máu và t ng kali máu.
46,XX: nam hóa
46,XY: nam hóa kém

Pregnenolone,
17OHpregnenolone,
DHEA, DHEAS

17-hydroxylase/
17,20-lyase
(P450c17)

CYP17A1/ 1:50 000 toàn th
10q21gi i, ph bi n
q22
h n Bra-xin và
châu Á

Cao huy t áp, h kali
máu, thi u n ng sinh
d c 46,XX; 46,XY:
nam hóa kém, tinh
hoàn trong b ng

Progesterone,
DOC,
corticosterone;
LH và FSH

Steroidogenic
acute regulatory
protein (StAR)

Cholesterol sidechain cleavage
enzym (P450scc)
Thi u P450oxidoreductase
(POR)

STAR/
8p11.2

Hi m

Hi m, ph bi n
h n Nh t B n,
Palestine,
Hàn Qu c

CYP11A1/ Hi m
15q23q24
POR/
7q11.2

Hi m,
ph bi n h n
Nh t và

Suy th ng th n, Gi m t t c các
th ng th n phì đ i, steroid
th ng th n b thâm
nhi m lipid, c hai
gi i có b ph n sinh
d c ngoài gi ng n
Suy th ng th n, có
th không có tuy n
th ng th n

Gi m t t c các

steroid

Gi m th tích tu n M c đ cao khác
hoàn, d t t x ng nhau, thi u h t
(Antley-Bixler); nam m t ph n nhi u


11

Enzym thi u h t Gen/ NST

T l m im c
và ch ng t c
Hàn Qu c

Tri u ch ng
lâm sàng
hóa m .
46,XX: nam hóa nh
đ n trung bình.
46,XY: nam hóa kém

D u n sinh h c
steroid

DOC, 11-deoxycorticosterone; AD, androstenedione; T, testosterone; DHEA,
dehydroepiandrosterone; DHEAS, DHEA sulfate; LH, luteinizing hormone; FSH, follicle
stimulating hormone.

V m t bào thai h c,

thai nhi gái bình th

ng v ki u gen s không

có hormon kháng th Muller (anti-Mullerian hormon - AMH), và c u trúc
Muller bình th

ng s bi t hóa thành vòi tr ng, t cung, c t cung, 2/3 trên

c a âm đ o.

thai nhi gái bình th

ng c ng không có mô tinh hoàn và

androgen nên c u trúc Wolffian s thoái tri n và các bu ng tr ng s
ti u khung. Trong tr

v trí

ng h p thi u 21-OH thì thai nhi có ki u gen là gái c ng

không có hormon kháng th Muller nên s phát tri n c a c u trúc Muller v n
bình th

ng và bu ng tr ng v n có

v trí ti u khung. Testosterone có th

t ng lên nh ng không ph i có ngu n g c t t bào Leydig c a tinh hoàn mà t
ngu n androgen c a th

ng th n. S tích t các ti n ch t steroid phía tr

enzym b thi u h t (21-OH) s chuy n h

ng sang con đ

c

ng t ng h p

testosterone (hình 1.1) [11]. M c đ r i lo n ch c n ng enzym s quy đ nh
m c đ chuy n h

ng t ng h p này. S phát tri n c a b ph n sinh d c ngoài

nh y c m v i androgene, do v y n ng đ cao c a testosterone trong tu n hoàn
s d n đ n nam hóa b ph n sinh d c ngoài

bào thai gái

các m c đ khác

nhau t I đ n V nh phân lo i c a Prader (ph l c 2) [17].
1.3. Ki u hình lâm sàng và t l m i m c c a TSTTBS do thi u 21-OH
1.3.1. Ki u hình lâm sàng c a TSTTBS do thi u 21-OH
M c đ n ng c a các tri u ch ng lâm sàng khác nhau và ph thu c vào
ho t đ 21-OH còn l i. M c dù ranh gi i khác nhau v bi u hi n ki u hình đôi