Luận văn thạc sĩ hóa học: Cảm biến sinh học trên cơ sở Composite Polyrrole và ống Nanocacbon ứng dụng xác định Gox và AND

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------VŨ THỊ HỒNG ÂN

CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ COMPOSITE
POLYPYRROLE VÀ ỐNG NANOCACBON
ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH GOx VÀ ADN

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA LÝ – HÓA LÝ THUYẾT

HÀ NỘI - 2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------VŨ THỊ HỒNG ÂN

CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ COMPOSITE
POLYPYRROLE VÀ ỐNG NANOCACBON
ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH GOx VÀ ADN
CHUYÊN NGÀNH: 62443101

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA LÝ - HÓA LÝ THUYẾT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN ĐẠI LÂM

HÀ NỘI - 2008


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Đại Lâm, người đã trực tiếp
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Để giúp tôi
hoàn thành tốt nhất nghiên cứu của mình, thầy đã tạo mọi điều kiện và chỉ bảo tôi
tận tình mỗi khi tôi gặp khó khăn trong công việc. Những kiến thức về chuyên môn,
những kinh nghiệm về nghiên cứu khoa học mà tôi học được từ thầy sẽ luôn cùng
tôi trên con đường nghiên cứu tiếp theo
Thành công của luận văn ngày hôm nay cũng là nhờ sự giúp đỡ tận tình của
TS.Trương Thị Ngọc Liên, người đã tạo rất nhiều điều kiện thuận lợi, giúp đỡ về
máy móc, dụng cụ, hoá chất cũng như chỉ bảo, bổ sung kiến thức cho tôi trong suốt
quá trình tiến hành nghiên cứu. Cô và các thành viên khác trong nhóm nghiên cứu
đã cùng tôi từ những thí nghiệm đầu tiên, những buổi semina khoa học nội bộ trong
nhóm đã mang lại những kiến thức thiết thực cho tôi.
Tôi xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Hóa Phân tích đã giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình đã động viên, khích lệ, chia
sẻ và luôn ở bên tôi mỗi khi tôi gặp khó khăn.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nôi, ngày

tháng 11 năm 2008

Tác giả Vũ Thị Hồng Ân


BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
GOx

Glucose Oxidaza

ADN

Axit Desoxyribo Nucleic

Py

monomepyrrole

PPy

polypyrrole

CNT

Carbon nanotube: ống nano carbon

QCM

Quartz Crytal Microbalane: Vi cân tinh thể thạch anh

DPV

Diffirential Pulse Voltammetry: Cực phổ xung vi phân

SWV

Square Wave Voltammetry: Cực phổ sóng vuông

CV

Cyclic Voltammetry: Quét thế vòng

EIS

Electrochemical Impedance Spectroscopy: Phổ tổng trở
điện hóa

PPy_CNT_Gox

PPy pha tạp CNT có gắn enzyme glucose

PPy_ADN dò

PPy có gắn ADN dò

PPy_CNT_ADN dò

PPy pha tạp CNT có gắn ADN dò


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Cấu trúc hoá học và độ dẫn của một số loại polymer dẫn thông
dụng
Bảng 4.1. Tần số dao động của linh kiện QCM tại giá trị nồng độ DNA đích
xác định.
Bảng 4.2 Giá trị Rct nhận được sau mô phỏng tại các nồng độ DNA đích xác
định.


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1. 1 Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên của C Clark
Hình 1. 2 Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học thông thường
Hình 1. 3 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học
Hình 1. 4 Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và gắn kết
hoá học.
Hình 1. 5 Sơ đồ bộ phận chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện
Hình 1. 6 Mô hình cantiler biosensor phát hiện DNA.
Hình 1. 7 Sơ đồ cảm biến Gox
Hình 1. 8 Cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN
Hình 2. 1 Độ dẫn của vật liệu polymer dẫn so với các vật liệu khác.
Hình 2. 2 Polyme dẫn điện tử
Hình 2. 3 Polyme trao đổi ion
Hình 2. 4 Polyme oxy hoá khử.
Hình 2. 5 Công thức cấu tạo của pyrole
Hình 2.6 Công thức cấu tạo phân tử polypyrrole
Hình 2. 7. Polaron, bipolaron và sự hình thành các dải năng lượng tương ứng
Hình 2. 8 Cơ chế phản ứng trùng hợp polypyrrole
Hình 2. 9 Cấu trúc của (a) SWNT và (b) MWNT
Hình 2. 10 CNT nguyên chất và CNT gắn với các cấu tử sinh học.
Hình 3. 1 Chức năng hóa CNT bằng hỗn hợp HNO3: H2SO4 (1:3)
Hình 3. 2 Sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực sử dụng tổng hợp màng PPy pha tạp và
không pha tạp ứng dụng xác định chuyển gen trong đậu tương.
Hình 3. 3 Mô tả cấu trúc của tinh thể α-Quartz trong không gian (a) và trong mặt
phẳng (b)
Hình 3. 4 Cơ chế sinh ra hiện tượng áp điện trong tinh thể αHình 3. 5 Mô tả mode dao động trượt theo bề dày của linh kiện QCM.
Hình 3. 6 Mô tả một số mode dao động trượt bề dày, mode trượt bề măt và mode co
giãn.


