(Luận văn thạc sĩ) phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người việt nam bằng kỹ thuật PCR RFLP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM MINH HUỆ

PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở
NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội-2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM MINH HUỆ

PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở
NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA
Hà Nội-2011


Mục lục
MỞ ĐẦU ................................................................................................................1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1. Ty thể và hệ gen của ty thể người ....................................................................3
1.1.1. Cấu trúc của ty thể người ..............................................................................3
1.1.2. Chức năng của ty thể người ..........................................................................5
1.1.3. Hệ gen ty thể người ....................................................................................... 9
1.2. Các loại đột biến trong hệ gen ty thể người và các bệnh liên quan ...............12
1.2.1. Đột biến điểm .............................................................................................. 12
1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên tRNA và rRNA ............................... 13
1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến trên mRNA ............................................14
1.2.2. Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA ...................................................... 15
1.2.3. Các loại đột biến khác của hệ gen ty thể .................................................... 19
1.3. Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể ..............................................20
1.3.1. Lai DNA ......................................................................................................20
1.3.2. PCR kết hợp RFLP (PCR-RFLP) ................................................................ 21
1.3.3. Xác định trình tự nucleotide ........................................................................22
1.3.4. PCR định lượng ........................................................................................... 23
1.3.5. Một số phương pháp khác ...........................................................................25
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........27
2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................27
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................28
2.2.1. Tách DNA tổng số từ máu theo kit của Qiagen ..........................................28
2.2.2. Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell ....................... 28
2.2.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại .... 29
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose.....................................................................29
2.2.5. Điện di DNA trên gel polyacrylamide......................................................... 30
2.2.6. Nhân bản đoạn gen bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ................... 30


2.2.7. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn
(PCR-RFLP) ..........................................................................................................31

2.2.8 .Nhân dịng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T .........................................32
2.2.9. Giải trình tự nucleotide bằng máy tự động theo phương pháp của Sanger....... 34
2.2.10. Phân tích số liệu bằng phần mềm Genetyx ...............................................35
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................36
3.1. Thu thập mẫu máu bệnh nhân và tách chiết DNA tổng số ............................ 36
3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích ........................................................... 36
3.1.2. Tách chiết DNA của các mẫu ......................................................................36
3.2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP .....37
3.2.1. Nhân đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR .................................................... 37
3.2.2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP ........38
3.2.3. Phân tích trình tự mất đoạn 9 bp trên gen ty thể ........................................41
3.3. Phân tích đột biến A3243A ............................................................................46
3.3.1. Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G ...................................................... 47
3.3.2. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP ............................................48
Kết luận và kiến nghị .......................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................54
PHỤ LỤC 1 ...........................................................................................................59
PHỤ LỤC 2 ...........................................................................................................62


Bảng các chữ viết tắt
Chữ viết
tắt
AID
Amp
APS
bp
CMV
CoE
COII

CoQ
CPEO
CSF
CytC
dd H2O
D-loop
dNTP
EBV
EDTA
EtBr
ETC
EtOH
EV
HVS
HVS1
IPTG
kb
LB
LHON
MCS

Tên tiếng Việt
Bệnh điếc không hội chứng được
cảm ứng bởi aminoglycoside
Ampicillin
Amonium persulphate
Cặp base
Coenzyme
Cytochrome c oxidase II
Coenzyme Q

Hội chứng liệt mắt cơ ngoài tiến
triển kinh niên
Dịch não tủy
Cytochrome c
Nước cất khử trùng loại ion
Vòng chuyển vị
Deoxynucleoside triphosphate
Axit ethylen Diamine Tetraacetic
Ethidium Bromide
Chuỗi vận chuyển điện tử
Ethanol
Vùng siêu biến
Isopropylthio-β-D
Galactopyranoside
Kilo base
Môi trường Luria Betani
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền
Leber
Trình tự nhân dịng đa điểm cắt

Tên tiếng Anh
Amino-glycoside-induced
nonsyndronic deafness
Ampicillin
Amonium persulphate
Base pair
Cytomegalovirus
Coenzyme
Cytochrome c oxidase II
Coenzyme Q

Chronic progressive external
ophthalmoplegia
Cerebrospinal fluid
Cytochrome c
Deionnized distilled H2O
Displacement loop
Deoxynucleoside triphosphate
Epstein-Barr virus
Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
Ethidium Bromide
Electron transport chain
Ethanol
Enterovirus
Hypervariable segment
Herpes simplex virus type 1
Isopropylthio-β-D
Galactopyranoside
Kilo base
Luria Betani
Leber herteditary optic neuropathy
Multiple Cloning Sequence


MELAS
MERRF
MIDD
mtDNA
MT-TL
NAD+
NADH

NARP
NCR
Ng
OD
PCR
RFLP
RLCH
ROS
SSCP
T
TAE
TBE
TEMED
Th
Ub
v/p
X-gal

Hội chứng não cơ ty thể, tăng acid
lactic máu và giả tai biến mạch
Hội chứng động kinh giật cơ với
các sợi đỏ nham nhở
Bệnh tiểu đường và điếc di truyền
theo dịng mẹ
DNA ty thể
Gen mã hóa cho RNA vận chuyển
leucine
Nicotinamide-adenine
dinucleotide (dạng oxi hóa)

Nicotinamide-adenine
dinucleotide (dạng khử)
Hội chứng gây liệt, mất sự điều
hịa và viêm võng mạc
Vùng khơng mã hóa
Ngày tuổi
Mật độ quang học
Phản ứng chuỗi polymerase
Sự đa hình các đoạn phân cắt giới
hạn
Rối loạn chuyển hóa
Dạng oxy phản ứng
Stranded Conformational
Polymorphism
Tuổi
(Đệm) Tris-Acetate-EDTA
(Đệm) Tris- Borate-EDTA
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
Tháng tuổi
Ubiquinon
Vòng/phút
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D
galactopyranoside

Mitochondrial Encephalopathy,
Lactic acidosis, Stroke-like episodes
Myoclonic epolepsy associated
with ragged-red fibres
Maternally inherited diabetes and
deafness

