Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định hàm lượng S-allyl-L-cystein (SALC), Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.91 MB, 96 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---

Nguyễn Thị Thu Hoa

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG S – ALLYL – L 
– CYSTEIN (SALC), DIALLY DISULFIDE (DADS) TRONG TỎI ĐEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---

NGUYỄN THỊ THU HOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG S–
ALLYL–L-CYSTEIN (SALC), DIALLY DISULFIDE (DADS) TRONG

TỎI ĐEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---

NGUYỄN THỊ THU HOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG 
S–ALLYL–L–CYSTEIN (SALC), DIALLY DISULFIDE (DADS)

TRONG TỎI ĐEN

Chuyên ngành: Hóa phân tích 
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa i Trường ĐHKH Tự nhiên

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Thị Hồng Hảo
đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài và viết luận văn.

Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm
An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học
tập và nghiên cứu tại Viện.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Cao Công Khánh, ThS. Vũ Thị Kim Oanh
cùng toàn thể các anh chị trong khoa Nghiên cứu Thực phẩm, các anh chị trong
Viện, đã nhiệt tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, động viên tơi trong suốt q trình làm thực
tập.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các Thầy Cô giảng dạy tại Khoa Hóa học, đặc
biệt các thầy cơ trong Bộ mơn Hóa Phân tích đã truyền đạt cho tơi những kiến thức
quý giá, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng khoa học,
hiện đại.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và anh chị trong Bộ
mơn Hố Phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu này.

Hà Nội, tháng 12, năm 2016
Học viên

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa ii Trường ĐHKH Tự nhiên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG ... v

DANH MỤC CÁC HÌNH/ ĐỒ THỊ ... vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ... viii

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ TỎI ĐEN ... 3

1.1.1. Khái quát chung về tỏi trắng ... 3

1.1.2. Khái quát chung về tỏi đen ... 4

1.1.3. Quá trình lên men tỏi thành tỏi đen ... 5

1.2. TỔNG QUAN VỀ S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL-DISULFIDE ... 6

1.2.1. Tổng quan về S-allyl-L-cystein ... 6

1.2.1.1. Cấu trúc và tính chất ... 6

1.2.1.2. Vai trị của SALC đối với sức khỏe con ngƣời ... 7

1.2.2. Tổng quan về diallyl disulfide (DADS) ... 9

1.2.2.1. Cấu trúc và tính chất ... 9

1.2.2.2. Tác dụng của DADS đối với sức khỏe con ngƣời ... 10

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL DISULFIDE ... 11

1.3.1. Các phƣơng pháp xác định SALC ... 11

1.3.1.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ... 11

1.3.1.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang ... 13

1.3.1.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS ... 13

1.3.2. Các phƣơng pháp xác định diallyl disulfide DADS ... 15

1.3.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ... 15

1.3.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC/MS/MS) ... 15

1.3.2.3. Sắc ký khí (GC) ... 16

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa iii Trường ĐHKH Tự nhiên

2.1. ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 18

2.1.1. Mục tiêu ghiên cứu ... 18

2.1.2. Nội dung nghiên cứu... 18

2.1.3. Đối tƣợng ... 18

2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ... 18

2.2.1. Hóa chất ... 18

2.2.2. Dụng cụ phân tích ... 20

2.2.3. Thiết bị phân tích ... 20

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 21

2.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ... 21

2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) ... 22

2.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ... 23

2.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ... 25

2.6. PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ... 25

CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 27

3.1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
SALC TRONG TỎI ĐEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA ... 27

3.1.1. Khảo sát điều kiện của phƣơng pháp HPLC-PDA để xác định hàm
lƣợng S-allyl-L-cystein ... 27

3.1.1.1. Lựa chọn điều kiện detector ... 27

3.1.1.2. Lựa chọn điều kiện phân tích S-allyl-L-cystein bằng phƣơng pháp

HPLC-PDA ... 28

3.1.1.3. Khảo sát điều kiện dẫn xuất hóa ... 28

3.1.1.4. Khảo sát chƣơng trình rửa giải của pha động ... 31

3.1.2. Khảo sát điều kiện chiết mẫu ... 35

3.1.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ... 36

3.1.3.1. Độ đặc hiệu ... 36

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa iv Trường ĐHKH Tự nhiên

3.1.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)... 39

3.1.3.4. Độ lặp lại ... 40

3.1.3.5. Độ thu hồi ... 41

3.1.4. Áp dụng phân tích S-allyl-L-cystein trong một số mẫu thực tế ... 42

3.2. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
DADS TRONG TỎI ĐEN BẰNG GC - MS ... 44