Hình 3. 7 Cấu trúc của QCM Planar

Hình 3. 8 Biểu diễn vector Fresnel trong mặt phẳng phức.
Hình 3. 9 Tập điểm M vẽ nên một đường phổ tổng trở đặc trưng cho hệ khảo sát.
Hình 3. 10 Mạch điện tương đương Randles
Hình 3. 11 Mạch tương đương cho tổng trở của polymer
Hình 3. 12 Mạch tương đương cho tổng trở của polymer dẫn
Hình 4. 1 Ảnh hiển vi điện tử quét trường phát xạ FESEM của điện cực Gox trên
cơ sở màng composit polypyrrole pha tạp ống nanô cácbon.
Hình 4. 2 Ảnh hiển vi điênh tử quét SEM của màng PPy gắn DNA dò.
Hình 4. 3 Ảnh hiển vi điện tử quét SEM của màng PPy_CNTs gắn DNA dò
Hình 4. 4 Đặc trưng đáp ứng dòng theo thời gian của cảm biến GOx với sự thay đổi
nồng độ glucose trong dung dịch. Cảm biến hoạt động tại điện áp 0,7V so
với điện cực chuẩn Ag/AgCl.
Hình 4. 5 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm
việc tại điện áp 0,7V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.
Hình 4. 6 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm
việc tại điện áp 0,75V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.
Hình 4 .7 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm
việc tại điện áp 0,8V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.
Hình 4. 8 Hệ đo QCM200 đầy đủ gồm thiết bị điều khiển số QCM200, bộ dao động
QCM25, holder tinh thể và các cảm biến tinh thể quartz.
Hình 4. 9 Đặc trưng tần số theo thời gian ở chế độ đo không tải của linh kiện QCM.
Hình 4. 10 Đặc trưng tần số theo thời linh kiện QCM có gắn DNA trong môi trường
không có DNA đích
Hình 4. 11 Sự thay đổi khối lượng hấp thụ Δm trên bề mặt linh kiện QCM có gắn
DNA dò đo trong dung dịch chứa DNA đích với nồng thay đổi từ 0 pM
đến 269pM.
Hình 4. 12 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn
DNA dò trong dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 0 pM
đến 28 pM.

Hình 4. 13 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn
DNA dò đo trong dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 32
pM đến 56 pM.
Hình 4. 14 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn
DNA dò đo trong dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 59
pM đến 269 pM.
Hình 4. 15 Sự thay đổi tần số dao động của linh kiện QCM có gắn DNA dò theo sự
thay đổi nồng độ DNA đích từ 0 pM đến 269 pM.
Hình 4. 46 Thay đổi hình dạng của chuỗi DNA khi chuyển từ trạng thái đơn chuỗi
sang trạng thái ghép cặp.
Hình 4. 57 Mô hình mạch tương đương đơn giản của Randles.
Hình 4. 18 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy/DNA dò tại các nồn độ DNA
đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và
Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.
Hình 4. 19 (a) và (b) Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy/DNA dò tại các
nồng độ DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac
= 5 mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.
Hình 4. 20 Quy trình mô phỏng đặc trưng phổ tổng trở xác định Rct sử dụng mô
hình mạch tương đương của Randles trong chế độ Find circle của thiết bị
Autolab
Hình 4. 21 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm của nồng độ DNA đích (
từ 25 pM đến 46 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 2,2.10-3+5,5.105

*C(pM)

Hình 4. 22 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNTs/DNA dò tại các nồn độ
DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5
mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.
Hình 4. 23 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNTs/DNA dò tại các nồng độ

DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5
mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.


Hình 4. 64 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNTs/DNA dò tại các nồng độ
DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5
mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.
Hình 4. 75 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm của nồng độ DNA đích (
từ 25 pM đến 224 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C –
1,3.10-3 (pM)(nồng độ DNA đích từ 25 pM đến 81 pM).
Hình 4. 26 Mô hình mạch tương đương Randles có tính đến phần đóng góp của
tổng trở Warburg.