Mitochondrial DNA
Mitochondrially encoded tRNA
leucine
Nicotinamide-adenine
dinucleotide
(Reduced) Nicotinamide-adenine
dinucleotide
Neuropathy, ataxia and retinitis
pigmentos
Non coding region
Optical Density
Polymerase Chain Reaction
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Reactive oxygen species
Sự đa hình về cấu hình chuỗi đơn

Tris-Acetate-EDTA
Tris- Borate-EDTA
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
Ubiquinon
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D
galactopyranoside


Danh mục các hình
Hình 1: Các hình dạng khác nhau của ty thể...............................................................3
Hình 2: Cấu trúc màng trong ty thể .............................................................................4
Hình 3: Sơ đồ minh hoạ cơ chế của sự lão hố theo học thuyết ty thể .......................6
Hình 4: Sơ đồ minh họa cơ chế sản sinh các ROS trong ty thể ..................................7

Hình 5: Cấu trúc hệ gen ty thể người ........................................................................10
Hình 6: Các loại đột biến điểm phổ biến trên mtDNA .............................................13
Hình 7: Vị trí trình tự lặp lại 9 bp trên mtDNA ........................................................16
Hình 8: Chu kỳ nhiệt của PCR để nhân bản đoạn mtDNA (8155-8366) ..................31
Hình 9:Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose .............................36
Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ........................................38
Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide ...........................38
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide .........39
Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR ở một số gia đình bệnh nhân cắt bằng
BanII trên gel polyacrylamide ...................................................................................40
Hình 14: Kết quả điện di sản phẩm PCR hai gia đình bệnh nhân trên gel polyacrylamide 41
Hình 15: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR và vector pGEM-T .........41
vào E. coli chủng DH5α ............................................................................................41
Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc ...............................42
Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch plasmid trên gel agarose ...................43
Hình 18: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và bố bệnh
nhân gia đình III với trình tự chuẩn hệ gen ty thể cơng bố trên GenBank ..............44
Hình 19: Kết quả xác định trình tự của đoạn gen đích của gia đình III (A, B, C) ....45
Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose .......................................47
Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide ......... 48
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide ........50


Danh mục các bảng
Bảng 1: Một số mã di truyền của DNA ty thể khác DNA nhân ...............................11
Bảng 2: Một số hội chứng bệnh kèm theo sự mất đoạn 9 bp ....................................18
Bảng 3: Trình tự các cặp mồi dùng trong PCR .........................................................27
Bảng 4: Thành phần bản gel điện di polyacrylamide................................................30
Bảng 5: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn mtDNA (8155-8366) ...........31
Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn BanII .......................................32

Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn HeaIII .....................................32
Bảng 8: Thành phần phản ứng gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pGEM-T .........33
Bảng 9 : Thành phần phản ứng PCR lần 2 ................................................................34
Bảng 10: Danh sách bệnh nhân bị đột biến mất đoạn 9 bp .......................................46
Bảng 11: Hàm lượng axit lactic trong máu bệnh nhân bị mất đoạn 9 bp .................51



Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

MỞ ĐẦU
Ty thể là một cơ quan tử của tế bào nhân thực có vai trị tạo năng lượng dưới
dạng ATP cho các hoạt động sống của tế bào.
Ty thể có hê ̣ gen riêng với DNA dạng mạch vịng , kích thước 16,5 kb, chứa
37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển và 2 RNA ribosome của ty thể.
Các gen trong ty thể di truyền từ mẹ sang con.
Các protein do gen ty thể mã hóa tham gia vào quá trình trao đổi chất tr ong
ty thể cũng như chuỗi vận chuyể n điê ̣n tử trên màng trong của ty thể .
Ty thể là nơi xẩ y ra quá trin
̀ h oxy hóa phosphoryl hóa và nhiề u quá trin
̀ h hóa
sinh khác. Các quá trình này tạo ra các dạng oxy phả n ứng (reactive oxygen species)
và là nguyên nhân gây nên nhiều tổn thương trong cấu trúc DNA của ty thể.
Tỷ lệ đột biến cao, có kiểu thừa kế khác nhau và số bản sao lớn trên mỗi tế
bào là những đặc trưng chính của DNA ty thể (mtDNA). Nghiên cứu các đột biến
trong mtDNA là một trong những cách cho phép chúng ta hiểu được q trình tiến
hóa con người, cụ thể là về nguồn gốc, quan hệ họ hàng, khả năng giao phối với họ
khác, sự di cư và nhập cư tới những vùng mới của thế giới.

Một loạt các loại hội chứng và bệnh tật, trong đó có q trình già hóa ung
thư, hiện tượng chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) có nguyên nhân liên
quan đến đột biến trong hệ gen ty thể. Các đột biến trong hệ gen ty thể, cho dù là
một đột biến điểm nucleotide, đứt đoạn hay đảo đoạn, thường xảy ra ở các loại mô
bào cần năng lượng như cơ, tim, thận, tuyến nội tiết và đều ảnh hưởng lớn đến chức
năng của chúng đối với cơ thể.
Năm 1988, đột biến đầu tiên gây bệnh trên hệ gen ty thể người được biết đến
và ngày nay hơn 270 đột biến gây bệnh trên hệ gen ty thể người đã được phát hiện.
Các đột biến trong mtDNA ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp ATP của tế bào
và từ đó ảnh hưởng đến hầu như tất cả các hệ thống cơ quan. Tuy nhiên, các tế bào
và các cơ quan bị ảnh hưởng nhiều nhất là những bộ phận có mức tiêu thụ năng
lượng cao như não bộ, cơ xương và tim. Nhiều đột biến mtDNA xuất hiện là
nguyên nhân chủ yếu gây mất chức năng cơ, thần kinh.
Không phải tất cả các phần của genome ty thể phát triển ở cùng một mức độ
đột biến, phần thay đổi thường xuyên nhất của mtDNA là phần khơng mã hóa, phần
nằm trong vùng điều khiển gọi là D-loop (chứa hai vùng siêu biến HVR1 và HVR2
Lớp Cao học K18

