PHÂN TÍCH đa HÌNH c188t của GEN CYP2D6 BẰNG kỹ THUẬT RFLP PCR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

GIANG THU NGA

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH C188T CỦA GEN CYP2D6
BẰNG KỸ THUẬT RFLP-PCR TRÊN BỆNH NHÂN
UNG THƯ PHỔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011-2015

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN HUY THỊNH

Hà Nội -2015


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là một bước ngoặt quan trọng đánh dấu giai đoạn
kết thúc của một sinh viên và trở thành một cử nhân y khoa, một nhân viên y
tế. Trong quá trình thực hiện khóa luận em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ
các thầy cô, bạn bè và gia đình.
Em xin thành cảm ơn TS. Trần Huy Thịnh, thầy đã chỉ bảo cho em rất
nhiều về kiến thức và những kinh nghiệm quý giá.
Em xin cảm ơn CN. Lê Hoàng Bích Nga, chị đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ em trong suốt quá thực hiện khóa luận.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm

ơn tới GS-TS Tạ Thành Văn - Giám đốc Trung tâm Gen-Protein, TS. Trần
Vân Khánh Phó- Giám đốc Trung tâm Gen-Protein, Trưởng Bộ môn Bệnh học
Phân tử, thầy cô đã dành nhiều thời gian để chỉ bảo giúp đỡ em từ những
bước đầu trong nghiên cứu khoa học cũng như làm luận văn tốt nghiệp cho
đến những kinh nghiệm cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, phòng Đào Tạo
Đại Học, các thầy cô bộ môn Hóa Sinh, các thầy cô và các anh chị ở trung
tâm nghiên cứu Gen-Protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận
lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện khóa luận.
Và cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ và những người thân trong gia
đình, mọi người đã luôn bên cạnh, ủng hộ dành những điều tốt đẹp nhất để
hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Giang Thu Nga


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
…..***…..

LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi:
- Phòng đào tạo đại học Trường Đại học Y Hà Nội.
- Bộ môn Truyền Nhiễm Trường Đại học Y Hà Nội.
- Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Tên em là: Giang Thu Nga – sinh viên tổ 41 lớp Y4L Trường Đại học Y
Hà Nội, khóa 2011 – 2015.
Em xin cam đoan các số liệu trong khóa luận này là có thật, kết quả hoàn
toàn chính xác, khách quan, trung thực và không sao chép từ bất kỳ tài liệu

nào khác.
Em xin hoàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Giang Thu Nga


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................1
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................3
1.1. Tổng quan về ung thư phổi.....................................................................3
1.1.1. Dịch tễ học.......................................................................................3
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ của bệnh ung thư phổi......................................6
1.1.3 Phân loại, chẩn đoán, tiên lượng và điều trị......................................7
1.2. Sơ lược về gen CYP2D6.........................................................................9
1.2.1. Vị trí và cấu trúc...............................................................................9
1.2.2. Chức năng của enzym CYP2D6.....................................................10
1.2.3. Tính đa hình thái.............................................................................12
1.3. Hiện tượng RFLP và SNP.....................................................................16
1.3.1. Hiện tượng RFLP...........................................................................16
1.3.2. Tính đa hình đơn Nucleotide (SNP)...............................................17
1.4. Phương pháp PCR-RFLP......................................................................18
1.4.1. Nguyên lý phương pháp PCR-RFLP..............................................18
1.4.2. Kỹ thuật PCR..................................................................................18
1.4.3. Enzym cắt giới hạn (RE)................................................................19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............22
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................22
2.1.1. Thời gian và địa điểm.....................................................................22

2.1.2. Đối tượng khảo sát.........................................................................22
2.1.3. Đạo đức trong nghiên cứu..............................................................22
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu....................................22
2.2.1. Dụng cụ và trang bị........................................................................22
2.2.2. Hóa chất dùng trong nghiên cứu....................................................23
2.3. Quy trình kỹ thuật.................................................................................24


2.3.1. Quy trình lấy mẫu...........................................................................24
2.3.2. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi.....................................25
2.3.3. Khuếch đại đoạn gen CYP2D6.......................................................27
2.3.4. Kỹ thuật PCR-RFLP.......................................................................29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU......................................................33
3.1. Kết quả tách chiết DNA........................................................................33
3.2. Kết quả phản ứng PCR.........................................................................35
3.3. Kết quả PCR-RFLP..............................................................................36
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN..............................................................................39
4.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu..................................................................39
4.2. Kết quả tách chiết DNA........................................................................39
4.3. Kết quả khuếch đại gen CYP2D6.........................................................40
4.4. Kết quả PCR-RFLP..............................................................................42
KẾT LUẬN.....................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số SNP của gen CYP2D6..........................................................14
Bảng 1.2 Tần số kiểu gen CYP2D6*10 ở một số dân tộc................................16
Bảng 1.3 Vị trí cắt của một số enzym giới hạn...............................................20
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch cả các mẫu DNA đối chứng. .33

Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA bệnh nhân
ung thư phổi....................................................................................34
Bảng 3.3. Tỉ lệ kiểu gen...................................................................................37
Bảng 3.4. Tỉ lệ alen...........................................................................................38


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Tình hình mắc ung thư phổi trên thế giới năm 2012 (Nguồn
GLOBOCAN 2012)..........................................................................5
Hình 1.2 Vị trí gen CYP2D6 trên NST...........................................................9
Hình 1.3. Cấu trúc của gen CYP2D6..............................................................10
Hình 1.4. Cơ chế sinh ung thư của Cytochrome P450....................................11
Hình 1.5. Minh họa tính đa hình đơn Nu (SNP).............................................17
Hình 1.6. Minh họa phương pháp PCR.........................................................19
Hình 2.1. Minh họa phản ứng cắt enzym.......................................................29
Hình 2.2. Minh họa kết quả sau khi xử lý với enzym HphI của sản phẩm
khuếch đại gen CYP2D6.................................................................31
Hình 3.1. Minh họa đo OD của mẫu DNA tách chiết bằng máy Nanodrop
1000.34
Hình 3.2. Minh họa hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0.8%....35
Hình 3.3: Minh họa điện di sản phẩm PCR mẫu đối chứng..........................36
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân ung thư phổi....36
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR CYP2D6 của mẫu đối chứng sau
khi xử lý enzym HphI.....................................................................36
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR CYP2D6 của mẫu bệnh nhân ung thư
phổi sau khi xử lý enzym HphI.........................................................37


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
SNP

PCR
RE
RFLP

OD
DNA
RNA
mRNA
Nu

CYP
CYPs
CYP2D6
NST
Kb
Bp
dNTP
ddNTP
TE
CC
KK
CI
OR

Single Nucleotide Polymorphism
Hiện tượng đa hình thái đơn Nucleotid
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase
Restriction enzyme
Enzym cắt giới hạn

Restriction Fragment Length Polymorphism
Hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn DNA do
enzym giới hạn
Optical Density (Độ hấp thụ quang)
Deoxiribo Nucleic Acid
Ribonucleic Acid
Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin)
Nucleotide (hoặc Deoxyribonucleotide)
A: Deoxyadenosine triphosphate
T: Thymidine triphosphate
G: Deoxyguanosine triphosphate
C: Deoxycytidine triphosphate
Cytochrome
Cytochrome p450
Cytochrome 2D6
Nhiễm sắc thể
Kilo base
base pair
Deoxyribonucleotid - 5 – Triphosphate
Dideoxyribonucleotid - 5 – Triphosphate
Tris EDTA
Mẫu chứng
Mẫu bệnh
Confidence Interval (Độ tin cậy)
Odds Ratio (Tỷ suất chênh)
Bảng viết tắt các acid amin:

Ala
Arg

Alanine
Arginine

Gly
His

Glycine
Hisidine


Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Pro
Thr
Tyr

Asparagine
Aspartic acid
Cysteine
Glutamine
Glutamic acid
Proline
Threonine
Tyrosine

Ile
Leu

Lys
Met
Phe
Ser
Trp
Val

Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenylalanine
Serine
Trytophan
Valine


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kể từ năm 1908, Laennec mô tả ung thư phổi trong cuốn từ điển Y học
cho đến nay, ung thư phổi đang là mối quan tâm hàng đầu của thế giới.
Theo thống kê của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới, năm 2012 có 1,8
triệu trường hợp ung thư phổi mới được chẩn đoán và đứng hàng đầu
trong các loại ung thư. Đây cũng là tình hình chung tại Việt Nam. Các
thống kê của hiệp hội Ung thư quốc gia cho thấy số bệnh nhân ung thư
phổi gia tăng liên tục trong các năm gần đây.
Hiện nay, việc chẩn đoán phát hiện sớm và điều trị là những vấn đề quan
trọng trong bệnh học ung thư. Cùng với các phương pháp chẩn đoán và theo
dõi ung thư truyền thống như chụp Xquang, chụp CTscan... các nhà khoa học

đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác ung
thư [1].
Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là sự tiến bộ
rất nhanh của Y - sinh học phân đã được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán
sớm ung thư, trong đó có ung thư phổi. Việc phát hiện các bất thường ở mức
độ DNA hoặc RNA trên các gen gây ung thư và phân tích các đa hình thái
trên một số gen chủ chốt có thể xác định được nguy cơ ung thư thông qua sự
phân bố kiểu gen của từng cá thể.
CYP2D6 là gen quy định mã hóa cho enzym CYP2D6 – có vai trò quan
trọng trong chuyển hóa một số thuốc trên lâm sàng. Việc tăng hay giảm hoạt
động của enzym CYP2D6 đã được nghiên cứu chứng minh rằng có liên quan
đến tính mẫn cảm của một số bệnh ung thư, trong đó có ung thư phổi. Theo
một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, giảm hoạt động của
enzym CYP2D6 có liên quan đến bệnh Parkinson (Smith et al,1992), bệnh
bạch cầu, ung thư phổi (Ari Hirvonen, et al., 1993) và ung thư miệng (Worrall