-1Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, cảm biến sinh học thu hút được sự quan tâm của
các nhà khoa học trên thế giới cũng như các nhà khoa học trong nước. Sự phát triển
của cảm biến sinh học giúp giải quyết nhu cầu cấp thiết về phân tích phát hiện cũng
như định lượng các thành phần sinh học bằng các phương pháp phân tích đơn giản
và dễ đưa vào ứng dụng thực tế. Thật vậy, các phương pháp phân tích truyền thống
như sắc ký, điện di, khối phổ...thường đòi hỏi trang thiết bị đi kèm khá phức tạp và
có giá thành cao. Cảm biến sinh học là một thiết bị có nhiều ưu điểm: sử dụng đơn
giản, có khả năng phát hiện nhanh, độ nhạy cao cũng như có tính chọn lọc cao trong
các hệ hóa học và sinh học. Lĩnh vực áp dụng của cảm biến sinh học rất đa dạng, nó
là một công cụ quan trọng trong kiểm tra an toàn thực phẩm, chuẩn đoán y học và
kiểm tra nội khoa, phát hiện các tác nhân ô nhiễm môi trường.
Cảm biến sinh học có thể hiểu là một thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học
như enzyme, các kháng thể, ADN… để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hóa chất.

Vì vậy một cảm biến sinh học thông thường gồm có 3 thành phần cơ bản, đó là:
thành phần hóa học, thành phần sinh học và thành phần vật lý.
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là
các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh học cũng
đạt được những tiến bộ vượt bậc, hứa hẹn đưa ra những vi thiết bị nhằm xác định
nhanh, chính xác các loại vi khuẩn virut gây bệnh. Các thiết bị này cũng có thể dò
tìm hay phân tích lượng mẫu rất nhỏ (cỡ vài nM) với độ tin cậy cao.
Với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chọn lọc cao, thiết
bị đơn giản, nhỏ gọn…cảm biến sinh học đã và đang thu hút được sự quan tâm đặc
biệt của các nhà khoa học cũng như các trung tâm nghiên cứu. Tuy nhiên việc chế
tạo cảm biến sinh học vẫn còn gặp nhiều khó khăn như độ ổn định trong chế tạo sản
phẩm, phương pháp đo tín hiệu, thời gian phản ứng, khả năng tái sử dụng, … Do

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-2Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

vậy, những nghiên cứu mới trong tương lai chủ yếu sẽ tập trung vào hai hướng
chính:
(1). Khắc phục những khó khăn sẵn có của thế hệ cảm biến cũ: Nâng cao
độ ổn định để có thể chế tạo hàng loạt, cải thiện khả năng tái sử dụng của các cảm
biến sinh học, tìm giải pháp hạ giá thành sản phẩm.
(2). Tìm kiếm vật liệu mới cũng như khả năng ứng dụng mới của cảm biến,
giảm kích thước cảm biến để tích hợp được nhiều cảm biến trên một thiết bị, cải
tiến thiết bị đo đơn giản và dễ sử dụng, rút ngắn thời gian đáp ứng v.v...
Hướng nghiên cứu của luận án đi theo hướng thứ hai, mục tiêu của luận án
là chế tạo hai cảm biến trên cơ sở vật liệu mới là sử dụng màng polyme dẫn pha tạp
với ống nanocacbon (CNT). Trong đó hai ứng dụng được thử nghiệm là: cảm biến
enzyme sử dụng enzyme glucose để xác định nồng độ glucose và cảm biến ADN để

xác định ADN chuyển gen trong đậu tương.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-3Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

CHƯƠNG I: CẢM BIẾN SINH HỌC
I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC
Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì:
“Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông
tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết
sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi ”[1].
Giáo sư C.Clark [2], người được coi là cha đẻ của cảm biến sinh học, đã
công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá vào năm 1956. Những năm tiếp theo
ông tiếp tục mở rộng khả năng hoạt động của cảm biến như phát hiện được thêm
nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Vào năm 1962, tại hội nghị
của Viện hàn lâm khoa học New York, ông đã thuyết trình một bài về cảm biến sinh
học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or
conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as membrane
enclosed sADN”. Ông đưa ra mô hình đầu tiên về cảm biến sinh học (hình 1).

Hình 1. 1: Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên của C. Clark [2].
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-4Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Cảm biến sinh học theo mô hình của C Clark [2] bao gồm điện cực oxy hóa,
trên đó có màng giữ enzyme glucose (glucose oxidase). Khi mật độ glucose trong