1

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

chiếm khoảng 7% genome ty thể). Một trong những phần khơng mã hóa được coi là
chỉ thị sinh học đặc trưng cho nguồn gốc các tộc người là phần trình tự lặp lại 9 bp
nằm trong vùng V giữa gen mã hóa cho cytochrome c oxidase (COII) và tARNLys. Tuy

nhiên, đây cũng là vùng đặc trưng cho những đột biến mất đoạn ở các bệnh nhân bị
hội chứng bệnh ty thể.
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về genome ty thể chưa được quan tâm nhiều.
Việc nghiên cứu đột biến trong hệ gen ty thể có ý nghĩa lớn, góp phần làm sáng tỏ
nguyên nhân của nhiều bệnh di truyền và chuyển hóa cũng như đánh giá mối quan
hệ tiến hóa, di truyền trong quần thể. Trên cơ sở đó, chúng tơi thực hiện đề tài:
“Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCRRFLP”, trong đó chúng tôi tập trung nghiên cứu về đột biến mất đoạn 9 bp
CCCCCTCTA trong vùng khơng mã hóa (vùng V) nằm giữa gene mã cho
cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã hóa cho phân tử RNA vận
chuyển Lysine (tRNALys). Ngồi ra, chúng tơi cũng đồng thời nghiên cứu đột biến
điểm A3243G và A8344G được chứng minh là chiếm khoảng 80% số ca mang hội
chứng tương ứng là MELAS và MERRF, qua đó đánh giá khả năng liên quan giữa
sự mấ t đoa ̣n 9 bp và khả năng bị các đô ̣t biế n phổ biến này .

Lớp Cao học K18

2

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ty thể và hệ gen của ty thể ngƣời
1.1.1. Cấu trúc của ty thể người
Ty thể là một bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật trừ tế bào hồng cầu,
bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX. Năm 1857, Kolliker (nhà giải phẫu

học người Thụy Sĩ) lần đầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế bào cơ. Hơn 30 năm
sau (năm 1890), nhà mô học người Đức Richard Altmann bằng phương pháp
nhuộm fuchsin đã quan sát thấy ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi
quang học [46].
Hình dạng đặc trưng của ty thể là thon dài với đường kính 0,5-2 µm và chiều
dài 7-10 µm, tuy vậy, phụ thuộc vào trạng thái tế bào, loại tế bào ty thể có hình
dạng và kích thước khác nhau (hình 1). Ty thể có khả năng thay đổi kích thước,
hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành
những cấu trúc ngắn hơn. Ngồi ra ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với
những thay đổi sinh lý trong tế bào.

A

B
C
Hình 1: Các hình dạng khác nhau của ty thể [46]
A: dạng thon dài, B và C: dạng bị biến đổi

Trong tế bào, ty thể nằm rải rác ở nguyên sinh chất nhưng cũng có thể nằm
tập trung ở khu vực cần nhiều năng lượng như đuôi của tinh trùng. Tương tự, số
lượng của ty thể ở một tế bào cũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của
tế bào đó, có thể từ vài ty thể ở tế bào da cho đến vài nghìn ty thể ở tế bào cơ.

Lớp Cao học K18

3

Khóa 2009-2011

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, tương tự màng sinh chất:
màng ngoài và màng trong. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, cịn
khoang giữa hai màng được gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào
chất nền tạo thành các mào răng lƣợc.
Màng ngoài ty thể chứa nhiều enzyme quan trọng khác như: kinase,
cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase.
Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein với 80% là protein 20% là
lipid. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược và làm tăng diện
tích bề mặt gấp ba lần so với màng ngoài. Màng trong chứa nhiều protein vận
chuyển chủ động ATP, ADP, axit béo… và các protein kênh vận chuyển các ion
Na+, K+, Ca2+ và H+. Hơn nữa, màng trong là nơi bám của bốn phức hợp (I, II, III và
IV) thuộc chuỗi vận chuyển điện tử có vai trị xúc tác cho q trình oxy hóa
phosphoryl hóa tổng hợp nên ATP [27].

Hình 2: Cấu trúc màng trong ty thể [27]
Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi
trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất
nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử [27].
Trong màng trong là vùng chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của
chu trình Krebs, protein, ribosom, tRNA và bộ máy di truyền riêng của ty thể: hệ
gen ty thể (mtDNA). Như vậy, ở các động vật, thực vật và người ngoài hệ gen nhân,
cịn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể.
Lớp Cao học K18

4

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

Khi đạt kích thước lớn tối đa, ty thể tiến hành phân đôi để tạo ra hai ty thể mới.
Trước tiên, hệ gen ty thể được sao mã để tăng số lượng bản sao. Sau đó, màng trong
thắt lại trước rồi đến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty
thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy).
Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào.
1.1.2. Chức năng của ty thể người
Ty thể được xem là nhà máy sản xuất năng lượng của tế bào [27]. Thức ăn
hàng ngày cơ thể hấp thụ được oxi hóa để tạo ra các chất khử giầu năng lượng mà
sau đó được chuyển thành năng lượng dự trữ ở dạng liên kết phosphate cao năng
trong ATP. Khoảng hơn 90% ATP của cơ thể được tạo thành trong ty thể. Có hai
giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong vùng chất nền và
q trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm trên màng trong
ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme.
Thức ăn khi đưa vào cơ thể được chuyển hóa thành đơn vị hóa học cơ bản
mà tế bào có thể sử dụng. Ví dụ, bánh mỳ, cơm được chuyển thành đường đơn
glucose. Sau đó, glucose được đưa vào tế bào và bắt đầu con đường biến đổi thành
năng lượng dự trữ ATP. Giai đoạn đầu tiên, con đường đường phân, glucose được
chuyển thành pyruvate và ATP từ ADP và NADH từ NAD+. Giai đoạn này diễn ra
ở tế bào chất bên ngoài ty thể nên chưa thể hiện rõ vai trò của ty thể trong tổng hợp
năng lượng. Vai trò này chỉ được thể hiện rõ ở hai giai đoạn còn lại là chu trình
Krebs và chuỗi vận chuyển điện tử kết hợp tổng hợp ATP.
Pyruvate sau khi được chuyển thành acetyl-CoA, tiếp tục được oxi hóa đến
tận cùng tạo thành CO2 và tất cả điện tử còn lại đều được chuyển vào các phân tử

