Nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng acinetobacter baumannii phân lập tại bệnh viện phổi trung ương
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.11 MB, 90 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
LƯU THỊ NGỌC HÂN
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG
KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter
baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
LƯU THỊ NGỌC HÂN
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG
KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter
baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM BẢO YÊN
Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ
Phạm Bảo Yên, người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn cao học. Xin chân thành cám ơn cô vì đã luôn tận tình hướng
dẫn, truyền đạt kiến thức để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Trường đại học khoa học tự nhiên, các cán bộ
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Khoa Vi sinh Bệnh
viện Phổi Trung Ương cùng các thành viên nhóm nghiên cứu của đề tài Q6.17.60 đã
tạo điều kiện và môi trường cho tôi thực hiện nghiên cứu. Xin cảm ơn các bạn sinh
viên trong Phòng Thí nghiệm Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học đã giúp
đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên đã truyền đạt những kiến thức quý báu và hỗ trợ cho tôi hoàn thành
chương trình đào tạo thạc sĩ.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp tại Trung tâm
kiểm nghiệm Thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội đã luôn tạo điều kiện, cổ vũ và
động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Mặc dù đã cố gắng nỗ lực, nhưng luận văn không tránh khỏi những thiếu sót và hạn
chế. Rất mong nhận được những đóng góp từ thầy cô, các nhà khoa học để tôi tiếp
tục hoàn thiện công trình nghiên cứu.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2019
Học viên
Lưu Thị Ngọc Hân
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt, ký hiệu
A. baumannii
AMEs
CDC
CTX-M
DMSO
DNA
dNTP
ECDC
Fw
GES
ICU
IMP
KPC
LAMP
LPS
MATE
MDR
MFS
MIC
OXA
PBP
PCR
PDR
RNA
RND
Rv
SHV
SIM
SMR
TEM
VAP
VEB
VIM
WHO
XDR
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Các vị trí tác dụng của kháng sinh …………………………………………4
Hình 2: Cấu trúc hóa học của carbapenem………………………………………….9
Hình 3: Hình ảnh tế bào vi khuẩn A. baumannii …………………………………..12
Hình 4: Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường thạch……………………………13
Hình 5: Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii…………………………..19
Hình 6: Nguyên tắc của kỹ thuật multiplex PCR…………………………………..25
Hình 7: Chu trình nhiệt đã được tối ưu của phản ứng multiplex PCR……………..31
Hình 8: Kết quả của phản ứng multiplex PCR……………………………………..33
Hình 9: Biểu đồ tỷ lệ % của các gen nghiên cứu…………………………………..34
Hình 10: Tỷ lệ % kháng carbapenem của các mẫu A. baumannii nghiên cứu…….40
Hình 11: Mức độ kháng của A. baumannii với các kháng sinh nhóm beta-lactam .42
Hình 12: Mức độ kháng của A. baumannii với một số kháng sinh khác…………..43
Hình 13: Kết quả giải trình tự gen OXA-51 với mồi xuôi và so sánh kết quả giải
trình tự với ngân hàng gen…………………………………………………...…….47
Hình 14: Mức độ tương đồng về nucleotide……………………………………….49
Hình 15: Mức độ tương đồng về acid amin………………………………………..50
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học………………………………..3
Bảng 2: Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii…………19
Bảng 3: Bảng danh mục các kháng sinh được sử dụng làm kháng sinh đồ để đánh giá
mức độ nhạy cảm của Acinetobacter spp…………………………………………....29
Bảng 4: Trình tự các cặp mồi cho các gen OXA-23, OXA-51, VIM và IMP………..30
Bảng 5: Các thành phần tham gia phản ứng multiplex PCR………………………..31
Bảng 6: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-51 trên thế giới và Việt Nam.……..34
Bảng 7: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-23 trên thế giới và Việt Nam ……….36
Bảng 8: Tổng hợp các tổ hợp gen đích……………………………………………...39
Bảng 9: Kết quả PCR và kháng sinh đồ của các mẫu A. baumannii…….…………44
Bảng 10: Kết quả PCR và kháng sinh đồ một số chủng được giải trình tự………….48
Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide và acid amin so với trình tự tham chiếu………….48
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU………………………………………………………...………………….1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1
Kháng sinh …………………………………...……………………………...3
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học…………………..3
1.1.2. Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh……………………………………...4
1.1.2.1. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein…….……….…….…………………5