2
et al., 1998). Việc xác định, phân tích tính đa hình thái đơn có giá trị rất lớn
trong đánh giá nguy cơ mắc ung thư phổi, từ đó đưa ra những biện pháp
phòng tránh những yếu tố nguy cơ, ngăn cản sự hình thành và phát triển ung
thư, tiên lượng, chẩn đoán sớm, theo dõi, điều trị có hiệu quả.
Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về mối liên
quan giữa tính đa hình thái của gen CYP2D6 với bệnh ung thư phổi. Chính vì
vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện
tính đa hình C188T của gen CYP2D6 ở bệnh nhân ung thư phổi” nhằm
thực hiện hai mục tiêu cụ thể sau:
1.

Hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR-RFLP xác định tính đa hình

C188T của gen CYP2D6

2.

Bước đầu xác định tính đa hình C188T trên một số mẫu ung thư
phổi so sánh với mẫu đối chứng.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ung thư phổi
Ung thư phổi xuất hiện từ những mô của phổi, thường là từ các tế bào
trong các đường dẫn khí. Ung thư phổi được chia làm 2 loại chính: ung thư
phổi nguyên phát và ung thư phổi thứ phát. Ung thư phổi nguyên phát là
những tế bào ung thư đầu tiên được khởi phát từ những tế bào tham gia cấu
trúc của phổi như: các biểu mô phế quản, tiểu phế quản tận, phế nang hoặc từ
các tuyến phế quản. Ung thư phổi thứ phát là từ các cơ quan khác trong cơ thể
di căn đến phổi (ung thư dạ dày, ung thư gan, sarcoma xương....) [2]
1.1.1. Dịch tễ học
1.1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới
Những đặc điểm lâm sàng của ung thư phổi đã được Laennec (1781 –
1826), một bác sĩ người Pháp mô tả lần đầu tiên trong y văn vào năm 1808.
Hơn 100 năm sau (1912), Adler I. đã thu thập được 375 trường hợp ung thư
phổi. Năm 1950, lần đầu tiên người ta đã chứng minh mối liên quan giữa ung
thư phổi với thuốc lá và nhận thấy rằng 80% các ung thư phổi liên quan với
yếu tố môi trường, chế độ ăn uống, khói thuốc lá, sự nhiễm độc nước, không
khí, điều kiện lao động… Nếu có nhiều yếu tố phối hợp thì nguy cơ mắc ung
thư phổi càng cao.

Ung thư phổi là loại ung thư gây tử vong hàng đầu ở 35 nước trên thế
giới. Tỷ lệ mắc giữa nam và nữ là 5:1.
Các số liệu thống kê cho thấy tỉ lệ mắc ung thư phổi trên thế giới đã
tăng gấp 4 lần trong vòng 10 năm (1980 – 1990). Năm 2002, theo Parkin DM,
và cộng sự, số ung thư phổi mới mắc trên toàn thế giới đã lên tới 1,35 triệu
trường hợp, chiếm 12,4% tổng số các loại ung thư, tần xuất mắc ung thư phổi


4
ở nam là 35,5/100.000 dân, ở nữ là 12,1/100.000 dân. Số tử vong do ung thư
phổi là 1,15 triệu trường hợp mỗi năm, chiếm 17,6% tổng số tử vong do ung
thư, trong đó 49,9% các trường hợp mới mắc là ở các nước đang phát triển.
Trên thế giới tỉ lệ mắc bệnh cao nhất (100/100.000 dân) ở vùng New
Orleans (Hoa kỳ) và Maoris (New Zealand), tiếp theo là ở Vương quốc Anh
và Hà Lan.
Theo Hội nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for
Research on Cancer), năm 2004 tại Châu Âu có khoảng 2.886.800 trường hợp
ung thư mới được phát hiện và 1.711.000 trường hợp tử vong do ung thư. Hầu
hết các trường hợp mới mắc là ung thư phổi (13,2%), sau đó là ung thư đại
tràng (13,0%), và ung thư vú (12,8%). Ung thư phổi vẫn đứng hàng đầu trong
các nguyên nhân chết do ung thư (20%), sau đó là ung thư đại tràng (11,9%)
và ung thư dạ dày (8,1%). [3]
Tại Hoa Kỳ, ung thư phổi là loại ung thư gây tử vong hàng đầu trong
các bệnh ung thư ở cả hai giới, với khoảng 215.020 bệnh nhân ung thư phổi
mới mắc và 161.480 bệnh nhân tử vong vào năm 2008. [4]
Sự gia tăng nhanh chóng của ung thư phổi không chỉ ở các nước phát
triển, mà hiện nay bệnh cũng đang tăng nhanh ở các nước đang phát triển.
Năm 2000 tại Thượng Hải – Trung Quốc tử vong do ung thư phổi tăng lên từ
25,2 – 40/100.000 dân với mức gia tăng hàng năm là 1,79%, tỷ lệ mắc ở nam
là 72,8/100.000, ở nữ là 30/100.000, tỷ lệ bệnh nhân sống thêm 5 năm là