môi trường phản ứng giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm
một cách tương ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của
nồng độ glucose trong môi trường cần kiểm tra.
Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo [3] lần đầu tiên công
bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme
đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê dựa trên điện cực cố định enzyme urê
(urease) bằng màng chất lỏng chọn lọc NH4+.
Năm 1975 Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fibre-optic
sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2[4]. Cũng vào năm 1975,
một số vi khuẩn cũng đã được sử dụng như những thành phần sinh học trên các điện
cực vi sinh để đo nồng độ cồn[5]. Năm 1975 công ty Yellow Springs Instrument
(Ohio) lần đầu tiên biến ý tưởng của Clark thành hiện thực thông qua việc thương
mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa
trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của
các cảm biến sinh học trong đời sống[5]. Vào năm 1982, Shichiri và các đồng
nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến glucose in vivo, là loại cảm biến dạng kim
đầu tiên cho các xét nghiệm dưới da[6].
I.1.1 Cấu tạo cảm biến sinh học
I.1.1.1 Cấu tạo chung
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học (xem hình 1.1) bao gồm bốn bộ
phận chính: (1) Đầu thu sinh học: có tác dụng bắt cặp và phát hiện sự có mặt của
các tác nhân sinh học cần phân tích; (2) Tác nhân cố định: giúp gắn các đầu thu lên
trên điện cực; (3) Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học
thành các tín hiệu có thể đo đạc được; (4) Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (bộ phận
này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác có
thể xử lý).
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-5Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Hình 1. 2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học thông thường.
I.1.1.2. Tác nhân cần phát hiện
Tác nhân cần phát hiện được phân loại theo cấu tạo như sau:
a) Các vi khuẩn: các vi khuẩn thường được phát hiện bởi các cảm biến sinh
học là vi khuẩn Ecoli, vi khuẩn CADNida, vi khuẩn bệnh than …
b) Các phân tử nhỏ: các phân tử nhỏ mà cảm biến sinh học có thể phát hiện
được là CO, CO2, phân tử gluco, phân tử rượu, ure, thuốc trừ sâu, amino axit,
paracetamol, aspirin, penicilin, TNT, các tác nhân thần kinh khác, …
c) Các phân tử sinh học có kích thước lớn: những phân tử này có thể là các
phân tử ADN, RNA, protein, enzyme, các hocmon, …
I.1.1.3. Đầu thu sinh học
Nhiều cảm biến sinh học sử dụng các kết hợp đã được phát triển rất cụ thể
cho các ứng dụng. Có hai loại đầu thu sinh học. Đầu tiên, các cảm biến sinh học sử
dụng các enzyme hoặc kháng thể oligonucleotides, ví dụ các chất có nguồn gốc sinh
học, được thiết kế để thực hiện một chức năng cụ thể trong cơ thể sống. Do vậy,
chúng được sử dụng để phát hiện một chất cụ thể. Ngoài ra còn có những đầu thu
sinh học có thể được mô tả giả như ngược với đầu thu sinh học tự nhiên, thông qua
các phương pháp điện hoá có thể phát hiện một số chất.
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-6Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Đầu thu sinh học (Biological Receptor) là những đầu thu phản ứng trực tiếp
với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học. Dựa vào
các tác nhân sinh học sử dụng người ta chia ra thành một số loại đầu thu như sau:
Đầu thu làm từ enzyme: Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng đầu thu
phổ biến nhất. Đó là các đầu thu làm từ các enzyme urease, glucose, ...
Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên: Các đầu thu dạng này có

đặc điểm là tính chọn lọc rất cao đồng thời các liên kết được tạo thành khá mạnh.
Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm từ các
protein như cảm biến phát hiện hocmôn, xác định các chất kích thích thần kinh, ... Các đầu
thu này có đặc điểm là có tính chọn lọc rất cao. Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là rất khó
cách ly.

Hình 1. 3 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học
Đầu thu làm từ các axit nucleic: Các axit nucleic như ADN, ARN có thể sử
dụng làm đầu thu sinh học. Các cảm biến có đầu thu dạng này thường được sử dụng
để phát hiện đột biến và các sai lệch trong cấu trúc di truyền.
Đầu thu kết hợp: Với các đầu thu dạng này, người ta sử dụng đồng thời hai
hay nhiều các phân tử dạng trên (enzyme, kháng thể, protein, ...) trên một đế. Việc
kết hợp này mở rộng khả năng làm việc của các cảm biến sinh học. Một số cảm biến
dạng này là cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến xác định vi khuẩn bệnh than
và cảm biến thử thai.
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-7Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Đầu thu làm từ tế bào: Các đầu thu sinh học không chỉ được làm từ các
phân tử, nguyên tử mà nó còn có thể được làm từ các tế bào. Một số tế bào biến đổi
gien của vi khuẩn đã được sử dụng làm đầu thu sinh học. Khi có mặt các phân tử
chất độc, các tế bào này sẽ phát sáng, thông qua đó chúng ta xác định được sự xuất
hiện của các phân tử chất độc.
I.1.1.4. Tác nhân cố định
Các tác nhân cố định là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học.
Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế. Nói một
cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học
(có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ. Như vậy việc lựa chọn những

tác nhân cố định thích hợp cũng là một công việc quan trọng. Những tác nhân này
vừa phải đảm bảo gắn kết, cố định về mặt cơ học, vừa phải đảm bảo liên kết về mặt
tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phận chuyển đổi. Trên hình 1.3 trình bày cách
bắt giữ thành phần sinh học theo phương pháp vật lý và gắn kết hóa học.