1.1.2.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic………………..………………..5
1.1.2.3. Kìm hãm các quá trình trao đổi chất……………………………………..…..6
1.1.2.4. Tác động lên thành tế bào vi khuẩn……………………………………..……6
1.1.2.5. Tác động lên màng tế bào vi khuẩn……………………………………….…7
1.1.3. Kháng sinh nhóm beta-lactam………………………………………………..7
1.1.3.1. Penicilin ………………………………………………………….………....8
1.1.3.2. Cephalosporin ..…………………………………………………………..…8
1.1.3.3. Monobactam……………………………………………………...………....9
1.1.3.4. Carbapenem …………………………………………………………...……9
1.1.3.5. Nhóm ức chế beta-lactamase…………………………………………….....10
1.1.4. Phối hợp kháng sinh trong điều trị ..…………………………………………10
1.2. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii…………………………..…………….11
1.2.1. Giới thiệu chung và vị trí phân loại…………………………………………11
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa………………………………………12
1.2.3. Dịch tễ học……………………………………………………………..……13
1.2.4. Thực trạng kháng kháng sinh của A. baumannii………………………..…...15
1.2.4.1. Trên thế giới………………………………………………………………...15
1.2.4.2. Tại Việt Nam………………………………………………………………..16
1.2.4.3. Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii……………………………17
1.2.4.4. Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase…………………………………19
1.2.4.5. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii…………21
1.3. Các phương pháp nghiên cứu A. baumannii ………………………….…… 22
1.3.1. Phương pháp nuôi cấy………………………………………………………22
1.3.2. Phương pháp sinh học phân tử………………………………………………24
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.
Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………..27
2.2.
Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………….27
2.2.1. Nuôi cấy và định danh A. baumannii từ mẫu bệnh phẩm …………..………27
2.2.1.1. Nguyên tắc……………………………………………………………..…..27
2.2.1.2. Hóa chất sinh phẩm………………………………………………………...27
2.2.1.3. Các bước tiến hành…………………………………………….…………...27
2.2.2. Tách DNA …………………………………………………………..………28
2.2.3. Kháng sinh đồ ………………………………………………………………28
2.2.4. Multiplex PCR ……………………………………………………………...30
2.2.4.1. Hóa chất, thiết bị …………………………………………………………...30
2.2.4.2. Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR……………………………………….30
2.2.4.3. Các cặp mồi sử dụng ……………………………………………………….29
2.2.4.4. Thành phần phản ứng………………………………………………………31
2.2.4.5. Chu trình nhiệt ……………………………………………………………..31
2.2.4.6. Điện di ……………………………………………………………………..31
2.2.5. Phân tích kết quả…...………………………………………………….…….32
2.2.5.1. Phân tích trình tự DNA ………………………………..…………………...32
2.2.5.2. Xử lý số liệu…….……………………………………………..………...…32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A. baumannii tại Bệnh viện
Phổi Trung ương ……….………………………………………….33
3.1.1 Tần suất xuất hiện các gen đơn……………………………………………….33
3.1.2 Sự có mặt của các tổ hợp gen …………………………………………………38
3.2. Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A. baumannii thu được…39
3.2.1. Khả năng kháng beta-lactam carbapenem …………………………………..39
3.2.2. Các nhóm beta-lactam khác ………………………………………………...41
3.2.3. Các kháng sinh khác………………………………………………………...42
3.2.4. Đánh giá chung……………………………………………………………...43
3.3. So sánh kết quả về sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa
trên kháng sinh đồ và xác định mối liên quan ……………………………..….44
3.4. Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp
và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên
thế giới………………………………………………………………………….47
3.4.1. Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ chính xác của phương pháp……….47
3.4.2. Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số chủng
khác trên thế giới……………………………………………………… 48
KẾT LUẬN…………………………………...…………………………………...51
KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO………...…………….52
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………..…53
MỞ ĐẦU
Kháng sinh là một trong những phát hiện vĩ đại trong lịch sử loài người. Với khả
năng kìm hãm và tiêu diệt tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là vi khuẩn, kháng sinh đã
trở thành loại thuốc không thể thiếu trong công tác điều trị ở mọi nơi trên thế giới. Việc
sử dụng kháng sinh không chỉ cứu sống bệnh nhân mà còn giúp ngăn ngừa các dịch
bệnh bùng phát trên toàn cầu. Tuy nhiên, trong nhiều năm trở lại đây, tình hình kháng
kháng sinh đang ngày càng gia tăng với tốc độ nhanh chóng và biến đổi phức tạp. Các
vi khuẩn không ngừng biến đổi để thích nghi và đề kháng lại các loại kháng sinh. Hiện
nay trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều chủng đa kháng thuốc thậm chí có những chủng
đã trở thành siêu kháng và toàn kháng. Điều này đã và đang trở thành một thách thức
lớn trong công tác điều trị bệnh ở các bệnh viện trên mọi châu lục.