7,1%. [5]


5

Hình 1.1. Tình hình mắc ung thư phổi trên thế giới năm 2012 (Nguồn
GLOBOCAN 2012)
1.1.1.2. Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam
Hiện nay đã có những số liệu ghi nhận về ung thư tương đối chính xác
và có thể đại diện cho tình hình ung thư của cả nước. Theo số liệu về tỷ lệ ung
thư ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh giai đoạn từ năm 1995 – 1996, và từ
đó ước tính chung tỷ lệ mắc ung thư ở Việt Nam năm 2000, nam giới có
khoảng 36.021 người chiếm tỷ lệ 91,5/100.000 dân và ở nữ giới có khoảng
32.786 người, chiếm tỷ lệ 81,5/100.000 dân. Ung thư phổi đứng hàng đầu ở
nam giới. Ước tính cả nước hàng năm có khoảng 6.905 ca ung thư phổi mới
mắc. Trong số các trường hợp ung thư phổi nhập viện, 62,5% không còn khả
năng phẫu thuật.
Tại Khoa hô hấp bệnh viện Bạch Mai, số các trường hợp ung thư phổi
nhập viện tăng đều hàng năm: 1969 đến 1972 có 89 trường hợp ung thư phổi,
từ 1974 đến 1978 có 186 trường hợp, từ 1981 đến 1985 có 285 trường hợp, từ
1996 đến 2000 có 639 trường hợp, chiếm 16,6% tổng số các bệnh nhân điều
trị, đứng hàng thứ 2 (sau bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính). [6]


6
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ của bệnh ung thư phổi
- Thuốc lá: Khói thuốc lá gây ung thư phổi. Chất gây hại được gọi là chất
gây ung thư, trong thuốc là làm tổn hại các tế bào ở phổi. Trải qua thời gian,
các tế bào bị tổn hại có thể trở thành ung thư. Khả năng một người hút thuốc
lá sẽ bị ung thư phổi bị ảnh hưởng bởi tuổi bắt đầu hút thuốc, thời gian hút

thuốc, số lượng điếu thuốc hút trong một ngày và sự hít sâu khói thuốc lá vào
phổi.
- Xì gà và tẩu thuốc: Người hút xì gà và tẩu thuốc có một nguy cơ ung thư
phổi cao hơn những người không hút thuốc. Số năm một người hút thuốc, số
lượng xì gà hoặc tẩu thuốc đã hút trong một ngày, sự hít sâu khói thuốc vào
trong phổi, tất cả ảnh hưởng tới nguy cơ phát triển thành ung thư phổi. Ngay
cả khi người hút xì gà hoặc tẩu thuốc không hít khói vẫn làm tăng nguy cơ đối
với phổi, miệng và các loại ung thư khác.
- Khói thuốc lá trong môi trường: Cơ hội phát triển ung thư phổi được
tăng bởi sự tiếp xúc với môi trường khói thuốc lá. Khói thuốc trong không khí
khi một người nào đó hút thải ra. Tiếp xúc với môi trường khói thuốc lá hoặc
khói thuốc thứ phát, được gọi là hút thuốc lá thụ động hoặc vô tình.
- Phóng xạ: Phóng xạ là một khí ga hoạt hoá phóng xạ không vị, không mùi
và không nhìn thấy được nó có thể xảy ra tự nhiên trong đất và đá. Nó có thể
gây tổn hại tới phổi dẫn tới ung thư phổi.
- Amiăng: Amiăng là tên gọi của một nhóm chất khoáng nó tồn tại trong tự
nhiên như dưới dạng sợi và được sử dụng trong một số ngành công nghiệp.
Sợi amiăng khuynh hướng dễ dàng tách thành các phân tử nhỏ nó có thể trôi
nổi trong không khí và dính vào quần áo. Khi các phân tử được hít vào, chúng
có thể tồn tại trong phổi, gây tổn hại tế bào và làm tăng nguy cơ ung thư phổi.
Các nghiên cứu đã cho thấy rằng các công nhân bị tiếp xúc với một khối


7
lượng lớn amiăng có nguy cơ phát triển thành ung thư phổi cao hơn gấp 4-5
lần những người công nhân không tiếp xúc với aminăng.
- Ô nhiễm không khí: Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra mối liên hệ giữa
ung thư phổi và tiếp xúc với các chất gây ô nhiễm không khí nào đó, như các
sản phẩm của sự kết hợp giữa diesel và các dầu thô khác. Tuy nhiên, mối liên
quan này đã không được xác định rõ ràng và nhiều nghiên cứu đang tiếp tục