nhận điện tử là NAD+ và FAD để tạo thành NADH và FADH2 qua chu trình Krebs.
NADH và FADH2 tạo thành từ con đường đường phân và chu trình Krebs sẽ chuyển
điện tử vừa nhận trước đó vào chuỗi vận chuyển điện tử và trở lại dạng NAD+ và
FAD [27].
Chuỗi vận chuyển điện tử gồm 4 phức hợp nằm trên màng trong ty thể và hai
phân tử vận chuyển điện tử giữa các phức hệ là ubiquinone coenzyme Q (Ub CoQ)
và cytochrome c (CytC). Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận điện tử của Ub CoQ từ
NADH và succinate. Phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ Ub CoQ
đến CytC. Cuối cùng phức hệ IV xúc tác sự vận chuyển điện tử từ CytC tới chất
nhận cuối cùng là oxy (hình 2). Ở mỗi bước electron đi qua các phức hợp, năng
Lớp Cao học K18

5

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

lượng được giải phóng ra dùng để bơm proton (H+) qua màng trong từ chất nền ra
xoang gian màng. Một gradien H+ giữa hai phía đối lập của màng (chất nền và
xoang gian màng) được hình thành và điện thế màng xuất hiện. Điện thế màng là
động lực tạo nên dòng H+ đi qua hệ thống ATP synthase để di chuyển ngược lại từ
xoang gian màng vào chất nền ty thể. Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạt động và
tổng hợp ATP từ ADP và Pi [27].
Như vậy, chức năng quan trọng của ty thể là nơi diễn ra chu trình Krebs và
tổng hợp năng lượng dự trữ ATP của tế bào thông qua chuỗi vận chuyển điện tử. Do
đó, một bệnh ty thể có thể làm ngừng hoạt động một số hoặc tất cả ty thể, cắt đứt

nguồn cung cấp năng lượng cơ bản này. Gần như tất cả các tế bào của chúng ta dựa
vào ty thể làm nguồn cung cấp năng lượng ổn định, do đó một bệnh ty thể có thể
gây ra rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng tới không chỉ một loại tế bào, một loại mô
hay tổ chức. Những triệu chứng chính xác khơng giống nhau ở mỗi người, bởi vì
một người với bệnh ty thể có thể có một hỗn hợp ty thể khỏe lẫn ty thể đột biến, với
sự phân bố riêng trong cơ thể. Đơi khi, một người có đủ ty thể khỏe mạnh để bù đắp
cho những ty thể đột biến.
Vai trò thứ hai của ty thể liên quan đến quá trình lão hóa. Lão hóa là q
trình tất yếu diễn ra trong cơ thể sinh vật và không liên quan đến cơ chế apoptosis
(chết tế bào theo chương trình).

Hình 3: Sơ đồ minh hoạ cơ chế của sự lão hoá theo học thuyết ty thể
Học thuyết ty thể về lão hoá được đề xuất bởi Harman cách đây hơn 30 năm
và mặc dù đã qua hơn 3 thập kỷ chứng kiến một số lượng lớn những dữ liệu tương
quan ủng hộ học thuyết này, nhưng chỉ gần đây mới có giả thuyết được kiểm chứng.
Lớp Cao học K18

6

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

Học thuyết ty thể về lão hoá đề xuất rằng: ty thể là nguồn gốc của phần lớn các
dạng oxy phản ứng ROS. Theo học thuyết này, những tổn thương tích luỹ theo tuổi
tác trong mtDNA là nguyên nhân đi kèm với những rối loạn chức năng ty thể, dẫn
tới việc sản xuất nhiều ROS và phá huỷ mtDNA. Khả năng tạo năng lượng ATP của

ty thể giảm và tăng quá trình oxy hố làm hư hại cấu thành tế bào [23].
Hơ hấp tế bào là nguyên nhân sinh ra các gốc tự do gắn liền với bản chất của
sự sống. Sự hô hấp tế bào về bản chất là sự chuyển điện tử từ chất dinh dưỡng đến
oxy phân tử thông qua hệ các enzym vận chuyển điện tử trong ty thể. Khoảng 0,44% O2 được hô hấp biến đổi thành gốc superoxide ở vị trí phức hợp I và III của
chuỗi vận chuyển điện tử.
Như mọi phản ứng oxy hoá khử sinh học, chất oxy hố chỉ có thể nhận từng
điện tử một, oxy phân tử ở đây cũng chỉ nhận được một điện tử ở nấc đầu tiên tạo ra
các gốc superoxide:
Chất dinh dưỡng→ điện tử + O2 → O*2
Gốc tự do superoxide là một trong những gốc tự do độc hại, nó khơng dừng
lại mà ln chuyển hố tiếp để tạo ra các dạng oxy phản ứng khác:

Hình 4: Sơ đồ minh họa cơ chế sản sinh các ROS trong ty thể
Trong số các ROS thì độc hại nhất là gốc HO*, vì nó là gốc tự do điển hình
có khả năng hoạt động khá mạnh. ROS có thể tác dụng lên các chất phân tử lớn theo
Lớp Cao học K18

