NGÔ THỊ BÍCH PHƯƠNG MSV 1201461 góp PHẦN NGHIÊN cứu lên MEN TỔNG hợp KHÁNG SINH từ STREPTOMYCES 183 221 KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------

NGƠ THỊ BÍCH PHƯƠNG
MSV: 1201461

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 183.221
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGƠ THỊ BÍCH PHƯƠNG
MSV: 1201461

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 183.221
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu - người đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền
đạt những kiến thức quý báu và luôn luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hồn
thành tốt khóa luận của mình.
Trong q trình nghiên cứu, tôi cũng nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt
tình của các thầy cơ giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ
môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô.
Tôi cũng xin cảm ơn đến ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trường
Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Đồng thời, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng
hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân
cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tơi rất
mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cơ để khóa luận được
hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Ngơ Thị Bích Phương


MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG PHẦN PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1.
Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) .................................................2
1.1.1.
Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces ........................2
1.1.2.
Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn. ...................................................3
1.1.3.
Đặc điểm sinh lý .................................................................................3
1.1.4.
Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces ...................3
1.2.
Đại cương về kháng sinh...........................................................................4
1.2.1.
Định nghĩa kháng sinh ......................................................................4
1.2.2.
Phân loại kháng sinh .........................................................................4
1.2.3.
Cơ chế tác dụng của kháng sinh .......................................................5
1.3.
Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh ......5
1.3.1.
Các phương pháp cải tạo giống .........................................................5
1.3.2.
Bảo quản giống vi sinh vật ................................................................6

1.4.
Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh .................................................6
1.4.1.
Khái niệm lên men .............................................................................6
1.4.2.
Các phương pháp lên men .................................................................6
1.4.3.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .............................7
1.5.
Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ................................7
1.5.1.
Phương pháp chiết xuất .....................................................................8
1.5.2.
Phương pháp tinh chế ........................................................................8
1.6.
Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh ......................................9
1.6.1.
Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS) .....................................................9
1.6.2.
Phổ hồng ngoại (IR) ..........................................................................9
1.6.3.
Phổ khối lượng (MS) .......................................................................10
1.6.4.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ..............................................10
1.7.

Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến Streptomyces sp. ..............10


1.7.1.

Nghiên cứu về Androprostamin A và B các chất chống ung thư
tuyến tiền liệt mới được sản xuất từ Steptomyces sp. MK932-CF8. ..............10
1.7.2.
Nghiên cứu về Langkocycline, kháng sinh angucyclin mới từ
Streptomyces sp. Acta 3034 *............................................................................11
1.7.3.
Sản xuất axit clavulanic từ Streptomyces clavuligerus: sinh tổng
hợp, điều khiển và cải tạo giống. .....................................................................12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 13
2.1.
Đối tượng. .................................................................................................13
2.1.1.
Giống xạ khuẩn ................................................................................13
2.1.2.
Vi sinh vật kiểm định .......................................................................13
2.1.3.
Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định ..............................................13
2.1.4.
Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ........................................................14
2.1.5.
Dung mơi, hóa chất .........................................................................14
2.1.6.
Máy móc, thiết bị ..............................................................................16
2.2.
Phương pháp thực nghiệm. ....................................................................16
2.2.1.
Phương pháp nuôi cấy giữ giống ....................................................16
2.2.2.
Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ...17
2.2.3.

Phương pháp cải tạo và chọn giống ................................................17
2.2.4.
Phương pháp lên men chìm tởng hợp kháng sinh .........................20
2.2.5.
Các phương pháp chiết tách kháng sinh ........................................20
2.2.6.
Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết ...........................22
2.2.7.
Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được ...............22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ............................. 23
3.1.

Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ..................................................................23

3.2.

Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1. ..............................................23

3.3.

Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 ...............................................25

3.4.

Kết quả đột biến hóa học ........................................................................26

3.5.

Kết quả chọn mơi trường lên men chìm tốt nhất. ................................27

3.6.

Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất ...................................27

3.7.