nghiên cứu.
- Các bệnh phổi: Các bệnh phổi nào đó, như lao, tăng cơ hội phát triển ung
thư phổi. Ung thư phổi khuynh hướng phát triển ở các vùng lao đã thành sẹo.
- Tiền sử các nhân: một người đã bị ung thư phổi, nhiều khả năng có thể bị
ung thư phổi lần thứ hai hơn so với người chưa bao giờ bị ung thư phổi. [7].
1.1.3 Phân loại, chẩn đoán, tiên lượng và điều trị
1.1.3.1. Phân loại
Ung thư phổi được chia làm 2 loại chính: Ung thư phổi tế bào nhỏ và
ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, tùy thuộc vào hình dạng tế bào dưới kính
hiển vi. Mỗi loại ung thư phổi phát triển và lan theo những cách khác nhau và
được điều trị khác nhau. Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ thường gặp hơn
ung thư phổi tế bào nhỏ (khoảng 80%) và nó thường phát triển và lan chậm
hơn. Có 3 loại ung thư không phải tế bào nhỏ chủ yếu. Chúng được đặt tên
theo loại tế bào từ đó ung thư phát triển: ung thư biểu mô tế bào vẩy (còn gọi
là ung thư dạng biểu bì), ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô tế bào
lớn. [8]
1.1.3.2. Chẩn đoán
Dựa vào các triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, giải phẫu mô
bệnh học và xét nghiệm.
Chẩn đoán xác định: Chẩn đoán lâm sàng phối hợp với chụp Xquang
ngực thẳng nghiêng, soi phế quản và sinh thiết u, nếu không có kết quả nên


8
chọc hút xuyên thành ngực vào khối u lấy bệnh phẩm làm chẩn đoán mô bệnh
học hoặc tế bào học.
Chẩn đoán giai đoạn: Phân loại giai đoạn ung thư phổi nhằm đánh giá
sự lan rộng của khối u, vị trí, kích thước u, tình trạng di căn hạch và các cơ
quan khác ngoài lồng ngực. Đánh giá chính xác giai đoạn là hết sức quan
trọng, không thể thiếu trong chẩn đoán và là chìa khóa trong điều trị và tiên

lượng bệnh
1.1.3.4. Điều trị
Phẫu thuật loại bỏ khối u: Có hiệu quả nhất khi khối u còn nhỏ và
chưa có di căn. Bệnh nhân có thể trạng tốt để phẫu thuật. 20% bệnh nhân
được điều trị theo phương pháp này. Những bệnh nhân được phẫu thuật lấy
toàn bộ khối u có thời gian sống thêm lâu dài. Phương pháp này được áp dụng
cho 35% bệnh nhân. Mục đích là phá hủy khối u khi nó còn nhỏ (thường có
đường kính 6cm) và không có di căn. Đối với những khối u lớn thì nó làm
giảm sự phát triển của khối u. Phương pháp điều trị này kéo dài cuộc sống của
bệnh nhân nhưng ít khi chữa khỏi bệnh.
Điều trị bằng hóa chất: Có tác dụng tốt ở hầu hết bệnh nhân ung
thư phổi loại tế bào nhỏ và đôi khi ở những loại ung thư phổi khác. Những
tiến bộ gần đây về hóa trị liệu đã làm giảm đáng kể những tác dụng phụ so
với trước đây.
Điều trị hỗ trợ: Chỉ áp dụng cho khoảng 1/3 bệnh nhân ung thư phổi
giai đoạn muộn không điều trị được bằng các phương pháp kể trên, bao gồm
chăm sóc bệnh nhân, điều trị triệu chứng và làm giảm đau. Cần có một chế độ
ăn thích hợp cho bệnh nhân. Tài liệu “Chế độ ăn và dinh dưỡng đối với ung
thư” hướng dẫn về điều này. Nghỉ ngơi, chăm sóc về mặt y tế và giải trí đôi
khi giúp ích cho bệnh nhân.


9
Có một số phương pháp điều trị ung thư phổi không được công nhận
bao gồm dùng thuốc tẩy, chế độ ăn kì quái và tiêm các thuốc miễn dịch có
khả năng gây nguy hiểm cho bệnh nhân và mất thì giờ, mất tiền nên cần
phải tránh.
Triển vọng: Ở hầu hết các bệnh nhân ung thư, kết quả điều trị tốt nhất
khi ung thư được phát hiện sớm và điều trị kịp thời. Ví dụ có 50% bệnh nhân
được phẫu thuật lấy bỏ khối u sống thêm được 5 năm. Tuy nhiên số bệnh

nhân này còn ít. Trong tất cả các bệnh nhân bị ung thư phổi, chỉ có 10% sống
thêm được 5 năm sau khi được chẩn đoán.
Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị mới bao gồm đưa chất đồng vị phóng
xạ vào phế quản, điều trị bằng tia xạ, điều trị bằng laser, các thuốc hóa chất
mới, những nghiên cứu sinh học phân tử đang được tiến hành và đã thu được
một số kết quả.[9].
1.2. Sơ lược về gen CYP2D6
1.2.1. Vị trí và cấu trúc
Gen YP2D6 nằm trên NST 22, vùng q13.1 Gen dài 4408 bp (từ vị trí
42522501 đến vị trí 42526908), gồm 8 đoạn intron và 9 đoạn exon được phiên
mã thành một phân tử mRNA (ARN thông tin) kích thước 1655 bp, mã hóa
tổng hợp cho một phân tử protein có 497 acid amin và có khối lượng phân tử
là 55801 Da (55.8kDa). Phân tử protein này là một enzym thuộc nhóm
oxygenase, có hoạt tính xúc tác cho sự chuyển hóa của nhiều loại thuốc.