3.2.1. Lựa chọn các điều kiện của phƣơng pháp GC-MS để xác định hàm
lƣợng DADS ... 44

3.2.1.1. Lựa chọn cột tách ... 44

3.2.1.2. Lựa chọn chƣơng trình nhiệt độ cột tách ... 44

3.2.2. Khảo sát điều kiện chiết mẫu ... 45

3.2.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ... 46

3.2.3.1. Độ đặc hiệu ... 46

3.2.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ... 47

3.2.3.3. Giới hạn định lƣợng (LOQ) ... 48

3.2.3.4. Độ lặp lại ... 49

3.2.3.5. Độ thu hồi ... 50

3.2.4. Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế ... 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ... 54

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa v Trường ĐHKH Tự nhiên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Độ hòa tan của 1g SALC trong các dung môi khác nhau và độ pH khác

nhau ở 200C ... 7

Bảng 3.1. Khảo sát số mM muối borat ... 29

Bảng 3.2. Khảo sát pH đệm borat ... 30

Bảng 3.3. Khảo sát thời gian dẫn xuất FMOC ... 31

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát SALC khi phân tích ở chế độ đẳng dịng ... 32

Bảng 3.5. Các chƣơng trình dung mơi gradient ... 33

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết methanol : nƣớc ... 36

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ SALC... 38

Bảng 3.8. Độ lệch của từng điểm chuẩn SALC dùng xây dựng đƣờng chuẩn ... 38

Bảng 3.9. Kết quả đo mẫu tỏi đen hàm lƣợng thấp ... 39

Bảng 3.10. Kết quả độ lặp lại khi phân tích hàm lƣợng SALC trong mẫu tỏi đen ... 40

Bảng 3.11. Bảng đối chiếu kết quả độ lặp lại của phƣơng pháp HPLC-PDA để phân
tích hàm lƣợng SALC trong tỏi đen theo AOAC ... 40

Bảng 3.12. Kết quả độ thu hồi khi phân tích hàm lƣợng SALC trong mẫu tỏi đen ở 3
mức nồng độ khác nhau ... 41

Bảng 3.13. Bảng đối chiếu kết quả độ thu hồi của phƣơng pháp HPLC-PDA để
phân tích hàm lƣợng SALC trong tỏi đen theo AOAC ... 41

Bảng 3.14. Kết quả phân tích hàm lƣợng SALC trong một số mẫu thực tế ... 43

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết ethanol, acetone và methanol... 45

Bảng 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ DADS ... 47

Bảng 3.17. Độ lệch của từng điểm chuẩn DADS dùng xây dựng đƣờng chuẩn ... 48

Bảng 3.18. Kết quả độ lặp lại khi phân tích hàm lƣợng DADS trong mẫu tỏi đen .. 49

Bảng 3.19. Bảng đối chiếu kết quả độ lặp lại của phƣơng pháp GC-MS để phân tích
hàm lƣợng DADS trong tỏi đen theo AOAC ... 50

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa vi Trường ĐHKH Tự nhiên

DANH MỤC CÁC HÌNH/ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình ảnh củ tỏi trắng Lý Sơn ... 3

Hình 1.2. Hình ảnh sản phẩm tỏi đen sau khi lên men ... 5

Hình 1.3. Quy trình lên men tỏi đen ... 5

Hình 1.4. Cơng thức hóa học của S-allyl-L-cystein ... 6

Hình 1.5. Q trình chuyển hóa γ-glutamyl-S-allylcystein thành SALC ... 7

Hình 1.6. Cơng thức hóa học của Diallyl disulfide ... 10

Hình 2.1. Hình ảnh hệ thống phân tích HPLC –PDA hãng Water để xác định hàm
lƣợng SALC trong tỏi đen ... 21

Hình 2.2. Hình ảnh hệ thống phân tích GC-MS hãng Thermo để xác định hàm
lƣợng DADS trong tỏi đen ... 22

Hình 3.1. Sắc đồ xác định SALC bằng HPLC – PDA với số mM muối borat là
20mM ... 29

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic SALC vào pH đệm borat
bằng 8 ... 30

Hình 3.3. Sắc đồ xác định SALC bằng HPLC-PDA với pH đệm borat 8 ... 30

Hình 3.4. Sắc đồ xác định SALC khi khảo sát ở chế độ đẳng dịng với tỷ lệ dung
mơi CH3COONH4:ACN = 40:60, thời gian phân tích 40 phút ... 32

Hình 3.5. Sắc đồ xác định SALC khi khảo sát ở chế độ đẳng dịng với tỷ lệ dung
mơi CH3COONH4:ACN = 60:40, thời gian phân tích 40 phút ... 32

Hình 3.6. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL theo chƣơng trình dung mơi gradient 1 ... 33

Hình 3.7. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL theo chƣơng trình dung mơi gradient 2 ... 33

Hình 3.8. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL theo chƣơng trình dung mơi gradient 3 ... 34

Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL theo chƣơng trình dung mơi gradient 4 ... 34

Hình 3.10: Sắc đồ xác định hàm lƣợng SALC trong mẫu tỏi đen khi phân tích trên
hệ thống HPLC-PDA ... 35