Hình 1. 4: Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và gắn kết
hoá học.
I.1.1.5. Bộ phận chuyển đổi
Đây là bộ phận quan trọng trong cảm biến sinh học. Có nhiều dạng chuyển
đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng
tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ.
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-8Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế
(potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric).
Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng như: hấp
thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio–
luminiscence; chemi–luminiscence..
Chuyển đổi nhiệt hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entapy khi hình
thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme. Bộ chuyển
đổi này có ưu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển
đổi này có tính chọn lọc thấp.
Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric)
Chuyển đổi hoạt động dựa trên nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao
động khi lực tác dụng lên nó thay đổi, sự thay đổi này tuân theo phương trình
Sauerbrey:
∆f = - 2,3.106.f2.∆m/A

(1-1)

Trong đó, f là tần số dao động của tinh thể áp điện, ∆m là thay đổi khối
lượng đặt lên tinh thể áp điện và A là hằng số đặc trưng cho tinh thể áp điện.
Chuyển đổi dạng này có ưu điểm là độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian
phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể sử dụng đo đạc trong môi trường
lỏng và khí. Trên hình 1.5 trình bày sơ đồ bộ chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện để
phát hiện kháng nguyên.

Hình 1. 5 Sơ đồ bộ phận chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


-9Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Chuyển đổi bằng các hệ vi cơ
Nguyên lý hoạt động của cảm biến sử dụng chuyển đổi này như sau: chiếu
một chùm laser đến bộ phản xạ trên bề mặt một thanh dầm rất mỏng, ánh sáng phản
xạ được thu nhận bởi photodetector. Thanh mỏng này được chế tạo sao cho chỉ với
một lực tác động rất nhỏ cũng làm cho thanh bị uốn cong đi. Như vậy tín hiệu phản
xạ thu nhận được trên photodetector sẽ bị thay đổi so với trường hợp không có lực
tác dụng lên thanh. Căn cứ vào sự thay đổi tín hiệu phản xạ này, người ta có thể xác
định được lực tác dụng lên thanh (hình 1.6)

.
Hình 1. 6 Mô hình sensor sinh học sử dụng vi cơ phát hiện ADN.
I.1.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học
Ứng dụng trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ: Đây là lĩnh vực có
nhiều cải tiến cũng như nhiều ứng dụng nhất. Chúng ta có thể kể ra rất nhiều loại

cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi, lượng glucose trong máu, cảm biến huyết
áp, … Những cảm biến giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi tình hình
bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế. Ngày nay, các
cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà còn
được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 10 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Ứng dụng trong công nghệ môi trường: Đó là các cảm biến dạng “mũi
điện tử” xác định một hoá chất độc hại nào đó hoặc xác định độ ô nhiễm của môi
trường như cảm biến xác định nồng độ CO2, H2S; xác định dư lượng thuốc trừ sâu,
xác định nồng độ của các kim loại nặng, ...
Ứng dụng trong các tương tác Người – Máy: Đây cũng là một lĩnh vực
mới mẻ có nhiều nghiên cứu, ứng dụng. Có thể kể ra một số cảm biến dạng này như
cảm biến nhận dạng tiếng nói, hình ảnh, nhận dạng các đặc trưng sinh học của con
người. Đây cũng là lĩnh vực hứa hẹn có nhiều nghiên cứu, ứng dụng mới.
Ứng dụng trong việc điều khiển, quản lý các quá trình trong công nghệ
sinh học: Ngày nay, khi công nghệ sinh học phát triển, đồng thời với việc các chế
phẩm sinh học được sản xuất rộng rãi trên qui mô công nghiệp, cũng như tham gia
ngày càng nhiều vào các quá trình sản xuất khác thì một nhu cầu tất yếu nảy sinh,
đó là việc theo dõi, quản lý, điều khiển các quá trình sinh học như điều chỉnh lượng
gluco trong quá trình nuôi vi khuẩn…vv. Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều
ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng
nhanh, đơn giản và chính xác.
I.1.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học
Dưới đây là một số tiêu chí đánh giá, cũng như các yêu cầu đối với cảm biến
sinh học:

1) Độ chính xác: Độ chính xác thể hiện ở khả năng xác định đúng chất quan
tâm, không bị lẫn lộn với các chất khác. Độ chính xác còn được thể hiện ở khả năng
định lượng chính xác chất cần phát hiện.
2) Độ nhạy: Độ nhạy cũng là một tiêu chí khá quan trọng, nó thể hiện lượng
chất nhỏ nhất mà cảm biến có thể phát hiện.
3) Giới hạn đo: Giới hạn đo là giá trị lớn nhất, nhỏ nhất mà cảm biến có thể
đo được.
4) Tốc độ hồi đáp: Tốc độ hồi đáp là khả năng phát hiện, định lượng chất
cần phân tích nhanh hay chậm. Đây là một trong những tính chất của cảm biến mà
người ta đang tập trung cải tiến.
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 11 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