Hình 1.2 Vị trí gen CYP2D6 trên NST


10
Cấu trúc của gen như sau:
- Vùng khởi động (Promoter): Điều khiển hoạt động của gen để mã hóa
protein.
- Exon: Gen CYP2D6 có 9 exon chứa thông tin mã hóa để phiên mã thành
mRNA, chứa thông tin di truyền cho sư tổng hợp protein.
- Intron: có 8 intron không chứa thông tin mã hóa protein. [10]
3’UTR

5’UTR

Hình 1.3. Cấu trúc của gen CYP2D6

1.2.2. Chức năng của enzym CYP2D6.
1.2.2.1. Sơ lược về hệ thống Cytochrome P450 oxidase
Hệ thống CYP450 này là một nhóm các enzym oxygenase nhân heme
chịu trách nhiệm về giai đoạn I oxy hóa của hàng ngàn nội độc tố, ngoại độc
tố, thuốc, xenobiotic và những phân tử không cần thiết hoặc có hại.
Cytochrome P450 oxidase có khoảng 500 amino acid và một nhóm
heme ở vị trí hoạt động. Đa số chúng có thể chuyển hóa nhiều loại cơ chất và
nhiều loại có thể xúc tác nhiều phản ứng, điều này chứng tỏ vai trò trung tâm
của chúng trong việc chuyển hóa những trạng thái khác nhau không ngừng
thay đổi của những phân tử có nguồn gốc bên ngoài. Hệ thống Cytochrome
P450 monooxygenase cần NADPH và phân tử ôxi (O2) để hoạt động. Dự án
bộ gen người đã xác định được 63 gene mã hóa cho các enzym Cytochrome
P450 khác nhau. [11]


11

Hình 1.4. Cơ chế sinh ung thư của Cytochrome P450
1.2.2.2. Chức năng của enzym CYP2D6
Protein CYP2D6 được mã hóa tổng hợp bởi gen CYP2D6 là một thành
viên của hệ thống enzyme Cytochrom P450 oxidase
Tuy chỉ chiếm một tỉ lệ phần trăm nhỏ trong hệ thống P450s nhưng
CYP2D6 chịu trách nhiệm cho sự chuyển hóa và thải trừ đến 25% các loại
thuốc được sử dụng trên lâm sàng, bao gồm dextromethorophan, thuốc chẹn
β, thuốc chống loạn nhịp, thuốc chống trầm cảm... Enzym này cũng chuyển
hóa một số chất nội sinh như hydroxytamines, neurosteroid… [12]
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt tính của enzym CYP2D6 có tính
chất cá thể. Điều này được giải thích bởi tính đa hình của gen CYP2D6 tạo ra
các kiểu gen khác nhau và mức độ biểu hiện của mỗi kiểu gen đó tương ứng
với từng cá thể sinh sống trong cộng động. Do đó, đối với các thuốc được

chuyển hóa bởi CYP2D6, một số cá nhân sẽ loại bỏ các thuốc này nhanh
chóng (chuyển hóa cực nhanh), trong khi một số khác lại chuyển hóa chậm
(chuyển hóa kém). Nếu một loại thuốc được chuyển hóa nhanh, nó có thể làm
giảm hiệu quả của thuốc, trong khi đó, nếu thuốc được chuyển hóa chậm, độc
tính có thể xảy ra. [13]


12
Sự tăng hoạt động của enzym CYP2D6 liên quan đến một số bệnh lý ác
tính, như ung thư bàng quang (Anwar et al., 1996). Các dữ liệu được phân tích
cho thấy sự tăng trao đổi chất của một hay nhiều chất trong chế độ ăn hay một
số tác nhân môi trường qua xúc tác của CYP2D6 hình thành các phản ứng
trung gian làm ảnh hưởng đến sự bắt đầu hay sự phát triển của bệnh ung thư ở
các mô khác nhau (Nebert,1997). Trong khi đó, giảm hoạt động của enzym
CYP2D6 có liên quan đến bệnh Parkinson (Smith et al,1992), bệnh bạch cầu
và ung thư miệng (Worrall et al., 1998). [14]
1.2.3. Tính đa hình thái
1.2.3.1. Tính đa hình thái của gen CYP2D6
Tính đa hình thái của gen CYP2D6 được đánh giá thông qua tần suất
các kiểu gen của chúng. Cho đến nay, ngoài dạng nguyên thuỷ của CYP2D6
(CYP2D6*1), người ta đã xác định được nhiều kiểu gen tương ứng với mỗi
SNPs của những gen này ở các dân tộc khác nhau.
Sự phát hiện ra tính đa hình của gen CYP2D6 diễn ra độc lập ở ba
phòng thí nghiệm khác nhau. Phòng thí nghiệm Folke Sjoquists đã theo dõi sự
trao đổi chất của Nortriptyline và Desimipramine ở các đối tượng tham gia
nghiên cứu, và đã nhận thấy có sự khác biệt rất lớn về nồng độ thuốc trong
huyết tương giữa nhiều cá nhân khi họ cùng sử dụng một liều thuốc, từ đó hai
kiểu hình đã được xác định. Nghiên cứu tiếp theo của nhóm Sjoqvist là trên
một cặp song sinh. Ông đã kết luận sự khác biệt này được di truyền.
Bob Smith và đồng nghiệp ở London nghiên cứu sự chuyển hóa của hai