Năm 2017, tổ chức Y tế thế giới WHO đưa ra danh sách 12 loài vi khuẩn nguy hiểm
nhất với khả năng kháng thuốc kháng sinh mạnh và cần phải nghiên cứu phát triển một
loại kháng sinh mới để đối phó với các tác nhân này. Trong đó ba loại vi khuẩn có khả
năng kháng carbapenem đứng đầu danh sách bao gồm: Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeroginosa, Enterobacteriaceae . A. baumannii đang được xếp ở vị trí số
một với mức báo động cao tại nhiều nơi trên thế giới với khả năng kháng với hầu hết
kháng sinh kể cả những kháng sinh phổ rộng mạnh nhất. A. baumannii có nhiều cơ chế
kháng kháng sinh như tổng hợp beta-lactamase, bơm đẩy ngược thuốc ra bên ngoài tế
bào, chỉnh sửa cấu trúc aminoglycoside, thay đổi tính thấm thành tế bào vi khuẩn, thay
đổi vị trí đích của thuốc. Trong đó cơ chế kháng beta-lactam dựa trên khả năng thủy
phân và ức chế các kháng sinh của các beta-lactamase đóng vai trò quan trọng nhất đối
với tính đa kháng sinh ở A. baumannii, đặc biệt đối với carbapenem-liệu pháp cuối
cùng trước khi phải chỉ định colistin.
Ở
Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào mức độ
kháng của
A. baumannii đối với các kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị dựa
trên
kháng sinh đồ và thống kê tần suất của các chủng gây bệnh hoặc đưa ra tần suất xuất
hiện các gen mà chưa xem xét đối mối liên quan giữa các yếu tố này. Tuy nhiên, với
tình hình kháng kháng sinh mạnh của vi khuẩn do sự lan rộng của các gen mã hóa
carbapenemase, việc kết hợp phân tích giữa mối liên quan của kháng sinh đồ với sự
1
có mặt của các gen liên quan đến tính nhạy cảm với kháng sinh là rất cần thiết trong hỗ
trợ, chẩn đoán và điều trị bệnh. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một
số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng Acinetobacter
baumannnii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung ương” với các mục tiêu:
1.
Thống kê tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A.
baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương.
2.
được.
Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A. baumannii thu
3.
Nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng kháng carbapenem với sự
có mặt bốn gen đích mã hóa carbapenemase. So sánh kết quả về sự có mặt
của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ.
4.
Phân tích tính trình tự của một số mẫu để khẳng định độ chính xác
của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được với các
chủng khác trên thế giới.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học
Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial
substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes),
có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [58].
Theo quan điểm hiện đại, kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng
khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamid và quinolon.
Hiện nay, có nhiều cách để phân loại kháng sinh nhưng cách phân loại phổ
biến nhất là dựa trên cấu trúc phân tử, cơ chế tác động và phổ hoạt động của từng
kháng sinh. Một vài cách phân loại khác trong đó có thể bao gồm đường đưa thuốc
(đường tiêm, đường uống hay đường đặt trực tràng…). Kháng sinh trong cùng một
nhóm cấu trúc sẽ thể hiện các đặc tính tương tự như nhau về hiệu quả tác dụng, độc
tính và cả tác dụng không mong muốn.
Bảng 1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [58,20]
STT
Tên nhóm
1
Beta-lactam
2
Aminoglycosid
3
Macrolid
4
Lincosamid
5
Phenicol
6
Tetracyclin
7
Peptid
8
Quinolon
9
Sulfamide
10
Các nhóm
sinh khác
1.1.2. Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh
Hoạt tính kháng khuẩn của hầu hết các nhóm kháng sinh đều liên quan trực tiếp
đến các đặc tính điển hình của cấu trúc vi khuẩn hoặc các quá trình trao đổi chất của
chúng. Để tìm hiểu vị trí tác dụng của một loại kháng sinh cụ thể trước hết phải nắm
được cấu trúc của kháng sinh và nơi nó có thể gắn kết (Hình 1). Hầu hết các đích của
kháng sinh thường liên quan trực tiếp đến tế bào vi khuẩn thông qua việc ức chế quá
trình sinh trưởng của tế bào hoặc ức chế hình thành vật liệu di truyền [16].