5) Khả năng dùng lại: Cho đến bây giờ, hầu hết các cảm biến sinh học chỉ
dùng được một lần do khi các tác nhân bắt cặp với đầu thu sinh học, rất khó để tách
các tác nhân này ra và tạo thành đầu thu ‘sạch’ như lúc ban đầu. Để khắc phục
nhược điểm này người ta đang cố gắng giảm giá thành các sản phẩm dùng một lần
và nghiên cứu chế tạo sản phẩm dùng nhiều lần.
6) Khả năng tự chuẩn hóa và độ thuận tiện, độ an toàn trong sử dụng:
Các cảm biến sinh học sẽ được sử dụng phổ biến ngoài phòng thí nghiệm do đó tiêu
chí dễ sử dụng và an toàn cũng rất quan trọng.
7) Giá thành: hiện nay cảm biến sinh học thường chỉ sử dụng được 1 lần do
đó cần thiết phải giảm giá thành.

I.2 CẢM BIẾN GOx
Từ những nghiên cứu đầu tiên của Clark và Lions vào năm 1962[2], Updike
và Hicks năm 1967 [7], cảm biến glucose trên cơ sở GOx đã đựợc tích cực nghiên
cứu, tiếp tục phát triển và ngày càng mở rộng trong kỹ thuật phân tích hiện đại.

I.2.1 Enzym glucose [8]
Enzym glucose còn có các tên gọi khác như Glucose oxidase; Beta-DGlucose:

Oxigen

1-oxido-reductase;

D-Glucose-1-oxidase;

Glucose

aerođehdrogenase; Glucose oxihydrase; GOD
Cấu trúc: là một glycoprotein với 2 phân tử FAD/mol GOD
Được tách, chiết từ nấm, mốc.
Khối lượng phân tử: 160000 (tính theo khối lượng các chuỗi acid amin)
Nhiệt độ tối ưu của enzym tự do: 30oC
pH tối ưu: 5,6
Các chất ức chế: bị ức chế bởi D-arabinoza và 2-deoxy-D-glucose. Ức chế
hoàn toàn bởi p-cloromercuribenzoat, ức chế một phần bởi 8-hydroxycholin,
NaNO3 và semicarbazit. Bị bất hoạt bởi H2O2, Ag+, Hg2+, Cu2+.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 12 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Độ bền:GOD dưới dạng khô không bị giảm hoạt tính trong nhiều năm khi cất
giữ ở nhiệt độ thấp. Dung dịch bảo quản ở +4oC không bị giảm hoạt tính trong vòng
12 tháng.
Đặc tính: enzym là chất đặc hiệu tuyệt đối để phát hiện và định lượng βGlucose.

I.2.2 Nguyên tắc của phản ứng điện hoá
Trong mẫu cảm biến đầu tiên của Clark và Lyons[2], phản ứng điện hoá xảy
ra như sau:

→ Gluconic acid + H 2 O2
Glu cos e + O2 GOx
H 2 O2 
→ O2 + 2 H + + 2e −

Khi glucose đehyrogenase (GDH) được hình thành, phản ứng điện hoá tiếp
tục diễn ra như sau:
GDH(ox) + D-glucose

→ GDH(red) + δ-glucolactone

Mediator(ox) + GDH(red)

→ Mediator(red) + GDH(ox)

Mediator(red)

→ Mediator(ox) + e-

Hình 1. 7 Sơ đồ cảm biến GOx
Điện thế được đặt giữa hai điện cực làm việc và điện cực so sánh, người ta sẽ
đo dòng chạy qua tế bào. Khi điện thế đạt đến một giá trị nào đó (thường là điện thế
oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện và các electron được sinh ra. Dòng điện
thu được sẽ tỉ lệ với độ tập trung của các phân tử bị oxi hoá.
I.2.3 Cố định enzyme
Kỹ thuật sử dụng để cố định enzyme là một trong những vấn đề quyết định

cho việc chế tạo một cảm biến GOx. Từ trước tới nay đã có nhiều phương pháp
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 13 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