Kết quả lên men chìm thu dịch lên men................................................28

3.8.
Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ...................................29
3.8.1.
Chạy sắc ký cột lần 1 ........................................................................29
3.8.2.
Chạy sắc kí lần 2. .............................................................................30
3.8.3.
Chạy sắc kí cợt lần 3 ........................................................................32


3.8.4.
3.8.5.

Chạy sắc kí cợt lần 4 ........................................................................32
Hiệu suất q trình tách và tinh chế kháng sinh ...........................33

3.9.
Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được. .....33
3.9.1.
KS3 (chất phụ) ..................................................................................33
3.9.2.
KS1 (chất phụ) ..................................................................................34

3.9.3.
KS2 (chất chính) ..............................................................................35
3.10.

Bàn luận ...................................................................................................38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ADN

Acid 2'- deoxyribonucleic

B. subtilis

Bacillus subtilis

DM

Dung mơi

DMHC

Dung mơi hữu cơ
Đường kính vịng vơ khuẩn

ĐBUV1

Đột biến UV lần 1

ĐBUV2

Đột biến UV lần 2

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr(-)

Gram âm

Gr(+)

Gram dương

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Ifrared (Hồng ngoại)

KS

Kháng sinh

MC

Mẫu chứng

MS

Mass Spectrometry (Phổ khối)

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

P. mirabilis

Proteus mirabilis

s

Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

TB

Tế bào

UV

Ultra violet (tử ngoại)

V

Thể tích

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn ....................................... 4
Bảng 1.2. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học. ......................................... 4
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định. .................................................................... 13
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định. ................................................. 13
Bảng 2.3. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). .............. 14

Bảng 2.4. Các dung môi đã sử dụng. ..................................................................... 15
Bảng 2.5. Các hóa chất đã sử dụng ........................................................................ 15
Bảng 3.1. Kết quả thử HTKS sau SLNN............................................................... 23
Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 1. .................................................. 24
Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 2. .................................................. 25
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS sau ĐBHH. ........................................................... 26
Bảng 3.5. Kết quả chọn môi trường lên men ....................................................... 27
Bảng 3.6. Kết quả lên men chìm của các dạng và biến chủng trên MT2dt ...... 28
Bảng 3.7. Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 ................ 29
Bảng 3.8. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 1 ............................. 30
Bảng 3.9. Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2 ..... 31
Bảng 3.10. Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2 ........................... 31
Bảng 3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3 ........... 32
Bảng 3.12. Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3 ........... 33
Bảng 3.13. Khối lượng kháng sinh tinh khiết và hiệu suất tinh chế. ................. 33
Bảng 3.14. Phiên giải phổ IR của KS3 .................................................................. 34
Bảng 3.15. Phiên giải phổ IR của KS1 .................................................................. 35
Bảng 3.16. Phiên giải phổ IR của KS2 .................................................................. 36
Bảng 3.17. So sánh tín hiệu của nhân phenoxazon trên phổ 13C-NMR KS2 với
actinomycin D và actinomycin X2 .........................................................................37


DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG PHẦN PHỤ LỤC
Hình PH.1

Một số dạng khuẩn ty và cuống bào tử ở xạ khuẩn.