Hình 1. Các vị trí tác dụng của kháng sinh [16]
4
1.1.2.1. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Kháng sinh ngăn cản sự khởi đầu quá trình tổng hợp protein bằng cách gắn
vào tiểu đơn vị ribosom 30S và 50Svới các cơ chế bao gồm:
Liên kết không đảo ngược với ribosom 30Svà ngăn cản phức hệ khởi đầu 30S (30SmRNA-tRNA): Các aminoglycosid (diệt khuẩn).
Liên kết có thể đảo ngược với ribosom 30S và ức chế quá trình liên kết aminoacyl-tRNA với vị trí tiếp nhận trên ribosom 70S: Các tetracycline (kháng khuẩn).
Cản trở có thể đảo ngược quá trình tương tác giữa mRNA và ribosom 30S mà không
gây sai sót trong dịch mã mRNA như các aminoglycoside: spectinomycin (kháng
khuẩn).
Liên kết với ribosom 50S ức chế hoạt tính của peptidyl transferase: lincomycin,
clindamycin, cloramphenicol (kháng khuẩn)
Ức chế quá trình chuyển vị trí của peptidyl tRNA từ vị trí A đến P trên ribosom bằng
cách liên kết với ribosom 50S-23S RNA: các marcrolid (kháng khuẩn)
Ngoài cơ chế trên, các kháng sinh còn có khả năng tác động lên quá trình kéo
dài chuỗi peptid nhờ vào liên kết với yếu tố kéo dài G (EF-G) và ức chế giải phóng
EF-G từ phức hệ EF-G/GDP: acid fusidic (kháng khuẩn)
1.1.2.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic
Kháng sinh có thể tác động quá trình sinh tổng hợp acid nucleic bao gồm cả
sinh tổng hợp RNA và DNA.
Quá trình ức chế sinh tổng hợp RNA nhờ vào liên kết với các RNA
polymerase độc lập với DNA và ức chế sự khởi đầu tổng hợp RNA: rifampin,
rifamycin, rifampicin (diệt khuẩn).
Đối với sinh tổng hợp DNA, kháng sinh liên kết với tiểu đơn vị A của DNA
gyrase (topoisomerase) và ngăn cản quá trình siêu cuộn xoắn của DNA bởi vậy ức
chế quá trình tổng hợp DNA: quinolon, fluoroquinolone, acid oxolinic (diệt khuẩn).
Bên cạnh cơ chế ức chế quá trình sinh tổng, một số kháng sinh còn là các tác
nhân làm suy yếu chức năng của khuôn DNA. Về mặt lý thuyết không có loại nào trong
số các tác nhân trên được sử dụng trong trị liệu. Cơ chế của chloroquine và miracil D
(lucanthone) là ức chế plasmodia và schistosome tương ứng bằng cách xen
5
kẽ vào DNA và từ đó dẫn đến ức chế tổng hợp acid nucleic. Thuốc nhuộm acridine
như proflavine cũng hoạt động theo cơ chế xen kẽ, nhưng vì chúng có độc tính và
gây ung thư ở động vật có vú nên chúng cũng không được sử dụng làm chất kháng
khuẩn. 1.1.2.3. Kìm hãm các quá trình trao đổi chất
Cơ chế này thông qua quá trình ức chế sinh tổng hợp acid folic. Đây là chất
rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cả acid nucleic và acid amin. Một số
loại kháng sinh như sulphonamid và trimethoprim thể hiện tính chất như một cơ
chất giả cần thiết cho quá trình trao đổi chất ở tế bào vi khuẩn. Cơ chế này làm cho
enzyme của vi khuẩn gắn với kháng sinh thay vì gắn với cơ chế thông thường. Cụ
thế đối với sulfonamid, đóng vai trò như tetrahydrofolate là một thành phần quan
trọng trong việc tổng hợp acid folic ở tế bào vi khuẩn.
Các chất tương tự acid para-aminobenzoic ức chế cạnh tranh đối với sự hình
thành acid folic: sulfonamid, sulfone, para-aminosalicylic, depsone (kháng khuẩn).
Liên kết với dihydrofolate reductase và ức chế sự hình thành acid tetrahydrofolic:
trimethoprim, methotrexate, pyrimethamine (kháng khuẩn).
1.1.2.4. Tác động lên thành tế bào vi khuẩn
Kháng sinh đại diện cho cơ chế ức chế sinh tổng hợp acid mycolic, một thành
phần của thành tế bào vi khuẩn, là isoniazid. Tuy nhiên cơ chế chính tác động lên thành
tế bào vi khuẩn của kháng sinh đó là quá trình ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.