khác nhau để cố định enzyme được sử dụng, bao gồm phương pháp hấp thụ, liên
kết hoá trị, dùng qua một enzyme đặc biệt và sử dụng bẫy trong gel hoặc chất nền
polyme[10-12].
Có nhiều kiểu kỹ thuật lắp ghép cho việc cố định protein như LangmuirBlodgett (LB)[13,14], một lớp tự lắp ghép [15], xếp lớp lần lượt trên điện cực
tĩnh[16,17,18].v.v..
Glutaraldehyde là một vật liệu thường được dùng như một loại enzyme đặc
biệt để bắc qua, nhưng một số hoá chất mới, ví dụ như chitosan, đã được sử dụng và
có tác dụng tốt [19]; màng mỏng kim cương ultranano-crystalline dẫn điện cùng
thực hiện với việc cố định enzyme của GOx qua phạm vi nhóm chức aminophenyl
được sử dụng giống như một nền thô cho một lớp mới của bề mặt vô cơ chung và
cảm biến điện hoá [20]. Có hai kiểu sol-gel được pha trộn trước đó là 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane với methyltrimethoxysilane hoặc tetraetthoxylane [21], ion
liquid-methylimidazolium hexafluophosphate với điều kiện chỉ có một môi trường
nhỏ cho việc cố định GOx [22], silica sáu cạnh, xốp sẽ giữ lại GOx bám trên đó làm
cho cảm biến hoạt động và có độ bền [23].
Những màng LB sử dụng cho việc cố định GOx, từ khi màng mỏng tự nhiên
kích cỡ nano có thể chế tạo thì độ nhạy của sensor được nâng cao, thời gian đáp
ứng nhanh, vì vậy xúc tác cũng cần phải cải tiến cho phù hợp [13]
Vật liệu polyme dẫn đã có những ứng dụng quan trọng và rộng khắp trong
chuẩn đoán lâm sàng và kiểm tra chất lượng môi trường[28-31]. Có rất nhiều thuận
lợi khi chế tạo sensor sử dụng polyme dẫn, sử dụng khả năng di chuyển của điện tử
thay đổi và một khả năng linh hoạt sẵn có trong cấu trúc hoá học của nó. Có nhiều
nghiên cứu chỉ ra rằng quá trình oxy hoá và sự khử enzyme có thể doping với nền
PPy[32], polyaniline[33], polythiophene[34] và được cố định trên bề mặt của điện
cực Pt, Au, GC[35,36].

I.2.4 Vật liệu nano
Vật liệu nano gần đây đã trở thành một chủ đề vô cùng phổ biến trong nghiên
cứu cảm biến điện hoá, vì chúng có tính dẫn điện, cấu trúc duy nhất, thuộc tính xúc
Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 14 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

tác, có thể chứa xúc tác sinh học cao, tính ổn định tốt và có khả năng thâm nhập đặc
biệt.
Ống CNT có thể sử dụng như một vật liệu điện cực với thuộc tính hữu ích
của nó có thể ứng dụng làm thiết bị sinh học thu nhỏ. Cảm biến điện hoá sử dụng
CNT được các nhà khoa học nghiên cứu rộng rãi và thu được kết quả ban
đầu[18,33-41]. Các cảm biến này có dòng đáp ứng cao, điện thế làm việc thấpvà ít
bị cản trở. Sợi nano carbon có thể hoà tan trong dung dịch và sử dụng để cải tiến
một cảm biến glucose, hoạt động ở điện thế làm việc thấp, có thể loại bỏ trở ngại và
hạn chế không giải quyết được của các chất nền khác khi sử dụng chúng làm cảm
biến điện hoá [42].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các hạt Au kích cỡ nano tỏ ra có khả
năng xúc tác sinh học đặc biệt, có hoạt tính xúc tác điện hoá rất cao không chỉ trong
sự khử H2O2 và phân tử oxygen mà còn trong quá trình oxi hoá của glucose nhờ có
cấu trúc mạng bằng các cột kích cỡ nano đó [43]. Các hạt phân tử Au được bao bọc
bởi nhóm sulfate làm tăng số lượng điện tử cố định của chất môi giới và bảo đảm
cho tính dẫn tốt của toàn bộ cấu trúc mạng [44]. Một phương pháp đo trực tiếp mới
cho kết quả rất nhanh là mục đích có thể đạt được khi tạo được màng mỏng Au cấu
trúc nano với trạng thái hoạt động của Au [45].
Một cảm biến đo dòng trên cơ sở màng composite gồm ống CNT, PPy gắn
trên điện cực tấm Pt có bề mặt là nhôm xốp kích thước nano đã được thử nghiệm.
Điện cực này cho phép tăng đáng kể diện tích bề mặt giúp cảm biến gắn được nhiều
enzyme hơn [46]. Trên những vi cảm biến khác, sử dụng PPy cấu trúc nano chứa

được nhiều “bẫy” Gox [47]. Đây là những cảm biến điển hình mà xúc tác sinh học
có hoạt tính tốt với glucose.
Trong điều kiện thực hiện đề tài luận văn, chúng tôi nghiên cứu chế tạo cảm
biến GOx trên cơ sở màng composite PPy pha tạp CNT.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 15 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

