Trichoderma reesei- tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose

ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
Thạc Sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp
HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề liên quan và cung cấp một số tài
liệu có ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án.
Tất cả các thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp
HCM - đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đồ án.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã cùng học tập,
trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc.
Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành!
Mục Lục
SVTH: Nguyễn Thị Hương i
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Mục Lục .............................................................................................................................................................. i
Danh Mục Hình ................................................................................................................................................. iii
......................................................................................................................................................................... iii
Lời Mở Đầu .................................................................................................................................................... iv
I.Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei .................................................................................................... 1
1.Lịch sử phát hiện ....................................................................................................................................... 1
2.Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei ................................................................................................. 2
2.1.Vị trí phân loại ..................................................................................................................................... 2
2.2.Đặc điểm hình thái ............................................................................................................................. 3
3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ......................................................................................................................... 5
3.1.Đặc điểm sinh thái .................................................................................................................................. 5
3.2.Môi trường sống ..................................................................................................................................... 5
3.3.Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh ................................................................................................. 6
3.4.Môi trường nhân sinh khối ..................................................................................................................... 6
4.Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma ....................................................................................... 6
5.Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma ................................................................................... 7
5.1.Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng ........................................................... 7

5.2.Trong lĩnh vực xử lý môi trường ............................................................................................................. 8
5.3.Trong lĩnh vực khác ................................................................................................................................. 9
II.Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei: ................................................................................... 11
1.Cellulose: .................................................................................................................................................. 11
1.1.Cấu trúc: ............................................................................................................................................ 11
1.2.Nguồn gốc: ........................................................................................................................................ 12
2.Cellulase: .................................................................................................................................................. 15
II.1.Cấu trúc: ............................................................................................................................................ 15
II.2.Phân loại: ........................................................................................................................................... 18
II.3.Cơ chế hoạt động: ............................................................................................................................. 19
II.4.Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei : ....................................................................................... 21
Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả năng phân hủy cellulose cao ............................................ 27
I.Phương pháp hiện đại: .................................................................................................................................. 27
SVTH: Nguyễn Thị Hương ii
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
I.1. Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei .......................................... 27
I.2. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách sử dụng promoter
mạnh : ......................................................................................................................................................... 33
I.3. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách nhân bản và biểu
hiện gen khác loài : ...................................................................................................................................... 37
I.3.1.Plasmids ......................................................................................................................................... 38
I.3.2.Kết quả ....................................................................................................................... 39
II.Phương pháp cổ điển: .................................................................................................................................. 41
II.1.Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái T.reesei và việc sản xuất enzyme cellulase. .... 41
II.2.Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase. 46
II.3.Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase ............................................................................. 47
II.4.Ảnh hưởng của sục khí và không sục khí đến khả năng sản xuất cellulase ở T.reesei RUT C30. ........ 49
PHẦN 3: KIẾN NGHỊ ......................................................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO: ..................................................................................................................................... 50
Danh Mục Bảng

Danh Mục Hình

SVTH: Nguyễn Thị Hương iii
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Lời Mở Đầu
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có
khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại
polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ
sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu
không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.
Những năm gần đây, nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Dưới
áp lực trên, nguồn năng lượng tái tạo đang được các quốc gia quan tâm Việc sử
dụng cellulase của Trichoderma reesei để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose
thành ethanol đang được nghiên cứu và áp dụng. Việt Nam có nguồn sinh khối tự
nhiên dồi dào. Thêm vào đó, nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm
nông nghiệp phong phú và đa dạng.
Enzym Cellulase là một phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose
thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid trong cellulose tạo ra sản phẩm
glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất
hiện nay là vi sinh vật. Trong đó, vi nấm Trichoderma là nguồn thu enzyme
cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao.
Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số
phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose. Để từ đó, giải quyết được
những vấn đề “nóng” ở Việt Nam và trên thế giới
SVTH: Nguyễn Thị Hương iv
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
PHẦN 1: TỔNG QUAN
I. Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei
1. Lịch sử phát hiện
Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết

là Trichoderma viride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân
loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác.
Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng
các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương
trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã số QM 6a là loài nấm
phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi
chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ
lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại viện
nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh
tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng
Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà
nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá
ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm
đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma. Việc
nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên
cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải
cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả
năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh
giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày
nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới
[Theo Christian P. Kubicek và Gary E. Harman].
SVTH: Nguyễn Thị Hương 1
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei
2.1. Vị trí phân loại
Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành (Division, Phylum):
Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota .
Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện
mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Nấm được chia thành 10
dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào dưới

ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số
Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại .
Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm
Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of
Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như sau:
SVTH: Nguyễn Thị Hương 2
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Loài: Trichoderma reesei
2.2. Đặc điểm hình thái
Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong
chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn
nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là
5-10 µm).
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhóm
phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết
với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử cùa Trichoderma, có màu xanh
đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn
đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn.
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc
sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào
dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào
thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại,
người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome).
Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều lỗ

thủng. Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế bào phía sau
SVTH: Nguyễn Thị Hương 3
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
ngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm
sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối ít ( 6 ở T.reesei).
Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực
(Eukaryote) khác. Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số lắng
Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) : bán đơn vị
lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein).
Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein)
Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ nhưng về
sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía đỉnh ngọn sợi nấm.
Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis) hoặc bị tan rã
dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật khác sinh ra. Cũng
có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạo nên một
màng dày hình thành những bào tử áo (chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi
nấm tồn tại được qua những điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống
với các bào tử nội sinh (endospore).
Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi
trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều- mycelia), sau 3-5 ngày
có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của
sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo
hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi
nấm.
SVTH: Nguyễn Thị Hương 4
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử
( nguồn bởi G.B.Sharples)
3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
3.1. Đặc điểm sinh thái

T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty.
T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4
ngày nuôi cấy ở 20
0
C. Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 25
0
C-30
0
C, chậm ở 35
0
C-37
0
C. Ở
35
0
C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép
bất thường. Trong khi ở 37
0
C, bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy.
3.2. Môi trường sống
Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là vi sinh vật hoại
sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy
thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. chúng có mặt khắp mọi nơi trừ
những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm
SVTH: Nguyễn Thị Hương 5
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
hoặc cận nhiệt đới là khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc. Nhu cầu nhiệt độ tối đa của
môi trường sống đặc trưng cho từng loài.
Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và Trichoderma sử dụng nhiều
nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia.

Trichoderma có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa
(6-pentyl-pynone đã bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của
Trichoderma
3.3. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh
Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids,
trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid .
Trichoderma có khả năng sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon ,
emodin .
3.4. Môi trường nhân sinh khối
Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như:
bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia…
4. Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma
[nguồn TS. Dương Hoa Xô - TT CNSH Tp. Hồ Chí Minh]
Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạt động"
khác nhau, chúng có thể sử dụng:
Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tác nhân
gây bệnh
Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không
gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" môi trường trước
các vi sinh vật khác.
Ký sinh: tức giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trong loài
nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng.
SVTH: Nguyễn Thị Hương 6
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG

Hình 1 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium
[(Nguồn: DienTrang Biolab)]
5. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma
5.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng
Bảo vệ thực vật: một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma được

quan tâm nhiều nhất là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số
nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều loại Trichoderma khác để
kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác. Kết quả các loại Trichoderma kiểm soát hiệu quả
các nấm gây bệnh. Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụng rất
rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam. Phân hữu cơ
sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có tác dụng rất tốt
trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm
Phytophthora palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do
một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii ….
SVTH: Nguyễn Thị Hương 7
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở
công ty Điền Trang.
Cải thiện năng suất cây trồng : (kích thích sự tăng trưởng của cây trồng)
Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua
bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự
hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế
giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây.
Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số
lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) giúp khả năng hút chất ding dưỡng .Ngoài ra,
những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán.
Hình 1 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T.
harzianum T-22 [G. E. Harman, Cornell University, Geneva].
5.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường
Xử lý các phế phẩm nông nghiệp:
SVTH: Nguyễn Thị Hương 8
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngòai tác dụng sản xuất phân bón
hữu cơ sinh học, hay sử dụng như một lọai thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng để xử
lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất

hiệu quả. Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma ) của Trung Tâm Công nghệ
Sinh học TP. Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam …
đang được nông dân TP. Hồ Chí Minh và khu vực Đồng bằng Sông Cửu long, Đông nam
bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm
này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương pháp thông
thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng. Người nông dân
lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng
kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong
phân.
Các chế phẩm của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm chứa các vi sinh
vật do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma
sp. và vi khuẩn Bacillus sp. Những vi sinh vật trên có tác dụng phân huỷ nhanh các hợp
chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein và cellulose), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế
phẩm BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy
ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt.
5.3. Trong lĩnh vực khác
Trichoderma được bổ sung vào thức ăn gia cầm nhằm tăng khả năng tiêu hóa
hemicellulose ở vật nuôi .
Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng
dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có
gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát
triển .
SVTH: Nguyễn Thị Hương 9
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 5: Một số gen biocontrol từ T. harzianum đã được đưa vào cây thuốc lá để
kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo lá và vào cây khoai tây để kháng nấm
Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi G. E. Harman, Cornell University, Geneva].
Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzymee ngoại bào rất có hiệu quả.
Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzymee khác phân
hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm

và ngành dệt cho các mục đích tương tự .
6. Khả năng ứng dụng ở Việt Nam
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho
thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng
Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả
năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá
chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii,
Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là
khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta
đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình
phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng
dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của
SVTH: Nguyễn Thị Hương 10
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai)
đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan
nghênh và ứng dụng hiệu quả .
II. Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei:
1. Cellulose:
1.1. Cấu trúc:
Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-D-
Glucose, có công thức cấu tạo là (C
6
H
10
O
5
)
n

hay [C
6
H
7
O
2
(OH)
3
]
n
trong đó n có thể nằm
trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật.
Hinh 1 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu-cacbon, màu đỏ-oxy,
màu trắng-hydro [ web bách khoa toàn thư ].
Các đơn vị lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm hai
đơn vị glucose. Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lực van
der Waals để tạo thành cấu trúc cao phân tử không hòa tan.
SVTH: Nguyễn Thị Hương 11
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 7: Cấu trúc của phân tử cellulose
1.2. Nguồn gốc:
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có
khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại
polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ
sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu
không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Điều không may là
cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng may mắn
là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ.
Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose có nhiều trong
sợi bông (95%) , sợi lanh (71%), sợi đay ( 71% ). Ngoài ra, cellulose còn có trong

gỗ, thưc vật dưới nước (tảo, rong,…),sản phẩm phụ phẩm nông nghiệp ( rơm, rạ, lõi
ngô,…).
SVTH: Nguyễn Thị Hương 12
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật
[bởi Michael W. Davidson ]
SVTH: Nguyễn Thị Hương 13
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Bảng 1 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật
SVTH: Nguyễn Thị Hương 14
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
2. Cellulase:
II.1. Cấu trúc:
Cellulase có 2 vùng chức năng: trung tâm xúc tác và trung tâm tạo liên kết với cellulose.
Hai vùng chức năng này nối kết với nhau thông qua vùng không xúc tác [5].
Hinh 1 9: Cấu trúc không gian 3 chiều của enzyme cellulase (Ngân hàng dữ liệu
protein, cấu trúc 1JS4)
Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng. Thông
thường cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose. Đơn vị chức
năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất là cellulose đến trung tâm
xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúc tác
bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể. Một số khác lại có xu hướng
liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [6].
Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trưng cho
enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúc cellulosome.
SVTH: Nguyễn Thị Hương 15
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên nó được ứng
dụng trong công nghệ sản xuất protein [7].

Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với cellulose và
trung tâm xúc tác. Đây chính là vùng đại diện cho sự tương tác giữa protein – protein và
giữa protein – đường trong quá trình tổng hợp enzyme [5].
Hinh 1 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase
A. Cellulase ở nấm và một số vi khuẩn chỉ chứa 1 Trung tâm tạo liên kết với
cellulose
B. Cellulase ở một số vi khuẩn chứa 2 Trung tâm tạo liên kết với cellulose
C. Sơ đồ cấu trúc cellulosome (cấu trúc gồm nhiều enzyme, hoạt động ngoài tế
bào)
SVTH: Nguyễn Thị Hương 16
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hinh 1 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose trong sản xuất protein tái
tổ hợp [7]
A- Sử dụng phương pháp Bioseparation để phân tách cellulose sản xuất protein tái
tổ hợp. (Bioseparation là quá trình tách các thành phần của hỗn hợp đi qua một
cột hấp thụ để mỗi thành phần hấp thụ vào bề mặt khác nhau. Quá trình này
được sử dụng để tinh chế các protein, các chất sinh học được sử dụng trong sản
xuất dược phẩm và thực phẩm ).
B- Sử dụng phương pháp Bioprocessing gắn thêm ligand vào để biến đổi cấu trúc
của protein tái tổ hợp.
C- Sử dụng enzyme để cắt protein mong muốn và thu được protein đó.
SVTH: Nguyễn Thị Hương 17
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
II.2. Phân loại:
Ban đầu enzyme cellulase được phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân hủy
cellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91).
Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh so với
endoglucanase [5]. Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase thành 3
nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [8].

Cellulase Cơ chất Cơ chế Sản phẩm
Endo-cellulase
Cellulose kết tinh
Cellulose vô định
hình
Cắt liên kết giữa
các chuỗi
cellulose
Chuỗi đơn cellulose
Exo-cellulase
(cellobiohydrolase)
Chuỗi đơn
cellulose
Cellulose kết tinh
Cắt liên kết nội
chuỗi (1 vị trí cắt
sau 2-4 glucose)
Tetrasaccharides,
disaccharides
Cellobiase
Tetrasaccharides,
disaccharides
Cắt liên kết
glycoside giữa 2
glucose
Monosaccharide
Bảng 1 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9]
Endo-cellulase (E.C.3.2.1.4) hay 1,4-β-D-glucan 4 glucanohydrolase tham gia phân
giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose
vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.

Exo-cellulase (E.C.32.1.91) hay 1,4-β-D glucan cellobiohydrolase cắt đầu không
khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose (tetrasaccharides, disaccharides). Enzyme
SVTH: Nguyễn Thị Hương 18
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa
lý của chúng, giúp cho enzyme endo-cellulase phân giải chúng.
Cellobiase (E.C.3.2.1.21) cò được gọi là β-glucosidase, tham gia thủy phân
cellobiose, tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy các sợi cellulose.
II.3. Cơ chế hoạt động:
Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước:
Cellulase liên kết với cellulose thông qua trung tâm liên kết với cellulose trên
enzyme (giai đoạn 1). Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất
(giai đoạn 2). Hình thành phức hệ enzyme – cơ chất ( giai đoạn 3 ). Thủy phân liên kết β-
glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei
tiết ra. β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả
nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa
được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ). Desorption of cellulases from the substrate or repetition of
step 4 or steps 2/3 if only the catalytic domain detaches from chain (giai đoạn 5 ). Thủy
phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase. Ngoài ra, sản phẩm ức chế và sự biến
đổi cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên ( giai đoạn 6 ).
SVTH: Nguyễn Thị Hương 19
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
SVTH: Nguyễn Thị Hương 20
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hinh 1 12: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [10].
Các bước 1 – 4 để tạo thành sản phẩm cellobiose
Bước 1 — vùng xúc tác kết nối với vùng liên kết nhờ tác nhân liên kết linker
Bước 2 — xác định vị trí của chuỗi kết thúc
Bước 3 — hình thành phức hệ enzyme – cơ chất
Bước 4 — thủy phân liên kết β-glycosidic để tạo sản phẩm là cellobiose.

II.4. Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei :
Nhiều loại vi nấm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy cellulose. Đó là các loại
nấm mùn mềm, nấm mùn nâu, nấm mùn trắng, nấm kỵ khí trong dạ dày loài ăn cỏ...
Các loại nấm tạo ra mùn mềm chủ yếu phân hủy polysaccharide. Trong nhóm nấm
này, khả năng sinh sản các enzyme phân hủy cellulose cũng khác nhau. Loài nấm có khả
năng sinh sản hàng loạt enzyme phân hủy cellulose và được nghiên cứu kỹ là T. viride
(reesei).
SVTH: Nguyễn Thị Hương 21