7

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

cách liên ứng, chúng lần lượt tạo ra các gốc tự do từ các phân tử bị tấn công nối tiếp
nhau, gốc tự do sau được tạo thành từ các phân tử trước, cứ thế khuếch đại tác dụng
của sự tấn công ban đầu. Gốc tự do sẽ phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng
thất thốt, tế bào khơng tăng trưởng, không được sửa chữa và chết. ROS tạo ra chất

lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay.
ROS tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp protein, lipid, đường, tinh bột, enzyme
trong tế bào. ROS gây ra các đột biến gene, ở nhiễm sắc thể DNA, RNA. Nó làm
chất collagen, elastin mất tính chất đàn hồi, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp
cứng nhắc. Đồng thời gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải
chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; ROS tấn công các ty thể, lạp thể khác
phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm
suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được… gốc tự do là
nguyên nhân của sự tự huỷ hoại, sự lão hoá ở cấp độ tế bào.
Sự đính của mtDNA ở màng trong ty thể được xem là thuận lợi cho bộ phận
hô hấp, nhưng lại rất gần gũi với bộ phận sản xuất ROS. Gốc tự do superoxide tấn
công trực tiếp vào DNA của tế bào hoặc làm xuất hiện các gốc tự do thứ phát có
khả năng tấn cơng DNA. Tác dụng gây tổn thương của ROS đối với DNA chủ yếu
là do kết quả của phản ứng Fenton với sự xúc tác của các ion kim loại hình thành
nên các hydroxyl; gốc này có thể tấn cơng và gây ra những biến đổi ở bất kỳ gốc
base nào của DNA. Đối với protein, sự tấn công của ROS khởi đầu bằng việc gốc
hydroxyl tách một nguyên tử hydro ở carbon vị trí α của một axit amin bất kỳ trên
chuỗi polypetide để tạo ra gốc hữu cơ. Gốc hữu cơ nhanh chóng phản ứng với oxy
để tạo ra gốc trung gian alkylperoxyl. Dạng này tiếp tục chuyển thành dạng
alkylperoxide và tiếp theo là thành gốc alkoxyl. Gốc alkoxyl có thể bị biến đổi
thành một hydroxyl protein. Khi ở dạng này thì các chuỗi polypeptide dễ dàng bị
đứt gãy. Nói chung tất cả các axit amin đều có thể bị oxi hóa bởi ROS. Tuy nhiên,
nguy cơ bị oxi hóa phụ thuộc vào đó là axit amin nào, vị trí của nó trên chuỗi
polypeptide và trên cấu cấu trúc không gian của phân tử protein.
Theo học thuyết ty thể về lão hoá, việc tích luỹ những hư hại ở cấu thành ty
thể bao gồm mtDNA, protein, lipid có ảnh hưởng đến chức năng ty thể. Nói chung
những tổn thương mtDNA trong phạm vi rộng, thời gian dài và quá trình ngừng
hoạt động của ty thể là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị lão hố.
Ty thể cịn giữ vai trị trong q trình “chết theo chương trình” (apoptosis)
của tế bào. Đây là quá trình quan trọng trong sự phát triển và điều hành mô của sinh

Lớp Cao học K18

8

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

vật đa bào. Sự sai khác chức năng ở bất cứ mức độ nào đều làm giải phóng các yếu
tố gây “chết theo chương trình” vào khoảng gian màng, làm cho tế bào bị phá hủy.
Ty thể tham gia vào quá trình tự chết của tế bào có thể bằng cách giải phóng vào tế
bào chất các yếu tố có tác dụng hoạt hóa các enzyme caspase và endonuclease. Tuy
nhiên vai trị của ty thể trong “chết theo chương trình” rất phức tạp và chưa được
biết đến đầy đủ. Có thể q trình tạo năng lượng của ty thể có liên quan tới “chết
theo chương trình”. Ngun nhân có thể do chuỗi hơ hấp của ty thể tạo ra sản phẩm
phụ là các dạng ROS và bởi hoạt tính sửa chữa của hệ gen ty thể kém nên càng làm
tăng quá trình này.
Ty thể cịn có khả năng tích lũy và giữ lượng ion canxi. Điều này rất quan
trọng trong việc điều hòa trao đổi chất, tạo ATP và các quá trình khác, như tiết thể
dịch thần kinh [25].
Ngồi ra, ty thể cịn đóng một vai trị quan trọng trong nhiều q trình
chuyển hóa khác như là: tổn thương tế bào thần kinh do thoát các chất trung gian
glutamate, tăng sinh tế bào, điều hịa trạng thái oxy hóa-khử của tế bào, tổng hợp
nhân heme, steroid, tạo nhiệt (giúp giữ ấm cho cơ thể). Một vài chức năng của ty
thể chỉ được thực hiện ở một số tế bào đặc hiệu nào đó. Chẳng hạn, ty thể ở tế bào
gan chứa các enzyme cho phép loại bỏ độc tính của ammonia, đây là chất thải của
q trình chuyển hóa protein. Một sự đột biến các gen điều hòa ở bất cứ các chức

năng này đều có thể gây ra nhiều bệnh ty thể khác nhau.
1.1.3. Hệ gen ty thể người
Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập
với hệ gen nhân. Hệ gen của ty thể người được Clayton [11] mô tả lần đầu tiên vào
năm 1967. Đến năm 1981, Anderson đã công bố trình tự và cấu trúc hệ gen ty thể
người [6]. Hệ gen ty thể tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đơi và có kích thước là
16.569 bp mã hóa cho 2 phân tử RNA ribosome (rRNA), 22 phân tử RNA vận
chuyển (tRNA), và 13 phân tử protein gồm thành phần trong các phức hợp của
chuỗi hô hấp: phức hợp I (ND1-6 và ND4L), phức hợp III (Cytb– cytochrome b),
phức hợp IV (COX1-3), và enzyme ATP synthase (A8 và A6). NCR là vùng khơng
mã hóa (D−Loop).
Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histone, điều này
làm cho mtDNA giống DNA của vi khuẩn. Người ta đã đưa ra nhiều giả thuyết về
nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể. Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ
Lớp Cao học K18

9

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn, sống cộng sinh bên trong trong tế
bào sinh vật nhân chuẩn. DNA ty thể khơng có intron (ngoại trừ một số nucleotide
khơng mã hóa ở giữa một vài gen) và có các gen nằm gối lên nhau. Vùng khơng mã
hóa ở mtDNA người là vùng điều hòa (được gọi là đoạn D-loop) chiếm khoảng 7%
chiều dài ty thể, gồm 1121 bp, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng và chuỗi

nhẹ và chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng.