loại thuốc là antihyoersensitive bethanidine và debrisoquine, sử dụng cho
bệnh cao huyết áp. Tháng 5 năm 1975, sau khi sử dụng 40mg debrisoquine
ông cảm thấy chóng mặt, nhìn mờ và tụt huyết áp nặng. trong nghiên cứu tiếp
theo, ông sử dụng 10mg debrisoquine cho 94 đối tượng và đã xác định được
hai kiểu hình.


13
Michel Eichelbaun ở Born đã nghiên cứu những ảnh hưởng của
antiarrhytmic sparteine, có hai đối tượng đã phàn nàn về tác dụng phụ khó
chịu như nhìn mờ, chóng mặt, nhức đầu. Phân tích các nồng độ thuốc trong
huyết tương của họ, ông nhận thấy họ có mức cao hơn 4-5 lần so với những
người khác. Và hai kiểu hình đã được công bố vào năm 1978 và 1979.
Cơ sở đa hình của CYP2D6 về chuyển hóa debrisoquine đã được làm
sáng tỏ sau 10-15 năm sau. Trong một nghiên cứu hợp tác giữa hai phòng thí
nghiệm của Meyers và Frank Gonzalez, các kháng thể đa dòng CYP2D6
chuột ở Basel đã được sử dụng như là công cụ sao lưu các cDNA của người.
Sử dụng kỹ thuật RFLP, phòng thí nghiệm của Meyers đã khẳng định mô hình
RFLP đã bị thay đổi ở PMs trong chuyển hóa Debrisiquine. Những hiểu biết
đầy đủ về alen CYP2D6*3, *4 đã được công bố năm 1990. [15]
Hiện nay đã có hơn 130 đa hình đơn Nu đã được xác định trong gen
CYP2D6, trong đó có rất nhiều biến thể nonsynonymous, promoter, mất
nucleotide hay những thay đổi về intron. Hơn 80 alen biến dị đã được báo cáo
trong trang web Human CYP allele Nomenclature Committee. Sự có mặt của
các SNP có thể làm thay đổi hoạt động của enzym CYP2D6, được chia thành
chuyển hóa cực nhanh (UM), chuyển hóa nhanh (EM), chuyển hóa trung gian
(IM), và chuyển hóa kém (PM). [16]
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số đa hình của CYP2D6 có liên
quan chặt chẽ với bệnh ung thư phổi do hút thuốc lá. CYP2D6 là enzym có
vai trò quan trọng trong giai đoạn chuyển hóa ở gan. Các tiền chất gây ung

thư có trong thuốc lá trong cơ thể như nicotine và các hydrocarbon có nhân
thơm thông qua sự kích hoạt trao đổi chất của CYP2D6 để trở thành chất gây
ung thư, gắn vào DNA dẫn đến tổn thương tế bào, có thể liên quan đến thay
đổi quá trình của bệnh ung thư phổi do hút thuốc lá. [17].


14
Bảng 1.1 Một số SNP của gen CYP2D6 [18]
Đa hình
Alen
Dân số
đơn
Vị trí
nucleotid
Dạng nguyên
CYP2D6 * 1 Tổng dân số
22q13.1
thủy
Mất 2637A
Người châu
CYP2D6 * 3
hoặc (aka., Exon 5
Á 0%
2549A)