Hình 3.11. Sắc đồ xác định SALC bằng phƣơng pháp phân tích HPLC-PDA tỷ lệ
dung môi chiết MeOH:H2O = 50:50 ... 36

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa vii Trường ĐHKH Tự nhiên

Hình 3.13. Sắc đồ của dung dịch mẫu trắng ... 37

Hình 3.14. Sắc đồ của dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn SALC ... 37

Hình 3.15. Đƣờng chuẩn của SALC ... 38

Hình 3.16. Quy trình tách và xác định hàm lƣợng SALC trong mẫu tỏi đen ... 42

Hình 3.17. Sắc đồ của dung dịch mẫu TĐ1 khi phân tích trên hệ thống HPLC-PDA
... 43

Hình 3.18. Sắc đồ xác định DADS khi chiết bằng dung mơi MeOH ... 45

Hình 3.19. Sắc đồ của dung dịch chuẩn DADS 4,0 µg/mL ... 46

Hình 3.20. Phổ khối của dung dịch DADS 4,0 µg/mL khi phân tích trên hệ thống
GC-MS ... 46

Hình 3.21. Đƣờng chuẩn của DADS xác định bằng phƣơng pháp GC-MS ... 47

Hình 3.22. Sắc đồ của DADS tại mức dƣới định lƣợng ... 49

Hình 3.23. Quy trình tách và xử lý mẫu tỏi đen để phân tích hàm lƣợng DADS ... 51

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa viii Trường ĐHKH Tự nhiên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu viết tắt Tên

ABTS 2,2-azino-bis-(3-ethylbenozothiazoline-6-sulfonic acid)

ACN Acetone nitrile

C Nồng độ trong dung dịch

Cc Lƣợng chuẩn thêm vào theo lý thuyết

FLD Detector huỳnh quang

FMOC 9-fluorenylmethyl-chloroformate

GC Sắc ký khí

GC-MS Sắc ký khí khối phổ

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Giới hạn phát hiện

LOQ Giới hạn định lƣợng

MeOH Methanol

SALC S-allyl-L-cystein

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 1 Trường ĐHKH Tự nhiên

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự tiến bộ của con ngƣời cùng với sự phát triển vƣợt bậc của
ngành khoa học công nghệ đã tạo ra hàng loạt các dƣợc phẩm có nguồn gốc nhân
tạo với tính năng chữa bệnh rất công hiệu và mang lại kết quả rất nhanh chóng.
Nhƣng đằng sau đó cịn có những hạn chế, tác dụng phụ… gây ảnh hƣởng đến sức
khỏe con ngƣời. Do vậy khuynh hƣớng quay về với thiên nhiên sử dụng những loài
thực vật vừa có giá trị dinh dƣỡng và dƣợc tính chữa bệnh đang ngày càng đƣợc
quan tâm. Trong đó tỏi đen đƣợc xem là những loại thực vật hội đủ các nhu cầu
thiết yếu của con ngƣời hơn hẳn các loại thực vật khác trong tự nhiên.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tỏi đen [8, 9, 10, 15, 50] cho thấy:
sau khi lên men, các hợp chất hữu cơ lƣu huỳnh tan trong nƣớc nhƣ
S-allyl-L-cystein (SALC), alliin, isoalliin, methiin… và các hợp chất hữu cơ lƣu huỳnh không
tan trong các dung môi không phân cực nhƣ diallyl disulfide, diallyl trisulfide…
Điều này làm cải thiện một số hoạt tính sinh học của tỏi đen nhƣ khả năng chống
oxy hóa, tăng cƣờng miễn dịch, ức chế tế bào ung thƣ [7, 8, 22, 23,24]. Trong số
các hợp chất chứa lƣu huỳnh, S-allyl-L-cystein và diallyl disulfide là hoạt chất đƣợc

chú ý nhiều nhất vì có nhiều hoạt tính có lợi cho sức khỏe con ngƣời. Với mục đích
và ý nghĩa thực tiễn nhƣ thế thì việc kiểm soát chất lƣợng tỏi đen và các sản phẩm
từ tỏi đen sẽ giúp mọi ngƣời có đƣợc nguồn dinh dƣỡng hợp lý, đủ về số lƣợng và
đảm bảo về chất lƣợng.

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 2 Trường ĐHKH Tự nhiên

nhiều thiếu sót do cịn ảnh hƣởng khá nhiều của nền mẫu; cịn đối với DADS

chƣa

có nghiên cứu cụ thể nào để phân tích hàm lƣợng DADS trong tỏi đen.

Do đó,
vấn đề đặt ra là tìm quy trình nghiên cứu để xác định hàm lƣợng SALC và DADS
trong tỏi đen.

Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy

trình xác định hàm lƣợng S-allyl-L-cystein (SALC), Diallyl disulfide (DADS) 
trong tỏi đen” với hai mục tiêu nhƣ sau:

1. Xây dựng quy trình định lƣợng S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen bằng
HPLC-PDA.

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 3 Trường ĐHKH Tự nhiên

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 
1.1. TỔNG QUAN VỀ TỎI ĐEN

1.1.1. Khái quát chung về tỏi trắng

Tỏi (danh pháp hai phần: Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ

Hành Alliaceae [2], nghĩa là có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây, 
v.v... Tỏi khơng chỉ đóng vai trò là một gia vị trong bữa ăn mà cịn có tác dụng nhƣ
một vị thuốc hữu hiệu với nhiều tác dụng.

Hình 1.1. Hình ảnh củ tỏi trắng Lý Sơn

Tỏi đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một gia vị dùng cho thực phẩm và dƣợc
liệu quan trọng nhất trong nhiều thế kỉ. Nó đã đƣợc trồng từ thời cổ đại, đƣợc sử
dụng làm gia vị và hƣơng liệu do các tiềm năng chữa bệnh. Hoạt tính của tỏi phụ
thuộc vào các hoạt chất của nó, đặc biệt là các hợp chất lƣu huỳnh hữu cơ – tạo vị
cay nồng của tỏi. Ngoài các hợp chất đó, hoạt tính của tỏi cũng đƣợc đặc trƣng bởi
các hoạt chất phenolic – tính dƣợc lý và hàm lƣợng tƣơng đối cao [29]. Phần hay
đƣợc sử dụng nhất của cả cây tỏi là củ tỏi, mà ta vẫn dùng làm gia vị. Củ tỏi có
nhiều tép. Từng tép tỏi cũng nhƣ cả củ tỏi đều có lớp vỏ mỏng bảo vệ. Tỏi sinh
trƣởng tốt trong mơi trƣờng nóng và ẩm.

Tác dụng của tỏi: Hành khí, ơn trung, tiêu tích trệ, sát trùng, giải độc, trù trị,
cảm cúm, ho gà, viêm phế quản, ăn uống tích trễ, thƣợng vị đau tức do đầy hơi, tiêu
chảy, mụn nhót, áp xe viêm tấy, hói trán, trị giun kim [4].

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 4 Trường ĐHKH Tự nhiên

Trong những năm gần đây, tỏi đã đƣợc nghiên cứu nhiều bởi lợi ích của nó

đối với sức khỏe con ngƣời: các tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống
ung thƣ. Do vậy, tỏi đã trở thành một trong những loại thực phẩm ngăn ngừa bệnh
phổ biến nhất. Mặc dù tỏi có rất nhiều lợi ích sức khỏe do hoạt chất allicin và các
hoạt chất trong tỏi, nhƣng nó cịn hạn chế do đặc trƣng mùi và gây đau bụng với
những ngƣời mẫn cảm. Vì vậy, các nghiên cứu gần đây tập trung vào phƣơng pháp
chế biến khác nhau nhƣ xử lý nhiệt, lão hóa và lên men để loại bỏ và cải thiện mùi
hăng khó chịu của tỏi [40].

1.1.2. Khái quát chung về tỏi đen

Tỏi đen (black garlic) là sản phẩm lên men từ tỏi tƣơi (hay còn gọi là tỏi
trắng) bằng cách gia nhiệt tỏi tƣơi ở nhiệt độ cao dƣới sự kiểm soát độ ẩm trong hơn
một tháng. Hơn nữa, quá trình gia nhiệt thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất thực
phẩm.

Một trong những mục tiêu quan trọng nhất của quá trình gia nhiệt để nâng
cao chất lƣợng thực phẩm, giúp ngon miệng, thay đổi màu sắc, hƣơng liệu và kết
cấu trong thực phẩm. Ngồi ra, q trình làm nóng dẫn đến sự hình thành các hoạt
chất sinh học mới do q trình chuyển hóa của một số hoạt chất [29].

Tỏi đen có ở Việt Nam cách đây khoảng 3 năm, đầu tiên do tiến sĩ Vũ Bình
Dƣơng nghiên cứu đề tài về ứng dụng lên men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn, Việt Nam. Và
đƣợc sản xuất thử nghiệm thành cơng. Sau đó đƣợc các trung tâm nghiên cứu, các
doanh nghiệp phát triển sản xuất và bán phổ biến rộng rãi trong cả nƣớc, đặc biệt thị
trƣờng ở thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội do đƣợc quảng bá rộng về công dụng
vƣợt trội cho sức khỏe nên đã đƣợc đón nhận và tiêu thụ khá mạnh [8, 9,10].