Quá trình tổng hợp peptidoglycan diễn ra theo ba bước, và mỗi bước đều có thể trở
thành đích tác động của kháng sinh. Trong đó giai đoạn thứ ba của quá trình tổng hợp
thành tế bào bao gồm quá trình polymer hóa và gắn peptidoglycan mới sinh vào thành
tế bào là giai đoạn tác động chủ yếu của kháng sinh. Giai đoạn này có sự tham gia của
các PBP đó là các enzyme thuộc họ transglycosylase và transpeptidase. Hai loại
enzyme này đóng vai trò then chốt trong việc hình thành peptidoglycan bằng cách thêm
các pentapeptide disaccarid để mở rộng chuỗi glycan của phân tử peptidoglycan đã có
và cả chuỗi liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan chưa trưởng thành. Các loại
thuốc thuộc nhóm beta-lactam như penicillin, carbapenem và cephalosporin có thể
ngăn chặn liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan bằng cách ức chế sự hình thành
liên kết peptide được xúc tác bởi các PBP.
6
1.1.2.5. Tác động lên màng tế bào vi khuẩn
Kháng sinh có thể thay đổi tính thấm của màng với các ion natri và kali.
+
Valinomycin thay đổi tính thấm của màng đối với ion K của cả tế bào nhân sơ và
nhân chuẩn bởi vậy nó không phải là chất kháng khuẩn được dùng trong hóa trị liệu.
Tuy nhiên monensin (ở gia súc) và salinomycin (ở heo) được sử dụng rộng rãi trong
thú y và có thể tức chế cả vi khuẩn, protozoa và metazoan ký sinh. Ngoài ra một số
nhóm kháng sinh có thể liên kết với màng tế bào chất và khử cực, ví dụ như
daptomycin khử cực màng phụ thuộc canxi, và điều đó dẫn đến sự ngừng tổng hợp
đại phân tử và phá vỡ màng tế bào ở vi khuẩn.
Một đích tác dụng quan trọng khác của kháng sinh trên màng tế bào đó là
LPS. Kháng sinh sẽ liên kết với LPS để phá hủy lớp màng ngoài. LPS có vài điểm
tích điện âm có khả năng tương tác với các kháng sinh cyclopeptid như polymyxin
và colistin tích điện dương, ngoài ra một vài phản ứng kỵ nước giữa hai phân tử
cũng dẫn tới làm phân ra lớp màng ngoài.
Các kháng sinh nhóm polyen tạo kênh ion giả gắn với màng sterol của màng
tế bào nấm tạo ra phức hệ màng-polyen có thể thay đổi tính thấm của màng, dẫn tới
làm thất thoát các thành phần của tế bào như ester phosphate, acid hữu cơ,
nucleotide và thậm chí cả các protein tế bào.
Cơ chế cuối cùng tác động lên màng tế bào là cản trở quá trình tổng hợp
màng lipid. Những kháng sinh này ức chế quá trình liên kết của các tiểu đơn vị tạo
thành ergosterol và có thể trực tiếp phả hủy màng tế bào nấm: các kháng sinh này
thuộc nhóm imidazoles: miconazole, ketoconazole, clotrimazole, và fluconazole.
1.1.3. Kháng sinh nhóm beta-lactam
Đây là nhóm kháng sinh lớn và được sử dụng rộng rãi trong công tác điều trị
tại nhiều nơi. Việc đặt tên là kháng sinh beta-lactam dựa trên cấu trúc phân tử có
vòng beta-lactam, một amid nội phân tử mà nhóm amin ở vị trí beta so với nhóm
chức acid. Các kháng sinh nhóm này gắn vào PBP và ngăn cản quá trình sinh tổng
hợp peptidoglycan ở thành tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị ly giải và chết. Nhóm
kháng sinh này bao gồm 5 phân nhóm là: penicillin, cephalosporin, monobactam,
carbapenem và nhóm chất ức chế beta-lactamase.
7
1.1.3.1. Penicillin [20,72]
Đây là nhóm được Alexander Fleming phân lập đầu tiên từ môi trường nuôi
cấy nấm Penicillium notatum. Dựa trên phổ tác dụng chúng được chia thành 4 loại:
Penicillin tự nhiên: Tác dụng mạnh trên các cầu khuẩn Gram (+) không sinh
penicillinase.
Penicillin kháng penicillinase: Có phổ hẹp, được nghiên cứu chỉ nhằm tiêu diệt các
tụ cầu sinh penicillinase mà loại penicillin tự nhiên không tác dụng.