Hình 5: Cấu trúc hệ gen ty thể người
Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng xẩy
ra trong ty thể nhưng các enzyme cho quá trình sao chép lại do hệ gen nhân mã hóa.
Q trình phiên mã và dịch mã của mtDNA được điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen
ty thể được phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, và bản phiên mã
sau đó được endonuclease phân cắt để hình thành nên các phân tử tRNA, 12S và
16S rRNA, mRNA tiền thân. Phân tử mRNA hoàn thiện của ty thể không được gắn
mũ nhưng được gắn đi poly(A) [6]. Mơ hình phiên mã trên có nhiều điểm giống
với một operon của vi khuẩn. Điều này càng khẳng định cho giả thuyết về nguồn
gốc ty thể từ vi khuẩn. Ty thể người có hệ thống dịch mã riêng với các mã di truyền,
đặc biệt là mã khởi đầu và mã kết thúc, có nhiều điểm khác biệt so với các mã di
truyền của hệ gen nhân (bảng 1)[6].

Lớp Cao học K18

10

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

Bảng 1: Một số mã di truyền của DNA ty thể khác DNA nhân [6]
Mã di truyền

Hệ gen nhân

Hệ gen ty thể

Mã kết thúc

Trp

AGA, AGG

Arg

Mã kết thúc

ATA, ATT

Ile

Mã mở đầu

TGA

Gen COI và URF6 có mã kết thúc là AGA và AGG hay gen ATP6 có mã
khởi đầu là GUG [6]. Cả 22 phân tử tRNA do hệ gen ty thể mã hóa đều tham gia
vào quá trình tổng hợp các protein. Ở người, các nhà nghiên cứu khơng tìm thấy
hiện tượng phân tử tRNA do hệ gen nhân mã hóa đi từ nguyên sinh chất vào ty thể
để tham gia tổng hợp protein [20]. Tuy nhiên, ở một số đối tượng khác như nấm
men, hiện tượng này có xẩy ra và hướng nghiên cứu cơ chế vận chuyển tRNA từ tế bào
chất vào ty thể ở đối tượng trên mở đường cho phương pháp đưa tRNA bình thường vào
ty thể của người để điều trị các bệnh liên quan đến đột biến trên gen tRNA của ty thể.
Số lượng bản sao của hệ gen ty thể trong các loại tế bào khác nhau là không

giống nhau, tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của tế bào mà số lượng bản
sao là ít hay nhiều. Tỷ số giữa bản sao hệ gen ty thể và hệ gen nhân ở trong cơ tim
là 6970, cao hơn nhiều ở trong cơ xương là 3650 [24].
Sự di truyền của mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất. Đối với các gen
nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật vận
động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhưng hệ gen ty thể lại không
tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di
truyền riêng đặc trưng cho chúng.
Hệ gen ty thể người được di truyền theo dịng mẹ. Ở người, trứng có rất
nhiều ty thể khoảng hơn 100.000 bản sao, trong khi đó tinh trùng chỉ chứa khoảng
100-1.500 bản sao, tập trung ở đuôi tinh trùng. Trong quá trình tạo thành hợp tử, tế
bào tinh trùng chỉ đóng góp hệ gen nhân của chúng cho tế bào trứng chứ khơng
đóng góp hệ gen ty thể. Ty thể của tinh trùng bị loại bỏ ngay khi vào trứng có thể do
q trình phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin. Vì vậy, ty thể trong hợp tử mới tạo
thành hoàn toàn của tế bào trứng và tất cả các tính trạng được mã hóa trên hệ gen ty
thể được di truyền từ người mẹ sang người con [47]. Đôi khi cơ chế loại bỏ DNA ty
thể của tinh trùng có thể bị hỏng, dẫn đến hiện tượng tế bào chất của hợp tử chứa
DNA ty thể của cả bố và mẹ. Hiện tượng này được gọi là hiện tượng “dị tế bào
chất” (heteroplasmy). Do tế bào có chứa số lượng ty thể khác nhau nên các đột biến
Lớp Cao học K18

11

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

trong hệ gen ty thể có những đặc trưng riêng. Cơ thể mang đột biến có cả bản sao có
đột biến và bản sao khơng có đột biến. Hiện tượng heteroplasmy có vai trò quy định
mức độ biểu hiện của bệnh mà đột biến gây nên [46].
Hệ gen ty thể thay đổi nhanh hơn khoảng 20 lần so với hệ gen nhân vì hệ gen
dạng trần không được bảo vệ dễ dàng tiếp xúc với tác nhân gây đột biến trong chất
nền, không có các protein bảo vệ kiểu histone như hệ gen nhân, thiếu các yếu tố
kiểm tra khi sao chép, không có hệ thống enzyme để sửa chữa những sai xót do
phóng xạ hoặc oxy hố, mtDNA khơng có khả năng tự phục hồi dễ dàng như DNA
nhân. Đến nay hơn 270 đột biến trong hệ gen ty đã được phát hiện và chúng gây ra
các triệu chứng bệnh khác nhau, chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh, chức năng
chuyển hoá của cơ thể.
1.2. Các loại đột biến trong hệ gen ty thể ngƣời và các bệnh liên quan
Ty thể có vai trị tổng hợp ra ATP nhưng genome ty thể chỉ mã hóa cho một
số lượng rất ít protein/enzym. Do đó, chức năng ty thể được thực hiện nhờ vào hàng
loạt các protein/enzyme do gen nhân mã hóa. Các protein này được tổng hợp trong
tế bào chất rồi được vận chuyển đến ty thể. Chính vì vậy, các rối loạn ty thể có thể
phát sinh do những đột biến ở gen nhân hoặc gen ty thể. Một số rối loạn ty thể chỉ
ảnh hưởng đến một cơ quan, nhưng cũng có những rối loạn ảnh hưởng đến rất nhiều
cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội (như về thần kinh-cơ). Những rối
loạn ty thể có ở bất kỳ lứa tuổi nào. Những rối loạn ty thể có thể làm ảnh hưởng đến
sự hợp nhất của các enzyme trong chuỗi hô hấp (chủ yếu là thiếu hụt các enzyme).
Hầu hết các đột biến gen ty thể đều làm suy giảm chức năng của ty thể, từ đó
gây nên các hội chứng bệnh khác nhau tập trung chủ yếu ở cơ, thần kinh và chức
năng chuyển hóa của cơ thể. Các đột biến ty thể hay còn gọi là rối loạn chức năng ty
thể được chia làm hai dạng, do đó cũng có thể chia những bệnh do DNA ty thể gây
ra thành hai dạng chính, đó là các bệnh do sự sắp xếp lại DNA ty thể và các bệnh do
đột biến điểm DNA ty thể.
1.2.1. Đột biến điểm
Đột biến điểm là những đột biến gây ra do sự thay thế một nucleotide này
bằng một nucleotide khác (ví dụ A thay thế cho G, T thay thế cho C và ngược lại).