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 5 Trường ĐHKH Tự nhiên

Hình 1.2. Hình ảnh sản phẩm tỏi đen sau khi lên men

1.1.3. Quá trình lên men tỏi thành tỏi đen

Trong quá trình lên men sẽ xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất chứa
lƣu huỳnh nhƣ methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất mới chứa lƣu
huỳnh tan đƣợc trong nƣớc nhƣ S-allyl-L-cystein alliin, isoalliin, methionin,
cycloalliin, các dẫn chất của cysteine, dẫn chất tetrahydro-β-carboline. Đây là
những hợp chất quan trọng làm tăng tác dụng của sản phẩm tỏi đen thu đƣợc. Quy
trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lƣợng carbohydrate tăng từ 28,7% (trong
tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây. Vì trong
thành phần tỏi có chứa đƣờng và acid amin, sau khi trải qua quá trình lên men sẽ tạo
ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen. Do đó tỏi sau khi lên men tự nhiên (khơng
dùng hóa chất) lại chuyển thành màu đen, vị ngọt, khơng cịn mùi cay, hăng của tỏi
thơng thƣờng [45]. Sơ đồ quy trình lên men tỏi tạo tỏi đen nhƣ hình 1.3 [5].

Hình 1.3. Quy trình lên men tỏi đen

Thành phần tỏi có chứa đƣờng và acid amin, sau khi trải qua quá trình lên
men sẽ tạo ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen làm sản phẩm có màu đen.

Tỏi tƣơi Chọn lọc, phân loại làm sạch Xử lý, Ủ nhiệt, lên men Thu tỏi đen

Kiểm tra, chất
lƣợng tỏi
Đóng gói,

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 6 Trường ĐHKH Tự nhiên

1.2. TỔNG QUAN VỀ S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL-DISULFIDE 
1.2.1. Tổng quan về S-allyl-L-cystein

S-allyl-L-cystein (SALC) là một acid amin chứa lƣu huỳnh đƣợc tìm thấy
trong dịch chiết tỏi đã lên men [47], hợp chất chiếm hàm lƣợng nhiều nhất. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh các hoạt động chống oxy hóa của tỏi đen và SALC ở thí
nghiệm trong ống nghiệm (in vivo) – trong các mơ hình thí nghiệm động vật liên
quan về mất cân bằng oxi hóa và thí nghiệm trên tế bào (in vitro) – tác giả đã sử
dụng một vài phƣơng pháp để loại bỏ một số phản ứng oxi hóa đặc biệt và làm giảm
các ảnh hƣởng của quá trình oxy hóa. Xuất phát từ những thực nghiệm đó, tác dụng
bảo vệ của tỏi đen và SALC để ngăn ngừa và cải thiện sự mất cân bằng oxy hóa
[14].

1.2.1.1. Cấu trúc và tính chất

SALC đƣợc mô tả với các khái niệm khác nhau nhƣ S-allylcystein,
L-deoxyalliin. Phần hoạt động mạnh nhất của phân tử SALC là liên kết -C-S- trong
phân tử. Đây là một liên kết hoạt động nó mang đến cho SALC những hoạt tính
sinh học cao.

S
N

H2

COOH

Hình 1.4. Cơng thức hóa học của S-allyl-L-cystein

Danh pháp IUPAC: (R)-3-(Allylthio)-2-aminopropanoic acid.
Cơng thức hóa học: C6H11NO2S.

Khối lƣợng phân tử: 161,222.
Khối lƣợng riêng: 1,191.

Điểm nóng chảy: 223,3 – 223,70C.
Điểm sôi: 3000C.

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 7 Trường ĐHKH Tự nhiên

phân cực nhƣ nƣớc, methanol, acetonitrile… và tại các độ pH khác nhau (Bảng 1.1)
[50].

COOH
HN

NH2

COOH S

NH2
COOH

Hình 1.5. Q trình chuyển hóa γ-glutamyl-S-allylcystein thành SALC

SALC là một hợp chất hữu cơ tƣơng đối bền, khơng bị thay đổi tính chất, cấu
trúc trong dịch chiết tỏi khoảng 2 năm [31]. Mặc dù sau một thời gian lƣu trữ mẫu
có sự thay đổi nhỏ về màu sắc chuyển từ màu trắng sang màu vàng nhạt, nhƣng
không xảy ra sự chuyển đổi hoặc phân hủy ra chất khác.

Bảng 1.1. Độ hòa tan của 1g SALC trong các dung môi khác nhau và độ pH khác 
nhau ở 200C

Dung mơi Thể tích hịa tan (mL)

Nƣớc 14,7

HCl 10% 5,0

NaOH 0,1 N 11,0

Methanol 1053

Ethanol >10000

Acetonitrile >10000

Ethyl acetate >10000

Từ kết quả bảng 1.1 biểu diễn thể tích hịa tan có thể nhận thấy SALC tan tốt
trong các dung môi phân cực nhƣ HCl 10%; NaOH 0,1N và nƣớc; đối với các dung
mơi ít phân cực nhƣ ethanol, ethyl acetate… thì khả năng hịa tan của SALC kém
nên các dung môi phân cực thƣờng đƣợc sử dụng trong q trình phân tích hàm
lƣợng SALC trong tỏi đen.

1.2.1.2. Vai trò của SALC đối với sức khỏe con người

- Giảm lƣợng đƣờng huyết trong máu.