Hình PH.2

Đĩa cấy zigzac chủng Streptomyces 183.221 sau 6 ngày/28oC

Hình PH.3

Khuẩn lạc sau ĐBUV1

Hình PH.4

Kết quả thử HTKS sau ĐBUV1

Hình PH.5

Kết quả thử HTKS sau chạy sắc ký cột lần 2

Hình PH.6

Kết quả hiện hình bằng P. mirabilis

Hình PH.7

Kết quả chấm sắc ký lớp mỏng

Hình PH.8

Chạy sắc ký cột

Hình PH.9

Cấu trúc hóa học nhân phenoxazon của actinomycin X2

Hình PH.10

KS2 tinh khiết

Hình PH.11

KS1 tinh khiết

Hình PH.12

Phổ UV-VIS của KS1

Hình PH.13

Phổ UV-VIS của KS2

Hình PH.14

Phổ UV-VIS của KS3

Hình PH.15

Phổ IR của KS1

Hình PH.16

Phổ IR của KS2

Hình PH.17

Phổ IR của KS3

Hình PH.18

Phổ MS của KS1

Hình PH.19

Phổ MS của KS2

Hình PH.20

Phổ 1H NMR của KS2

Hình PH.21

Phổ 13C NMR của KS2

Hình PH.22

Phổ 13C-DEPT NMR của KS2

Bảng PB.1

Kết quả thử HTKS sau SLNN

Bảng PB.2

Kết quả thử HTKS sau ĐBUV1

Bảng BP.3

Kết quả thử HTKS sau ĐBUV2

Bảng PB.4

Kết quả thử HTKS sau ĐBHH


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, bệnh truyền nhiễm vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong
trên toàn thế giới. Khơng những thế, tình trạng lạm dụng kháng sinh là một nguyên
nhân làm gia tăng sự xuất hiện của các vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong bối cảnh
thiếu hụt các kháng sinh mới khiến con người phải đang đối mặt với “thời kỳ hậu
kháng sinh”. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng
sinh là: một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc,
mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu tìm ra các chất kháng sinh mới [21], [22].
Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh chất kháng sinh thì xạ khuẩn đóng
vai trị quan trọng hàng đầu, khoảng 60% các kháng sinh hiện có có nguồn gốc từ
xạ khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces [7]. Đây là một chi xạ khuẩn
lớn, chúng sản xuất một loạt các “chất chuyển hóa thứ cấp", có tác dụng kháng
khuẩn rất cao.
Sau khi nắm bắt rõ được thực trạng này, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài:
“Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 183.221”
với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh của Streptomyces 183.221
- Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế KS do Streptomyces 183.221
tổng hợp.
- Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)

1.1.

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng trong tự nhiên (đất, nước, bùn…). Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ
khuẩn.
Đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân
nhánh, thuộc nhóm VK Gr(+), có tỷ lệ G + C > 55% [7].
1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces
Hệ sợi của xạ khuẩn: chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh.
Đường kính của khuẩn ti khoảng 0,2 - 3µm. Đa số khuẩn ti khơng có vách ngăn và
khơng tự đứt đoạn. Màu sắc của khuẩn ti xạ khuẩn rất đa dạng: trắng, vàng, da cam,
đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen… (Hình PH.1. phần phụ lục)
Khuẩn ti cơ chất cịn có khả năng tiết ra các sắc tố vào môi trường. Khuẩn ti
cơ chất là khuẩn ti cơ bản, phát triển một thời gian thì dài ra trong khơng khí tạo
thành khuẩn ti khí sinh.
Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện
chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau (thẳng, lượn sóng,
xoắn, mọc đơn, mọc vịng (vịng đơn cấp hoặc hai cấp), các đặc điểm này có ý
nghĩa quan trọng khi định tên xạ khuẩn.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình trịn, bầu dục, hình que,
hình trụ… Bề mặt của bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có gai, có tóc.
Khuẩn lạc xạ khuẩn: tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành
khuẩn lạc xạ khuẩn. Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp,
dạng phấn, khơng trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ hoặc đường

trịn đồng tâm,... Kích thước khuẩn lạc khác nhau tùy thuộc từng loài và điều kiện
nuôi cấy [7].