Aminopenicillin: Có phổ mở rộng. Tác dụng tương tự như penicillin tự nhiên trên vi
khuẩn Gram (+) nhưng yếu hơn, tuy nhiên lại mở rộng tác dụng trên một số vi
khuẩn Gram (-) như Haemophilus influenza, Salmonella, Escherichia coli, …
Penicillin phổ rộng: loại này có tác dụng mạnh hơn các loại khác trên các vi khuẩn
Gram (-) (đặc biệt Pseudomonas và Proteus) do tăng tính thấm qua màng tế bào vi
khuẩn. Ưu điểm chủ yếu của nhóm này là có tác dụng lên Pseudomonas
aeruginosa. 1.1.3.2. Cephalosporin
Năm 1948, Abraham và cộng sự đã phân lập được từ môi trường nuôi cấy
nấm Cephalosporium acremonium hợp chất đặt tên là cephalosporin C. Hợp chất
này có tác dụng kháng khuẩn nhưng rất yếu, tuy nhiên nó lại chính là tiền đề cho
việc tổng hợp ra các loại cephalosporin sau này. Hiện nay có bốn thế hệ
cephalosporin được phân loại dựa trên phổ tác dụng đối với vi khuẩn Gram (-) và độ
bền của chúng đối với các beta-lactamase [72].
Thế hệ I: Tác dụng mạnh nhất trên các vi khuẩn Gram (+) và yếu nhất trên vi khuẩn
Gram (-). Không bền và dễ bị beta-lactamase phá hủy.
Thế hệ II: Gồm các chất tác dụng mạnh hơn trên vi khuẩn Gram (-) và yếu hơn trên
vi khuẩn Gram (+) so với thế hệ I, trong đó đáng chú ý và tác dụng mạnh hơn trên
H. influenza. Giống như thế hệ I, các chất thuộc thế hệ II không tác dụng lên P.
aeruginosa. Tuy nhiên chúng tương đối bền với beta-lactamase.
Thế hệ III: Tác dụng trên vi khuẩn Gram (+), đặc biệt tụ cầu, tuy nhiên kém hơn
cephalosporin thế hệ I, nhưng có phổ rộng tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (-).
Khả năng kháng beta-lactamase của vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn so với thế hệ II.
8
Thế hệ IV: Đây là các cephalosporin phổ rộng. Trên vi khuẩn Gram (+) chúng có
hoạt tính tương tự cephalosporin thế hệ I. Trên vi khuẩn Gram (-), do các
cephalosporin thế hệ IV là các ion lưỡng cực nên có thể thấm qua màng ngoài của vi
khuẩn Gram (-) và có tác dụng kháng beta-lactamase mạnh hơn thế III.
1.1.3.3. Monobactam
Các kháng sinh này là một phần của nhóm beta-lactam nhưng lại không như
các loại beta-lactam khác, vòng beta-lactam của monobactam chỉ đứng đơn độc thay
vì liên kết với các vòng khác. Aztreonam là loại kháng sinh monobactam duy nhất
được bán trên thị trường và chỉ có hoạt tính đối với vi khuẩn Gram âm hiếu khí như
Nesseria và Pseudomonas. Kháng sinh này được sử dụng để điều trị viêm phổi,
nhiễm trùng máu và nhiễm trùng đường tiết niệu do các nhóm vi khuẩn trên gây ra.
Monobactam không có hiệu quả đối với vi khuẩn gram dương hoặc vi khuẩn kỵ khí
[72].
1.1.3.4. Carbapenem
Hình 2. Cấu trúc hóa học của carbapenem [20]
Nhóm kháng sinh này được tìm ra vào năm 1976, chúng đóng vai trò rất
quan trọng trong việc chống lại các bệnh nhiễm khuẩn. Nguyên nhân là do chúng có
khả năng kháng lại được sự thủy phân của các enzyme beta-lactamase. Trong số
hàng trăm loại kháng sinh beta-lactam đã biết, carbapenem có phổ rộng nhất và có
hoạt tính mạnh lên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Hình 2). Chính bởi vậy
chúng thường được gọi là “sự lựa chọn cuối cùng” và chỉ được chỉ định khi tình
trạng của bệnh nhân trở nên trầm trọng hoặc nghi ngờ có sự kháng kháng sinh. Một
số đại diện trong nhóm này bao gồm:
9
Imipenem: có phổ tác dụng hiệu quả đối với cả tác nhân hiếu khí và kị khí, thường
dùng đường uống, hoạt động với liều thấp và ít tác dụng không mong muốn.