Trong nghiên cứu để đánh giá tác động của SALC trong đƣờng huyết và hệ
thống miễn dịch tuyến tụy trên cơ thể chuột bị bệnh tiểu đƣờng chỉ ra rằng hàm

γ-glutamyltransferase

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 8 Trường ĐHKH Tự nhiên

lƣợng glucose, TBARS và các enzyme chống oxy hóa đã bị biến đổi trong cơ thể
chuột mắc bệnh tiểu đƣờng. Những thay đổi này đã ở mức độ gần nhƣ kiểm soát
đƣợc sau khi sử dụng SALC. Tác dụng chữa bệnh đái tháo đƣờng và chống oxy hóa
đƣợc so sánh với glyclazide – một loại thuốc hạ đƣờng huyết đặc hiệu [23].

- Ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ CWR22R, điều trị ung thƣ

tuyến tiền liệt [39].

- Giảm kích thƣớc của mảng xơ vữa động mạch vàng, điều trị nhồi máu cơ

tim [44].

- SALC cũng có hoạt tính chống oxy hóa cao về khả năng loại bỏ gốc tự

do, tiền chất oxy hóa, kích thích sự hoạt động của enzyme chống oxy hóa, ức chế
enzyme oxy hóa và các hiệu ứng chelating tham gia vào các hoạt động bảo vệ của
dịch chiết tỏi và SALC, qua đó nhấn mạnh tiềm năng sử dụng nhƣ tác nhân điều trị
[14, 22].

- Đối với những ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng thì SALC giúp điều trị và bảo

vệ chống lại do bị thiếu isulin làm cho quá trình vận chuyển glucose không đƣợc
đƣa đi đến các tế bào, kết quả là lƣợng đƣờng glucose trong máu tăng cao.

Theo J Trace Elem Med Biology (2013) cho biết, kết quả nghiên cứu của các
nhà khoa học tại Trung tâm Công nghệ Sinh học, Trƣờng Cao đẳng Nghệ thuật và
Khoa học [24] đã chỉ ra rằng SALC có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh tiểu đƣờng
phát triển do SALC chứa amino acid làm gia tăng một loại protein đặc hiệu vận
chuyển sắt để phá hủy tế bào beta sản xuất insulin. Ngoài ra, nghiên cứu mới cho
thấy rằng những con chuột khơng có cơ chế vận chuyển sắt này sẽ đƣợc bảo vệ
chống lại bệnh tiểu đƣờng phát triển.

- Giảm hàm lƣợng choresterol, giảm mỡ máu, giúp chống nguy cơ bị béo

phì [18].

- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ gan , điều trị ung thƣ gan [30]. 
- Giảm tổn thƣơng não liên quan đến q trình mất cân bằng oxi hóa sau

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 9 Trường ĐHKH Tự nhiên

nhồi máu) và chảy máu não, chống lại q trình oxi hóa và ngăn chặn các tổn hại
đến tế bào thần kinh [36].

Ngồi ra, SALC cịn đƣợc biết đến với các tác dụng điều trị ung thƣ trực
tràng, ung thƣ biểu mô [21] và bệnh lý Alzheimer [16].

Năm 2010, tác giả Danna Wang và cộng sự [19] đã thực hiện thí nghiệm ảnh
hƣởng của dịch chiết tỏi đen đến hệ thống miễn dịch của cơ thể trên chuột và thấy
rằng việc tăng cƣờng hệ thống miễn dịch trên chuột là do hàm lƣợng
S-allyl-L-cystein – làm giảm đáng kể các tế bào gây ung thƣ kết trực tràng cũng nhƣ số lƣợng
các tế bào ruột già tiền ung thƣ.

1.2.2. Tổng quan về diallyl disulfide (DADS)

Cystein là một tiền chất quan trọng của các hợp chất lƣu huỳnh hữu cơ trong
tỏi đen, chẳng hạn S-methyl-L-cysteine sulphoxide (methiin) và S-allyl-L-cysteine
sulphoxide (alline) – là những hợp chất thơm chứa nhiều gốc cysteine. Sau khi tiến
hành xử lý mẫu nhƣ cắt, nghiền hoặc loại nƣớc, các hợp chất này sẽ bị phân hủy
thành các hợp chất dễ bay hơi khác, bao gồm diallyl sulfide, diallyl disulfide, diallyl
trisulfide, thorne và ajoene [45].

Tác giả Michael và cộng sự cũng cho thấy rằng, DADS là một hợp chất hữu
cơ chứa lƣu huỳnh, dễ bay hơi và rất hoạt động trong tỏi đã chƣng cất. Ngồi ra, nó
cịn tạo mùi đặc trƣng cho tinh dầu tỏi [34]. Hoạt chất DADS là hoạt chất rất có lợi
cho cơ thể chống lại bệnh ung thƣ, giảm lƣợng cholesterol trong máu, hạ huyết áp
[32]. Đây là một trong những hợp chất quan trọng nhất tạo nên tác dụng thần kỳ cho
tỏi đen và các sản phẩm từ tỏi đen.