Đột biến điểm trong mtDNA được chia làm 3 dạng nhỏ bao gồm: đột biến gen mã
hóa protein, đột biến gen mã hóa tARN và đột biến gen mã hóa rARN.
Lớp Cao học K18

12

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

Hình 6: Các loại đột biến điểm phổ biến trên mtDNA
1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên tRNA và rRNA
Đột biến gen mã hóa tRNA gây ra các bệnh hay hội chứng bệnh MELAS,
MERRF, CPEO.
Hội chứng MELAS (Mitochondrial Encephalopathy, Lactic acidosis and
Stroke-like episodes) là hội chứng viêm não tủy sinh axit lactic với các triệu chứng
giống đột quỵ. Những biểu hiện ban đầu như đau đầu liên tục, nôn, nhược cơ
thường bắt đầu xuất hiện ở những trẻ em từ 2 đến 10 tuổi. Nguyên nhân là do một
trong các loại đột biến A3243G hay T3271C, A3252G, C3256T, T3291C của gen
MT-TL1; đột biến G13513A và A12770G của gen MT-ND5. Các gen bị ảnh hưởng
đều mã cho tRNALeu(UUR), triệu chứng bệnh bắt đầu từ khi bệnh nhân khoảng 10
tuổi, xuất hiện các triệu chứng giống đột quỵ trước năm 40 tuổi. Trong đó, đột biến
A3243G được chứng minh là chiếm 80% số ca mang hội chứng MELAS [45]. Đột
biến nằm trên gen mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển leucine (UUR)
(tRNALeu(UUR)), gen MT-TL1. Đột biến làm thay đổi cấu trúc, giảm chức năng của
tRNALeu(UUR) và biểu hiện thành bệnh lý.
Hội chứng MERRF (Myoclonic epolepsy associated with ragged-red fibres)

là hội chứng động kinh giật cơ với các sợi đỏ nham nhở. Nguyên nhân phổ biến do
sự thay đổi A8344G, T8356C gây ra, hai gen bị ảnh hưởng đều mã hóa cho tRNALys
triệu chứng của bệnh là cơ bị co giật , mất điều hòa ở tiểu não , liệt cơ, lên cơn đô ̣ng
kinh, mấ t khả năng nghe, tăng lactate máu , các sợi cơ đỏ nham nhở. Đột biến điểm
Lớp Cao học K18

13

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

A8344G cũng chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [13].
Hội chứng CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội
chứng liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên, do đột biến A3243G, T4274C, hai gen
bị ảnh hưởng mã hóa cho hai tRNA tương ứng là tRNALeu(UUR) và tRNAIle triệu
chứng của bệnh là liệt mắt ngồi, liệt cơ, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và đột tử.
Ngoài ra, rất nhiều các đột biến điểm khác trên gen ty thể có liên quan đến
một số bệnh như bệnh lý cơ (myopathy) liên quan đến các đột biến T14709C,
A12320G, bệnh lý cơ tim (cardiomyopathy) do các đột biến A4269G, A3243G,
G8363A, bệnh tiểu đường và câm điếc (MIDD) liên quan đến đột biến C12258A,
A3243G, bệnh lý não cơ (encephalomyopathy) liên quan đến các đột biến T10010C,
G1606A.
Đột biến gen mã hóa rRNA như đột biến A1555G gây ra các bệnh điếc
không hội chứng được cảm ứng bởi aminoglycoside (AID).
1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến trên mRNA
Hội chứng Leigh (gây chết, hoại tử não) và bệnh NARP (neuropathy, ataxia

and retinitis pigmentos) gây bệnh yếu cơ ngoại biên do tổn thương thần kinh, rối
loạn cảm giác, thất điều, viêm võng mạc sắc tố đều chủ yếu do đột biến T8993G ở
gen mã hóa tiểu phần ATPase 6 dẫn đến dịch mã sai axit amin ở phần trình tự kỵ
nước của tiểu phần này, khiến cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi nên tạo ra nhiều
gốc oxy tự do gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau. Hội chứng Leigh có liên
quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn đến thay thế Phe bằng Leu ở vị trí
124 (F124L). ND5 là gen chức năng gồm 1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) được
mã hóa bởi chuỗi nặng giàu G của mtDNA. Sản phẩm của gen ND5 là một thành
phần của phức hệ NADH-ubiquinon oxidoreductase. Sản phẩm của gen ND5 nằm ở
phần kỵ nước của phức hệ I. Protein này là một trong 7 tiểu phần được mã hóa bởi
mtDNA trong số 42 tiểu phần của phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đột biến trên gen
ND5 có liên quan tới nhiều bệnh trong đó có LHON, Leigh và MELAS.
Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy-bệnh liệt thần kinh
thị giác di truyền Leber ) tác động chủ yế u đế n võng ma ̣c , gây hô ̣i chứng teo dây
thầ n kinh thi ̣giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả 2 mắ t. Bệnh có thể gây mù ngay
khi tuổi trẻ và thường xuất hiện ở đàn ông. Nguyên nhân do các đột biến G3460A,
G11778A, T14484C ở các gen tương ứng ND1, ND4 và ND6. Ngồi ra hội chứng
LHON cịn gây ra do sự thay đổi allele, chuyển Ala 458 thành Thre (A458T). Một
Lớp Cao học K18

14

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

đột biến nữa cũng gây ra bệnh này là đột biến chuyển vị trí nucleotide 13730, dẫn