2


1.1.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn.
Thành tế bào xạ khuẩn: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 - 20nm. Thành
tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I (chứa L-ADP (L-diaminopimelic
acid) và glycin, không chứa acid mycolic),
Màng sinh chất: dày khoảng 7,5 - 10,0nm. Thành phần chính là protein và
phospholipid. Chức năng: là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan trong nước, là
nơi mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp.
Vùng nhân: chưa có nhân điển hình, nhiễm sắc thể có quy mô lớn nhất trong
các Prokaryota (8 - 9x106bp).
1.1.3. Đặc điểm sinh lý
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các hydratcacbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời
thủy phân các hợp chất như gelatin, casein... khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là
loại xạ khuẩn hơ hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích là 28 - 30oC, pH tối thích thường là
6,8 - 7,5. Ngồi ra chúng cịn có khả năng tạo sắc tố: sắc tố hòa tan, sắc tố của
khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid [7], [9], [27].
1.1.4. Khả năng sinh tởng hợp kháng sinh của Streptomyces
Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành kháng sinh, 60 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh kháng sinh. Kháng sinh là sản
phẩm trao đổi thứ cấp của VSV. Có nhiều giả thiết khác nhau về sự hình thành chất
kháng sinh từ xạ khuẩn. Có 3 con đường sinh tổng hợp KS ở xạ khuẩn:
- Kháng sinh được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, qua một chuỗi phản ứng
enzym.
- Kháng sinh được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.
- Kháng sinh được hình thành bằng cách polymer hóa các chất trao đổi bậc I,

sau đó tiếp tục biến đổi.

3


Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều KS có
cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau. Bảng 1.1. giới thiêụ một số
chất KS có nguồn gốc từ xạ khuẩn [2], [14].

Bảng 1.1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Kháng sinh
Nguồn gốc
Phổ tác dụng
Streptomycin
S. griceus
Gr(+), Gr(-)
Tetracyclin
S. aureofaciens
Gr(+), Gr(-)
Erythromycin
S. erythraea
Gr(+)
Gentamicin
M. purpurea
Gr(+), Gr(-)
Chloramphenicol
S. venezuelae
Gr(+), Gr(-)
Daunorubicin
S. peucetius

Ung thư
1.2. Đại cương về kháng sinh
1.2.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn
khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn
lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh,...) hay tế
bào ung thư ở nồng độ thấp [12].
1.2.2. Phân loại kháng sinh
Dựa vào cấu trúc hóa học:

Bảng 1.2. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.
Nhóm kháng sinh
β – lactam
Aminoglycosid
Tetracyclin
Macrolid
Polypeptid
Imidazol
Lincosamid
Nhóm khác

Ví dụ
Penicillin, cephalosporin,…
Streptomycin, gentamicin
Tetracyclin, doxycyclin
Erythromycin, clarithromycin, …
Polymycin, vancomycin,...
Metronidazol,…
Lincomycin, clindamycin,..
Mupirocin

4


1.2.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Có 5 cơ chế chính:
- Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: β –lactam, Vancomycin...
- Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: Polymyxin, Amphotericin,...
- Ức chế tổng hợp ADN của vi khuẩn : Actinomycin, anzamycin.
- Ức chế chuyển hóa : Co-trimoxazol,…
- Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: Macrolid,... [20].
1.3.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh

1.3.1. Các phương pháp cải tạo giống
1.3.1.1. Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên.
Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh lên 20 - 30% những cá thể khác.
Chúng ta cần chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống nghiên cứu
để tiến hành nghiên cứu ban đầu.
1.3.1.2. Đột biến nhân tạo cải tạo giống.
- Tác nhân gây đột biến:
+ Tác nhân hóa học: acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat,…
+ Tác nhân vật lý: tia X, tia neutron hay electron và ánh sáng tử ngoại
(UV)… Ánh sáng tử ngoại là tác nhân vật lý hay được dùng nhất, khả năng đột biến
còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
+ Tác nhân sinh học: Transponson, Bacteriophage Mu,....
- Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hết hầu hết các VSV. Những cá thể nào cịn sống sẽ có sự đột biến gen làm

thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm)
hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương).
Phải sàng lọc, thu lấy biến chủng tốt đem nghiên cứu tiếp [7], [9], [26], [27].

5


1.3.2. Bảo quản giống vi sinh vật
- Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền khơng
bị biến đổi và khơng bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ.
- Các phương pháp bảo quản: bảo quản lạnh, làm khô, đông khô, đông lạnh.
- Trong phịng thí nghiệm thường ni cấy xạ khuẩn trên mơi trường thạch
nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kì 3 - 6 tháng
cấy chuyền [2], [6], [8], [13].
1.4.

Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh

1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
VSV nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp
chất trung gian cho chúng.
Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh
trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng [9], [12], [17].
1.4.2. Các phương pháp lên men
Dựa vào thành phần đồng nhất của mơi trường có thể chia làm 2 phương pháp:
1.4.2.1.

Lên men bề mặt

- Là q trình VSV được ni cấy trên bề mặt rắn, đặc, lỏng. VSV hấp thu các
chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy khơng khí để hơ hấp trên bề mặt
mơi trường.
- u cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng và không quá sâu (5 10cm). Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết
bị ban đầu thấp. Nhược điểm: hiệu suất sử dụng mơi trường thấp, tốn diện tích, khó
cơ giới tự động hóa, tốn nhân cơng [8], [12], [17].
1.4.2.1. Lên men chìm
- Là phương pháp VSV được ni cấy trong các bình lên men bình phản ứng
sinh học, trong điều kiện sinh lý tối thích, VSV phát triển cả 3 chiều.
6


- Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm sốt tồn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất q trình lên men cao.
- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán
bộ cần chuyên mơn hóa, phế liệu thải ra dễ ơ nhiễm mơi trường.
- Các phương pháp lên men chìm: lên men mẻ, lên men bán liên tục, lên men
liên tục, lên men có bổ sung [12], [15], [17], [18].
1.4.3. Mợt số yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men
- pH mơi trường: tác dụng trực tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo
của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc là tác dụng gián tiếp.
- Nhiệt độ: ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và kiểu sinh sản, hình thái, trao
đổi chất và nhu cầu dinh dưỡng của VSV.
- Độ hịa tan oxy và sự thơng khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hịa tan oxy tương thích với
tốc độ sử dụng oxy của VSV.
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để tìm các điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh
tổng hợp chất mong muốn [12], [15], [17], [18].
1.5.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Với riêng đặc tính của các lồi khác nhau mà kháng sinh đó được tiết vào môi

trường nuôi cấy (penicilin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nystatin...). Vì
vậy để thu lấy hoạt chất có độ tinh khiết cao cần chọn phương pháp chiết tách, tinh
chế thích hợp để sản phẩm đạt chất lượng cao, độ bền lâu và giúp hạ giá thành sản
phẩm.
Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng với kháng sinh ngoại
bào:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ không đồng tan với nước.

7


- Phương pháp tạo phức kết tủa.
- Phương pháp trao đổi ion.
- Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột,..).
1.5.1. Phương pháp chiết xuất
- Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình
chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha
lỏng không đồng tan (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ).
- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha khơng hịa lẫn vào
nhau.
Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng chiết lỏng
- lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng.Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế
bào nên tiến hành chiết lỏng rắn [16].
1.5.2. Phương pháp tinh chế
- Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn
hợp phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng

chất.
- Phương pháp bao gồm: chiết, thẩm thấu, sắc ký [16].
- Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động
chạy qua pha tĩnh, phát hiện vết cần tách.
- Ngun lý tách: mẫu phân tích hịa tan trong pha động (thường là dịng chảy
dung mơi), pha động được di chuyển qua pha tĩnh một cách liên tục và khơng hịa
lẫn với nó, các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ tùy thuộc sự
tương tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan nên các thành phần sẽ được tách riêng
biệt thành dải trên sắc ký đồ nhờ tốc độ di chuyển khác nhau.
- Một số phương pháp sắc ký thường dùng:
• Sắc ký lớp mỏng:
+Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là
chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ).

8


+Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf:
Rf =

dv
d dm

trong đó: dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
ddm: Khoảng cách dung mơi chạy.

Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của
dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
• Sắc ký cột:
Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các

chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng
trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung mơi
thấm qua tồn bộ bề mặt pha tĩnh. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm
liên tục một lượng mới của pha động [1], [2], [3], [9], [16].
1.6.

Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh

1.6.1. Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS)
Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng
hay số sóng. Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn làm thay đổi mức năng
lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên kích thích. Phổ UV-VIS được sử
dụng định tính bằng cách so sánh với phổ của chất chuẩn đã có sẵn (so sánh vị trí
các cực đại, cực tiểu và tỉ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó), tuy nhiên phổ
UV-VIS là phổ cho khá ít thơng tin về cấu trúc, thông thường vẫn sử dụng phổ IR
để xác định cấu trúc [3], [5].
1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ bức xạ hồng
ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng bức xạ. Ánh sáng hồng ngoại có
năng lượng thấp nên chỉ dẫn đến sự thay đổi các mức năng lượng và chuyển động
quay. Sử dụng để nhận dạng các nhóm chức đặc biệt trong phân tử và định tính
bằng cách so sánh với phổ chuẩn. Đối với hầu hết các hợp chất dạng của phổ IR là
đơn nhất và đặc trưng trong vùng 1350-750cm-1 được gọi là “vùng vân tay”. Người

9


ta thường dựa vào tín hiệu trong vùng này để xác định sự “khơng” có mặt của một
nhóm chức [1].
1.6.3. Phổ khối lượng (MS)

Là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng cách đo chính xác khối
lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ
số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton. Các ion
được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân
tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện
bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành khối phổ đồ hay
phổ khối. Nó cung cấp thơng tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất)
xác định cấu trúc và định lượng các chất [1], [9], [19].
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một kỹ thuật ưu việt trong xác định cấu trúc
các hợp chất hữu cơ, là phương pháp triệt để nhất trong phân tích và biện giải tồn
bộ phổ. Kỹ thuật NMR có thể nghiên cứu nhiều nguyên tử, nhưng hydro và carbon
là phổ biến nhất. Được tiến hành phối hợp các phương pháp trên sẽ giúp xác định
cấu trúc hóa học của kháng sinh đang nghiên cứu [1].
1.7.

Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến Streptomyces sp.

1.7.1. Nghiên cứu về Androprostamin A và B các chất chống ung thư tuyến tiền
liệt mới được sản xuất từ Steptomyces sp. MK932-CF8.
Androgen đóng vai trò trung tâm trong sự phát triển và tiến triển của ung thư
tuyến tiền liệt. Tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở người là LNCaP và VcaP nhạy cảm
với androgen và có thể phát triển phụ thuộc androgen. Giả thuyết rằng một loại chất
ức chế mới của thụ thể androgen (AR) có thể như một tác nhân điều trị duy nhất cho
ung thư tuyến tiền liệt. Để xác định một loại chất ức chế mới của AR, các nhà khoa
học đã phải sàng lọc 50.000 môi trường nuôi cấy vi sinh vật và phát hiện các chất

10

ức chế AR mới, Androprostamine A và B cho thấy sự ức chế mạnh mẽ đối với sự
gia tăng tế bào ung thư tuyến tiền liệt phụ thuộc androgen ở người là LNCaP và
VCaP. Các hợp chất Androprostamines A và B ức chế sự tăng trưởng phụ thược
androgen của các tế bào LNCaP và VcaP tương tự như resormycin. Việc điều trị
bằng các hợp chất này cho thấy ức chế sự tăng tổng hợp androgen R1881 trong tế
bào LNCaP và VCaP, nhưng lại có tính độc tế bào LNCaP và VCaP ở bào thai bò
(FBS). Trong tế bào VCaP, các hợp chất này cho thấy hoạt tính gây độc mạnh hơn
so với tế bào LNCaP. Bởi vì AR thể hiện quá mức trong tế bào VCaP, các tế bào
VCaP một phần có thể phát triển phụ thuộc androgen bởi sự kích FBS. Bicalutamid,
loại thuốc chống ung thư được sử dụng rộng rãi nhất trong phòng khám, cho thấy ức
chế chọn lọc tăng trưởng phụ thuộc androgen của các tế bào ung thư tiền liệt tuyến.
Nghiên cứu cho thấy rằng Androprostamine A và B ức chế tăng trưởng phụ thuộc
androgen của các tế bào LNCaP và VCaP như một bicalutamid [28].
1.7.2. Nghiên cứu về Langkocycline, kháng sinh angucyclin mới từ Streptomyces
sp. Acta 3034 *
Langkocycline A1-A3, B1 và B2, năm kháng sinh angucyclin mới được sản
xuất bởi Streptomyces sp. Acta 3034, đã được phát hiện trong quá trình sàng lọc
bằng HPLC detector mảng diod. Các chủng sản xuất được phân lập từ đất vùng rễ
của Clitorea sp. thu được từ vịnh Burau, Langkawi, Malaysia, và được đặc trưng
bởi các đặc điểm hình thái, sinh lý và các phương pháp phân loại sinh học cùng với
thơng tin trình tự gen RNA ribosome 16S. Chủng Acta 3034 có liên quan chặt ché
với Streptomyces psammoticus NBRC 13.971T và Streptomyces lanatus NBRC
12.787T. Langkocyline bao gồm một bộ khung tetracyclic benz[a]anthracen và Oglycosidic. Các langkocyclines khác nhau về aglycon, Langkocycline kiểu A màu
vàng, Langkocycline kiểu B màu xanh lam. Aglycon của Lankocycline kiểu A
giống hệt của Aquayamycin và Urdamycin A. Các cấu trúc hóa học của
Langkocyclines được làm sáng tỏ bằng các phổ HR-MS, 1D và 2D NMR. Chúng có
hoạt tính sinh học chống lại vi khuẩn Gram(+) và có hoạt tính trung bình chống lại
sự nhân lên của các dòng tế bào khối u của con người [24].
11