1.2.2.1. Cấu trúc và tính chất

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 10 Trường ĐHKH Tự nhiên

S2

Hình 1.6. Cơng thức hóa học của Diallyl disulfide

Danh pháp IUPAC: 3-[(Prop-2-en-1-yl) disulfanyl]prop-1-ene.
Cơng thức hóa học: C6H10S2.

Khối lƣợng phân tử: 146,28 g/mol.
Khối lƣợng riêng: 1,01 g/cm3.
Điểm sôi: 1800C.

Diallyl disulfide (DADS) đƣợc hình thành từ quá trình chuyển hóa của
Allicin [39]. DADS là chất lỏng màu vàng nhạt, dễ bay hơi, mùi đặc trƣng. Là chất
ít phân cực nên dễ tan trong các dung mơi ít phân cực nhƣ methanol, cồn 960C…

1.2.2.2. Tác dụng của DADS đối với sức khỏe con người

- Ức chế sự tăng trƣởng và tồn tại của tế bào ung thƣ dạ dày AGS, hỗ trợ
điều trị bệnh ung thƣ dạ dày.

Theo nghiên cứu về đánh giá tác động của DADS với sự gia tăng của tế bào

ung thƣ dạ dày AGS – đƣợc điều trị với các nồng độ khác nhau tại Khoa Ngoại,
Bệnh viện Halsol đã cho thấy rằng DADS gây ra ức chế sự tăng trƣởng và tồn tại
của tế bào ung thƣ dạ dày phụ thuộc vào liều lƣợng. Nhƣng mối quan hệ việc chống
tăng sinh và thay đổi cấu trúc tế bào ung thƣ vẫn chƣa tỷ lệ thuận với nồng độ
DADS [26].

- DADS và ung thƣ đại tràng.

Nhƣ kết quả nghiên cứu của tác giả Yang JS cùng cộng sự của mình về tác
động của DADS việc chặn chu kỳ tế bào và apotosis (sự tự hủy diệt tế bào) trong
dòng tế bào ung thƣ đại tràng COLO 205 cho thấy rằng sau khi điều trị 24 tiếng, tế
bào bị apotosis bị phá vỡ [25].

- Ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ vú [13].

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 11 Trường ĐHKH Tự nhiên

- Chất ức chế men khử 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A. Men này
xúc tác phản ứng chuyển 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A thành
mevalonate trong quá trình tổng hợp cholesterol, làm giảm lƣợng cholesterol huyết
tƣơng và trong gan [37].

- DADS có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn gây
bệnh nhƣ Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157:H7, Listeria
monocytogenes, Staphyllococcus aureus và Campylobacter jejuni [33].

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 
S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL DISULFIDE

1.3.1. Các phƣơng pháp xác định SALC

Những nghiên cứu tách và xác định S-allyl-L-cystein (SALC) trên thế giới
đã có số lƣợng lớn các bài báo cơng bố với các quy trình tách và xác định SALC
[14, 15, 16, 22, 35, 41, 42, 43].

Do SALC là một acid amin tƣơng đối bền, khơng bị thay đổi tính chất, cấu
trúc trong thời gian dài và có hàm lƣợng cao trong dịch chiết tỏi nên thƣờng chỉ có
HPLC đƣợc sử dụng rộng rãi để phân tích hàm lƣợng SALC với các detector khác
nhau. Trong đó có 3 phƣơng pháp chính là HPLC-UV, HPLC-FLD, HPLC-MS.

Hiện nay, tỏi đen chỉ đƣợc nghiên cứu tại Học viện Quân y quy mô cấp nhà
nƣớc. Theo chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu định lƣợng S-allyl-L-cystein trong tỏi
đen Lý sơn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, tác giả Chử Văn Mến đã cho biết hàm
lƣợng SALC trong tỏi đen Lý Sơn thay đổi theo thời gian lên men và đạt cao nhất
sau 35 ngày [1].

1.3.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 12 Trường ĐHKH Tự nhiên

trình gradient, bƣớc sóng hấp thu đo ở 210nm, thể tích tiêm mẫu là 10μl. Kết quả
thẩm định cho thấy phƣơng pháp có độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ
đúng cao, giới hạn phát hiện thấp và giới hạn định lƣợng của SALC là 28,21 ng/mL
và 8,46ng/mL [1].