Meropenem: có phổ tác dụng hiệu quả lên trực khuẩn Gram âm, đặc biệt có với các
bệnh nhiễm khuẩn cơ hội.
Doripenem: có phổ tác dụng hiệu quả đáng kể đối với Pseudomonas aeruginosa
Ertapenem: có phổ tác dụng giới hạn với các trực khuẩn Gram âm không lên men. Tuy
nhiên, hiện nay tình trạng báo động về các vi khuẩn kháng lại dòng kháng
sinh hiệu quả này đã được ghi nhận. Đáng lo ngại hơn nữa, các vi khuẩn có khả
năng kháng carbapenem đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu và nhanh chóng trở
thành vấn đề đáng quan tâm của thế giới.
1.1.3.5. Nhóm ức chế beta-lactamase
Các chất này cũng có cấu trúc beta-lactam, nhưng không có hoạt tính kháng
khuẩn, mà chỉ có vai trò ức chế beta-lactamase của vi khuẩn bằng cách ức chế
không thuận nghịch nhiều beta-lactamase làm thay đổi enzyme, bất hoạt và không
cho chúng giải phóng trở lại. Các chất hiện hay được sử dụng trên lâm sàng là acid
clavulanic, sulbactam và tazobactam [72].
1.1.4. Phối hợp kháng sinh trong điều trị
Trên thực tế để nâng cao hiệu quả điều trị, việc phối hợp kháng sinh là rất
cần thiết nhằm mục đích [58]:
Làm giảm khả năng xuất hiện các chủng đề kháng.
Điều trị nhiễm khuẩn do nhiều chủng vi khuẩn gây ra.
Làm tăng khả năng diệt khuẩn.
Mỗi kháng sinh đều có ít nhiều tác dụng không mong muốn; khi phối hợp thì
những tác dụng phụ này cũng sẽ cộng lại hoặc tăng lên. Không nên hy vọng phối
hợp thì hạ được liều lượng từng thuốc vì có thể dẫn đến nguy cơ xuất hiện vi khuẩn
kháng kháng sinh. Phối hợp kháng sinh có thể dẫn đến tác dụng cộng (addition)
hoặc hiệp đồng
(synergism) hoặc đối kháng (antagonism) hay không thay đổi (indifference) so với
một thuốc đơn lẻ. Khi phối hợp, cần dùng đủ liều và nên lựa chọn những kháng sinh
có tính chất dược động học gần nhau hoặc có tác dụng hiệp đồng [58].
10
Việc phối hợp kháng sinh làm số kháng sinh cần sử dụng nhiều hơn dẫn đến
giá cả điều trị tăng cao và nhất là tỷ lệ bị tác dụng phụ do thuốc nhiều hơn nên cần
thận trọng và cân nhắc tối đa. Nên khu trú một số trường hợp cần phối hợp kháng
sinh, có thể kể như sau: Khi bị nhiễm nhiều loại vi khuẩn như bị áp-xe não, viêm
màng não có khi phải phối hợp 3 loại kháng sinh. Sốc nhiễm khuẩn hoặc nhiễm
khuẩn nặng trong khi chờ kết quả xét nghiệm cấy vi khuẩn, kháng sinh đồ (thường
phối hợp beta-lactam + aminosid). Nhiễm khuẩn giảm bạch cầu hoặc bị suy giảm
miễn dịch (có khi phải phối hợp tobramycin + ticarcillin). Nhiễm loại vi khuẩn đặc
biệt: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Listeria,
Enterococcus do các loại vi khuẩn này rất dễ đột biến tạo chủng đề kháng nên cần
phối hợp nhiều kháng sinh vì nếu dùng một loại kháng sinh rất dễ bị đề kháng.
Một trường hợp điển hình khác của việc phối hợp kháng sinh là sử dụng các
chất ức chế beta-lactamase kết hợp với kháng sinh beta-lactam. Hiện tại đây được
coi là biện pháp hiệu quả chống lại cơ chế kháng thuốc đặc hiệu của vi khuẩn. Phổ
kháng khuẩn của kháng sinh được mở rộng trên các chủng vi khuẩn đề kháng do
khả năng ức chế dẫn đến bất hoạt đa số beta-lactamase tiết ra bởi vi khuẩn gram âm,
gram dương và vi khuẩn kỵ khí.