1.7.3. Sản xuất axit clavulanic từ Streptomyces clavuligerus: sinh tổng hợp, điều
khiển và cải tạo giống.
Clavulanic acid (CA) là một chất có hiệu lực đối kháng β-lactamase mạnh
được Streptomyces clavuligerus sản xuất và đã được sử dụng kết hợp với thuốc
kháng sinh β-lactam (ví dụ Augmentin) để điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi
các mầm bệnh sản sinh β-lactamase. Kể từ khi phát hiện ra CA vào cuối những năm
1970, những thơng tin chủ yếu được tích lũy trong quá trình tổng hợp và liên quan
đến các cơ chế phân tử tham gia vào sự điều chỉnh quá trình sản xuất. Đáng chú ý,
các gen quy định sự tổng hợp CA được tổ hợp cùng với các gen chịu trách nhiệm
cho sự sinh tổng hợp của kháng sinh β-lactam, cephamycin C, làm cho VSV này
vừa sản xuất kháng sinh vừa tạo ra một phân tử nhỏ để bảo vệ kháng sinh khỏi các
enzym thủy phân kháng sinh. Theo truyền thống, các phương pháp cải tạo giống
trong công nghiệp đã dựa đáng kể vào sự chọn lọc ngẫu nhiên. Tuy nhiên, sự sẵn có
của bộ gen của S. clavuligerus gần đây với khả năng xây dựng mơ hình trao đổi
chất, và điều chỉnh VSV bằng các phương pháp tiếp cận trực tiếp, đã tạo ra những
cơ hội thú vị để cải thiện năng suất có hiệu quả hơn. Nghiên cứu đã tập trung vào
việc tổ hợp các gen sinh tổng hợp CA, các cơ chế điều tiết ảnh hưởng đến sản xuất
và sẽ bao gồm các quan điểm về cải thiện năng suất giống [23].

12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng.

2.1.

2.1.1. Giống xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.221 đã được
phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp.
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định
VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội
cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định.
Đặc trưng

Tên VSV kiểm định

Tên viết tắt

VK Gram (+)

Bacillus subtilis ATCC 10241

B. subtilis

VK Gram (-)

Proteus mirabilis BV 108

P. mirabilis

2.1.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu ở Bảng 2.2:
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.
Thành phần

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước
pH

MT
Canh thang

(g)

(g)

(g)

(g)

(ml)

0,5

0,3

0,5

0

100(vđ)
7,0-7,5

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

13

1,6-1,8

100(vđ)


2.1.4. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần các MT phân lập, nuôi cấy, khảo sát khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml).
Thành phần