CYP2D6
Hoạt động

Ghi chú

bình thường

Chuyển hóa
rộng

Thiếu

Chuyển hóa
kém

Thiếu

Chuyển hóa
kém

CYP2D6 * 4

Người Mỹ
gốc Phi 2%

G1934A

Giao
Intron
của 3
& Exon
4

CYP2D6 * 6

Da trắng
1,8%

Xóa T-1795
gây ra
stop codon

Exon 3

Thiếu

Chuyển hóa
kém

C188T

Exon 1

↓

Chuyển hóa
kém

Exon 3

Thiếu

Chuyển hóa
kém

Intron 1

↓

thay đổichất
nền của
CYP2D6

-

↓

Chuyển hóa
kém

Người châu
Á 39-51%
Người Mỹ
CYP2D6* 10
gốc Phi 6%
Da trắng 12%
CYP2D6 *14

Châu Á
2.2%

CYP2D6*17

Người Mỹ
gốc Phi

20-35%

CYP2D6*29

Châu Phi da
đen 20%

P34S
G169R
R296C
S486T
C111T
(T107I)
C2938T
(R296S)
G4268C
(S486T)
G3183A


15
1.2.3.2. Một số nghiên cứu liên quan đến SNP C188T của gen CYP2D6
Gen CYP2D6 là một gen đa hình thái. Sự thay đổi cấu trúc của gen làm
thay đổi protein do nó tổng hợp, dẫn đến sự thay đổi hoạt động của enzym
CYP2D6. Sự thay đổi đó có thể làm tăng hoặc giảm chức năng của enzym
CYP2D6, và đã được nghiên cứu rất nhiều trên lâm sàng, đặc biệt là trong
dược động học. Một trong những alen có vai trò quan trọng, chiếm tỉ lệ lớn đã
được nghiên cứu là alen CYP2D6*10.
Theo các nghiên cứu, alen CYP2D6*10 chiếm tỉ lệ cao nhất trong tổng
số dân châu Á, bao gồm hai đột biến điểm là thay thế C bằng T ở vị trí 188

trên exon 1, và thay thế G bằng C ở vị trí 4268 trên exon 9, trong đó C188T
có vai trò quan trọng hơn. Đột biến C188T đã gây ra sự thay thế acid amin
Pro bằng Ser ở vị trí 34 trong chuỗi polypeptid. Đột biến này dẫn đến sự
không ổn định của enzym CYP2D6 do gen này mã hóa tổng hợp, làm giảm sự
trao đổi tiền chất gây ung thư, có thể dấn đến tính nhạy cảm của cá nhân đến
ung thư phổi. Gen đột biến được chia làm 3 dạng theo kiểu gen: C/C
(CYP2D6*/*1), C/T (CYP2D6*1/*10), T/T(CYP2D6*10/*10). [19]
Một nghiên cứu của các nhà khoa học về tính đa hình của gen CYP2D6
tại SNP C188T bằng phương pháp PCR-RFLP trên 491 người Trung Quốc đã
cho tần số các kiểu gen C188/C, C188/T, T188/T lần lượt là 16.7%, 43.4% và
39.9%, và tần số hai alen 188C và 188T lần lượt là 38.4 và 61.6 (P>0.05). Kết
quả trên không phụ thuộc vào tuổi và giới. [20]
Một nghiên cứu khác cũng được công bố trên Chine Papers ngày
10/6/2010 nghiên cứu trên 200 bệnh nhân ung thư phổi và 200 chứng ở Trung
Quốc, tần số các kiểu gen C188/C, C188/T, T188/T ở nhóm ung thư phổi và
nhóm chứng lần lượt là 21.00%, 49.50%, 29.50% và 18.50%, 39.00%,
42.505, tần số alen 188T lần lượt là 54,25% và 62.00% (P>0.05). Kiểu gen
không phải là T188/T ở những người có nguy cơ mắc ung thư phổi 1.78 lần


16
kiểu gen T188/T( 95% CI 1.10-3.04), đặc biệt là trong ung thư biểu mô tế bào
vảy OR=2.57 (95% CI 1.13-5.46). Kiểu gen T188/T ở người không hút thuốc
lá OR=3.21(95% CI=1.23-7.48), kiểu gen không phải T188/T ở người không
hút thuốc lá OR =2.19 (95% CI= 1,05-4,37), kiểu gen không phải là T188/T ở
người hút thuốc lá OR= 3.84 (95% CI= 1.69-8.72). [17]
Bảng 1.2 Tần số kiểu gen CYP2D6*10 ở một số dân tộc [19]
Dân tộc

n

Tần số
alen (%)

CC (%)

CT(%)

TT(%)

Hồng Kông

119

46.2

4.2

30.3

41.2

Dân tộc Hán

223

51.6

5.8

27.8

24.2

(Trung Quốc)
Dân tộc Miêu

100

47.5

31.0

43.0

26.0

(Trung Quốc)
Hàn Quốc
Nhật Bản
Ethiopia
Thổ Nhĩ Kì
Tây Ban Nha
Hồi Ninh Hạ

152
98
122
100
105

150

51.0
40.8
8.6
14.5
1.9
47.5

26.0
18.4
9.0
75
32

45.0
33.7
21
40.7

28.0
17.3
4
27.3

1.3. Hiện tượng RFLP và SNP
1.3.1. Hiện tượng RFLP
Hiện tượng RFLP (Restriction Fragment Length Polymorohism) hay
hiện tượng đa hình về chiều dài các đoạn DNA do enzym giới hạn tạo nên là
hiện tượng khi cắt một phân tử DNA lớn bằng một enzym giới hạn nào đó,

phân tử DNA đó sẽ được cắt thành từng mảnh DNA nhỏ khác nhau, và số
lượng cũng như chiều dài những đoạn DNA nhỏ được cắt ra là đặc trưng và
khác biệt đối với từng cá thể. Hiện tượng RFLP cũng di truyền theo quy luật
Mendel. [21]