I.3 CẢM BIẾN ADN
Axit Desoxyribo Nucleic (ADN) là một phân tử sinh học đặc biệt quan trọng
đóng vai trò thiết yếu trong việc xác định đặc trưng di truyền, phân tử này lưu giữ
các thông tin di truyền cần thiết cho sự tái tạo đời sống sinh vật. Trong những năm
gần đây việc sử dụng các cảm biến điện hoá để phân tích ADN trong hoá học lâm
sàng đã có nhiều kết quả tốt.
Khái niệm cảm biến ADN điện hoá (the electrochemical ADN sensor) lần
đầu tiên được Millan và Mikkelsel đề xuất vào năm 1993 [48]. Lĩnh vực này nhanh
chóng gây được sự chú ý của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Cảm biến điện hoá
đến nay đã phát triển mạnh, có thể đọc và phân tích ngay các tín hiệu ghi nhận. Chuỗi
xoắn kép ADN được hình thành trên bề mặt điện cực do quá trình ghép cặp bổ xung giữa
các bazơ của chuỗi dò (probe) và chuỗi đích (target) được gọi là sự lai hoá. Việc chuyển
sự lai hoá thành tín hiệu đọc được thực hiện bởi transducer theo rất nhiều nguyên lý như
điện hoá [49], quang học [50], phân tích khối lượng (QCM) [51], điện [52],v.v...Trong
đó, nguyên lý điện hoá được xem là hướng có nhiều triển vọng, bởi thời gian đáp ứng
nhanh, đơn giản và chi phí thấp. Phương pháp phân tích ADN theo nguyên lý điện hoá
có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống (Phương pháp phân tích
đồng vị phóng xạ và phân tích huỳnh quang) như giảm thiểu thời gian phân tích, đơn
giản về mặt kỹ thuật và thao tác phân tích.
I.3.1 Thành phần cấu tạo của ADN[53]:

ADN bao gồm ba thành phần: axit photphoric, phân tử đường (vòng 5
Carbon) và bazơ chứa nitơ. Trong đó, axit photphoric đóng vai trò kết nối giữa các
cụm (bazơ + phân tử đường) với nhau hình thành chuỗi nuclêôtit.
Bazơ: bao gồm bốn loại bazơ khác nhau: Cytosin (C), Guanin (G), Thymin
(T), Adenin (A). Trong đó bazơ C, T thuộc nhóm pyrimidin và bazơ A, G thuộc
nhóm purin. (hình 1.8)

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008


- 16 Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Trình tự sắp xếp của các bazơ trong chuỗi ADN được xem như tổ hợp chập
hàng trăm nghìn của bốn phần tử (A, C, T, G) đã tạo nên sự phong phú của gen đặc
trưng ở muôn loài sinh vật
Phân tử đường: Có hai loại phân tử đường trong các axit nucleic, đó là
Ribose và Desoxyribose khi mất một oxi. Trong ADN tồn tại dạng Desoxyribose.

Cấu trúc của ADN:
ADN có cấu trúc đa phân gồm nhiều đơn phân là các nucleôtit, mỗi nuclêôtit
gồm ba thành phần: axit photphoric, phân tử đường 5 cacrbon và bazơ chưa nitơ.
Các nuclêôtit nối với nhau bằng các liên kết hoá trị (phosphodiester) tạo thành chuỗi
polynuclêotit. Một phân tử ADN có số lượng rất lớn các nuclêotit.
Chuỗi ADN (Axid Desoxyribo Nucleic) gồm hai mạch đơn cùng xoắn đều
quanh một trục theo chiều từ trái sáng phải tạo thành hình trụ. Các bazơ trong chuỗi
cách nhau trung bình 3,4A0, Chiều dài của một vòng xoắn là 34A0, đường kính trụ
20A0. Nếu có sự biến đổi liên quan dến một hoặc một số cặp nuclêôtit, xảy ra tại
một điểm nào đó của phân tử ADN thì đó chính là đột biến gen..
Chuỗi xoắn kép ADN được hình thành bởi hai mạch đơn song song ghép cặp
đối diện nhau. Trong đó, mỗi bazơ trong mạch đơn này được liên kết với một bazơ của

mạch kia theo nguyên tắc ghép cặp bổ sung A với T, C với G. Chiều của mỗi mạch đơn
được quy định từ 3’ đến 5’. Do đặc điểm về cấu trúc không gian và sự tương tác ghép cặp
liên kết giữa các bazơ nên hai mạch đơn được ghép song song đối diện phải có chiều
ngược nhau. Nếu chiều của mạch đơn thứ nhất từ 3’ đến 5’ thì chiều của mạch đơn thứ hai
phải từ 5’ đến 3’. Do vậy tạo thành sự xoắn của chuỗi kép (hình 1.7)

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008