1.2. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii
1.2.1. Giới thiệu chung và vị trí phân loại
A. baumannii được nhà vi sinh vật học Beijerinck người Hà Lan phân
lập lần
đầu tiên vào năm 1911 và được đặt tên là Micrococcus calcoaceticus. Trong 50 năm
tiếp theo, loại vi khuẩn này cũng đã được phân lập nhiều lần và được báo cáo dưới
nhiều
tên
khác
nhau
như:
Moraxella
lwoffi,
Alcaligenes
hemolysans,
Mirococcuscalco-aceticus, và Herellea vaginicola. Vào năm 1968, Baumann và
cộng sự đã xếp tất cả vào cùng chi Acinetobacter và được hội đồng phân loại học
chấp nhận [8].
Hiện nay theo vị trí phân loại, A. baumannii được xếp vào chi Acinetobacter,
họ Moraxellaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria [8].
11
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
A.
baumannii là cầu trực khuẩn Gram âm có đường kính từ 1-1,5 µm khi
quan
sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Gram. Loại vi khuẩn này kháng hoàn toàn với
các thuốc tẩy màu và vì vậy có thể gây ra nhầm lẫn là cầu khuẩn Gram dương.
Hình 3: Hình ảnh tế bào vi khuẩn A. baumannii [79]
Về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, đây là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, không có khả
năng lên men và dễ nuôi cấy. A. baumannii không có khả năng di chuyển và không sản
xuất ra các loại enzyme như cytochrome oxidase, urease, citrate, và indole tuy nhiên lại
o
có khả năng sinh enzyme catalase. Chúng sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 35 C
o
đến 37 C. Ngoài ra, A. baumannii là loài duy nhất có thể sinh trưởng
o
ở
44 C trong chi Acinetobacter. Về khả năng sinh trưởng, loài này phát triển tốt
trong
các môi trường nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm như: môi trường thạch
máu, thạch chocolate và thạch MacConkey. Trên môi trường thạch máu, chúng tạo
thành các khuẩn lạc không màu, hơi nhày, không gây tán huyết hoặc ở dạng kết cấu
o
nhẵn với đường kính từ 1-2 mm sau 18-24 giờ ủ ở 37 C. Trên môi trường thạch
MacConkey, các khuẩn lạc không màu, hơi nhày (Hình 4A). Trên môi trường thạch
chọn lọc Leeds Acinetobacter, khuẩn lạc có màu hồng nhạt (Hình 4B) [8].
12
A. Môi trường thạch máu [80]
B. Môi trường thạch chọn lọc Leeds A [81]
Hình 4: Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường thạch
A. baumannii nói riêng và các loài thuộc chi Acinetobacter nói chung là các
vi khuẩn sống tự do và phân bố rộng trong các môi trường khác nhau như: nước,
đất, nước thải, các loại rau củ và cả trên da người và động vật. Trong môi trường
bệnh viện, A. baumannii có thể được tìm thấy trên giường, rèm, tường, các dụng cụ
và thiết bị y tế và cũng có thể bám trên các dụng cụ chăm sóc cá nhân và thậm chí
cả máy vi tính. Vi khuẩn này có thể tồn tại lâu dài và tích lũy các gen kháng kháng
sinh ngay trong bệnh viện nhờ vào việc tồn tại ở trạng thái không hoạt động và khả
năng hình thành biofilm. Việc hình thành biofilm giúp cho A. baumannii có thể bám
vào bề mặt các sinh vật sống và cả các bề mặt khác [21]. Một số nghiên cứu đã chỉ
ra rằng khả năng hình thành biofilm của A. baumannii trên các bề mặt lỏng, rắn cao
gấp 3 lần so với các loài Acinetobacter khác, tạo thành một lớp màng dày rõ ràng ở
phía trên canh thang nuôi cấy. Đây chính là một trong những yếu tố quan trọng
trong việc tồn tại và gây bệnh của A. baumannii.
1.2.3. Dịch tễ học
A. baumannii là nhân tố gây bệnh có mặt khắp nơi và có khả năng gây
ra cả
bệnh nhiễm khuẩn cộng đồng và nhiễm khuẩn bệnh viện, mặc dù nhiễm khuẩn bệnh
viện phổ biến hơn. Vi khuẩn này gần đây đã được cảnh báo là nguyên nhân chính gây
nhiễm khuẩn bệnh viện với mức độ kháng kháng sinh cao và xu hướng có thể gây ra sự
bùng phát lớn trong các bệnh viện. Khả năng tạo biofilm và kháng đa kháng sinh đã
giúp cho A. baumannii tồn tại lâu dài trong môi trường bệnh viện tạo điều kiện cho việc
gây nên dịch. Đã có các báo cáo về A. baumannii đa kháng thuốc từ các bệnh
13