đến sự thay thế Gly bằng Glu ở vị trí 465 của chuỗi polypeptide ND5 (G465E). Các
nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến này có thể bắt nguồn trong dịng phơi của mẹ.
Đột biến gen ND6 là điểm nóng gây ra bệnh LHON. Gen ND6 là một trong
13 gen mã hóa protein của ty thể, nằm trên chuỗi nhẹ của mtDNA từ vị trí 14149
đến 14673 gồm 524bp [6]. ND6 là gen chức năng mã hóa cho một protein nằm
trong phần protein-Fe thuộc phức hệ I của chuỗi vận chuyển điện tử. Các đột biến
gen ND6: T14484C, T14459C là các đột biến gây ra thay đổi tương ứng M64V,
A72V. Đột biến này không những gây ra các triệu chứng của bệnh LHON mà còn
gây ra hội chứng Leigh. Ngồi ra cịn có đột biến G14453A đi kèm với các triệu
chứng của bệnh LHON cịn có các triệu chứng của hội chứng MELAS.
Hội chứng MELAS có liên quan tới sự biến đổi A12770G của gen ND5, dẫn
đến thay thế Glu bằng Gly ở vị trí 145 (E145G).
Bệnh khơng chịu đƣợc vận động do các đột biến gen CYTB: gen CYTB
mã hóa cho một tiểu đơn vị của phức hệ hơ hấp III, có chiều dài 1141bp, từ vị trí
14747 tới 15887, khơng chứa intron [6]. Chuỗi polypeptide dài 380 axit amin do
gen CYTB mã hóa có vai trị quan trọng trong chuỗi hô hấp tế bào thông qua việc
xúc tác cho quá trình vận chuyển điện tử từ ubiquinol (Coenzyme khử Q10) đến
cytochrome c và sử dụng năng lượng để vận chuyển các proton từ màng trong ty thể
ra màng ngoài ty thể. Đột biến G15615A dẫn đến thay Gly bằng Asp ở vị trí 290,
được phát hiện ở một bệnh nhân 25 tuổi với triệu chứng không chịu được vận động
[10]. Đột biến G14846A dẫn đến thay Gly bằng Ser ở vị trí 34 được phát hiện từ
một trong 5 bệnh nhân bị bệnh không chịu được vận động ngay từ khi còn nhỏ với
triệu chứng yếu cơ và tăng acid lactic máu. Bệnh nhân có các sợi cơ đỏ nham nhở
[7]. Bên cạnh các đột biến vừa nêu người ta cũng còn phát hiện thấy một số đột biến
khác như G15242A [19], G15150A [21], G14985A và T15572C [30],T14849C
[34] , A15579G [41] đều liên quan đến gen CYTB.
1.2.2. Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA
Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xẩy ra trong vùng nhỏ không mã hóa
(vùng V) nằm giữa gen mã cho cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã
hóa cho phân tử RNA vận chuyển Lys (tRNALys) (hình 7). Vùng này gồm hai trình

tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp giữa vị trí nucleotide 8272-8289 trên genome ty
thể. Cytochrome c oxidase là một enzyme quan trọng của q trình hơ hấp, tham gia
Lớp Cao học K18

15

Khóa 2009-2011


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ

vào các bước oxy hóa cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử ở ty thể.
Cytochrome c oxidase bao gồm 3 tiểu phần lớn và được mã hóa trong ty thể [16].

Bệnh nhân

Hình 7: Vị trí trình tự lặp lại 9 bp trên mtDNA
Đầu tiên mất đoạn 9 bp này được phát hiện thấy ở châu Á và quần thể khởi
đầu ở châu Á là Polynesia và người Mỹ bản địa, sau đó cũng thấy ở châu Phi và
châu Âu với tỷ lệ mất đoạn rất thấp. Tần số mất đoạn này là ổn định ở các quốc gia
khác nhau và nó khơng giống nhau. Tỷ lệ mất đoạn thay đổi từ Tây sang Đông, từ
lục địa tới các đảo trên thế giới. Người ta đã chứng minh được kiểu mất đoạn ở
Đông Á và quần đảo Thái Bình Dương là chung một nguồn gốc. Tuy nhiên kiểu
mất đoạn ở châu Á và châu Phi là có nguồn gốc khác nhau.
Các nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy, do các đặc điểm như di truyền
theo mẫu hệ, mức độ đột biến cao và số lượng bản sao lớn, mtDNA là một công cụ
hữu ích để nghiên cứu sự tiến hóa ở người. Những đột biến của mtDNA nếu là
trung tính sẽ khơng bị loại bỏ trong quá trình chọn lọc tự nhiên và có hiện tượng

phiêu bạt gen. Do mtDNA được di truyền theo mẫu hệ nên nó tích lũy các đột biến
và phát tán theo các dòng phả hệ mẫu hệ. Chính điều này đã tạo nên tính đa hình
của mtDNA, đặc trưng theo quần thể, tạo nên các nhóm đơn bội có quan hệ với
nhau. Sự khác biệt của các trình tự mtDNA có thể được sử dụng để xây dựng các
cây phát sinh chủng loại nhằm thể hiện các mối quan hệ tiến hóa.
Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, xét về sự thay đổi về chiều dài,
có 4 lớp trình tự khác nhau trong vùng di truyền ngoại gen COII/tRNALys: lớp đầu
tiên và phổ biến nhất ở con người là có 2 bản copy của trình tự lặp lại 9 bp; lớp thứ
hai là kiểu thêm nucleotide (insertion) trong một bản lặp lại 9 bp như là thêm 4 C
tìm thấy ở mtDNA một người châu Á [42], những kiểu thêm khác liên quan tìm
thấy người Indonesia [31], kiểu thêm xấp xỉ 4 nucleotide cũng thấy ở 1 người Việt
nam và 1 người Malay Aborigine [8]. Lớp thứ 3 là kiểu lặp lại 3 bản copy của trình
tự 9 bp tìm thấy 1 người Chuckchi từ Siberia và 1 người Tharu từ Nepal. Lớp thứ tư
là thay đổi chiều dài liên quan đến mất một bản copy 9 bp.
Lớp Cao học K18

16

Khóa 2009-2011