MT1

MT2

Tinh bột

2

2

MT7

Saccarose

3

Bột ngô

0,1

Pepton

0,3

Cao thịt

0,5

KNO3

0,1

KCl

0,05

NaNO3

0,2

FeSO4,7H2O

0,01

K2HPO4

0,05

0,1

MgSO4,7H2O

0,05

0,05

NaCl

0.05

Cao nấm men

0,5

Thạch

1,8

2

2

Nước vđ (ml)

100

100

100

pH

7,0 – 7,2

6,8 – 7,2

7,0 – 7,2

Chú ý: Các môi trường dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như MT nuôi
cấy xạ khuẩn nhưng khơng có thạch. Các MT ni cấy xạ khuẩn, MT lên men và
MT nuôi cấy VSV kiểm định được tiệt trùng ở 118-120oC trong 20 phút.
2.1.5. Dung mơi, hóa chất
Các dung môi đã sử dụng được giới thiệu trong Bảng 2.4.

14


Bảng 2.4. Các dung môi đã sử dụng.
Dung môi

Khối lượng riêng
(g/ml)

Aceton (Xilong - Trung Quốc)

Nhiệt độ sôi (oC)

0.79

56

Butylacetat (Xilong - Trung Quốc)

0.880 - 0.885

117-118

Ethanol (Xilong - Trung Quốc)

0.789 – 0.791

78.3

Ethylacetat (Merck – Đức)

0.902

70-72

n-Hexan (Merck – Đức)

0.6548

69

Methanol (Xilong - Trung Quốc)

0,791-0,793

64,5

Triethylamin (Xilong - Trung Quốc)

0,726-0,728

89

Các hóa chất đã sử dụng được giới thiệu trong Bảng 2.5.
Bảng 2.5. Các hóa chất đã sử dụng
Các hố chất sử dụng

Hãng sản xuất

Đóng lọ

Tinh bột

Thủ công-Việt Nam

1kg

KNO3

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

KCl

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

NaNO3

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

NaNO2

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

CaCO3

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

(NH4)2SO4

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

K2HPO4

Xilong-Trung Quốc

0,5L

MgSO4.7H2O

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

NaCl

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

Cao nấm men

Merck-Đức

0,5kg

15


Cao thịt

Merck-Đức

0,5kg

Thạch

Hải Long-Việt Nam

10g

Pepton

Xilong-Trung Quốc

0,5kg

NaOH 0,1 N

Xilong-Trung Quốc

0,5L

HCl 0,1 N

Xilong-Trung Quốc

0,5L

2.1.6. Máy móc, thiết bị
-

Đèn UV (λ = 254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V.

-

Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030. Tủ sấy SL Shellab.

-

Cân phân tích Sartorius BP 121S, cân kỹ thuật Sartorius TE210.

-

Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc.

-

Tủ cấy vô trùng Aura VF 48, tủ sấy SL shellab.

-

Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf, cân kỹ thuật.

-

Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2 - Melt, máy đo UV-VIS Hitachi U-1900.

-

Máy đo phổ MS-Xevo TQMS, máy đo phổ IR Impact 410 - NicoLet - USA.

2.2.

Phương pháp thực nghiệm.

2.2.1. Phương pháp ni cấy giữ giống
- Mục đích: Bảo quản các chủng giống thuần khiết đã phân lập, các dạng
chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên, các biến chủng sau đột biến nhân tạo cho các nghiên
cứu tiếp theo.
- Tiến hành: Chuẩn bị môi trường phân lập, đun sôi, khuấy trộn, phân đều vào
các ống nghiệm, mỗi ống 5-6ml, nút bông. Tiệt trùng ở 120o/20phút, 1 atm rồi đặt
nghiêng cho đông. Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào
tử Streptomyces 183.221 đã thuần khiết lên bề mặt thạch nghiêng. Nuôi cấy ở 28oC
trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, cất giữ trong tủ lạnh (2-4oC). Định kỳ cấy
truyền sau 3 - 6 tháng.

16