Năm 2010, Mun-su Kim và các cộng sự [35] đã xác định S-allyl-L-cystein

(SALC) có trong tỏi đen bằng phƣơng pháp HPLC với detector UV ở bƣớc sóng
210 nm. Mẫu đƣợc tách ra bằng cột sắc ký pha đảo C18 (3,9mmì150mm, 4àm).
Thnh phn ca pha ng A là nƣớc, pha động B là acetonitrile. Các pha động đƣợc
lọc qua một màng lọc 0,22µm và khử khí trƣớc khi sử dụng. Chƣơng trình gradient:
0 phút – 95%A, 15 phút - 95%A, 18 phút -100% B, 20 phút – 95% A. Thời gian đo
trong 20 phút. Đƣờng tuyến tính tốt (R2 = 0,9994 > 0,999). Hàm lƣợng SALC:
522,51±1,19 µg/mL. Phƣơng pháp này có độ thu hồi tƣơng đối cao >99%.

Tác giả Arnault và cộng sự [15] đã phát triển phƣơng pháp HPLC với

detetector UV để xác định S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen. Mẫu đƣợc chiết
lặp 2 lần bằng nƣớc tại nhiệt độ 700C, thời gian chiết 3-5h/1 lần chiết, loại cặn bằng
giấy lọc có kích thƣớc lỗ 0,5mm. Dịch lọc đƣợc bơm vào hệ thống HPLC-UV: cột
Hypurity Elite C18 (150ì3mm; 3àm), pha ng bao gồm kênh A: 20 mmol/L
sodium dihydrogenphosphate và 10 mmol/L hepta-nesulfonic acid trong nƣớc, pH
2,1 (điều chỉnh bằng orthophosphoric acid 850 mL/L); kênh B chứa dung dịch rửa
giải kênh A trộn với acetonitrile với tỷ lệ 1:1 (v/v) theo chƣơng trình gradient.
Detector UV tại bƣớc sóng phát hiện là 208nm, thời gian phân tích mẫu khoảng 50
phút. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 29,67 µg/mL cao hơn so với thí
nghiệm của tác giả Mun-su Kim, nhƣng thời gian phân tích tƣơng đối dài.

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 13 Trường ĐHKH Tự nhiên

1.3.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang

Năm 2012, Sang Eun Bae và các cộng sự [43] đã phát triển và thẩm định
phƣơng pháp xác định SALC trong tỏi đen. Mẫu tỏi đƣợc dẫn xuất với AQC khi
phân tích bằng HPLC đƣợc chuẩn bị nhƣ sau lấy khoảng 20mL dịch chiết tỏi thêm

vào 100mL thuốc thử AccQ-Flour (khoảng 10mM AccQ-Flour trong acetonitrile)
rồi tiến hành lắc Votex trong vài giây. Tiến hành gia nhiệt ở máy ổn nhiệt tại 550C,
lắc 15 phút rồi tiêm 20µL vào hệ thống HPLC. Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng với
cột C18 AccQ-Tag (150mm x 3,9mm x 0,4µm), nhiệt độ cột 370C, tốc độ dòng
1mL/phút. Detector huỳnh quang đƣợc thiết lập bƣớc sóng kích thích là 250nm và
bƣớc sóng phát xạ là 395nm. Chƣơng trình gradient tuyến tính với pha động A: 100
mL/L AccQ-Tag (sodium acetate (CH3COONa) 140 mmol/L, triethylamine 17

mmol/L, calcium disodium EDTA 1 mmol/L, pH 5,05) và pha động B: hỗn hợp
acetonitrile và nƣớc (theo tỷ lệ 3:2 về thể tích); A: 95-5, 70-30, 0-100, 95-5, 95-5
đƣợc sử dụng tƣơng ứng ở các khoảng 0-20 phút, 20-25 phút, 25-27 phút, 27-32
phút. Hệ thống cho phép tách chất chiết thô trong khoảng 32 phút. Hệ số biến thiên
(CV%) 7,08 – 7,90%, giới hạn phát hiện là 6,28 µg/mL.

Trong phân tích SALC, so với phƣơng pháp HPLC-UVD khi sử dụng
phƣơng pháp HPLC-FLD có LOD, LOQ lớn hơn xấp xỉ bốn lần so với phƣơng
pháp HPLC-UV. Những kết quả này liên quan đến độ nhạy của phƣơng pháp hay
nói cách khác, HPLC-UV có độ nhạy và độ phân giải thấp hơn so với HPLC-FLD.
Độ chụm và độ chính xác của phƣơng pháp phân tích tác giả pha các mẫu tự tạo đã
biết trƣớc hàm lƣợng và làm thí nghiệm để tìm giá trị trung bình. Hệ số biến thiên
(%CV) của SAC xấp xỉ 6,70 – 9,37 % (HPLC-UV), trong khi đó với phƣơng pháp
HPLC-FLD hệ số biến thiên 1,22- 1,67%. Theo Thông tƣ ICH Q2 (R1) (1995,
1997), độ chụm chuẩn có CV%<2%, do đó việc %CV thấp phản ánh độ chính xác
của phƣơng pháp phân tích [43].

1.3.1.3. Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

S-allyl-L-Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 14 Trường ĐHKH Tự nhiên

cystein đƣợc tách và xác định bằng LC-MS/MS, chế độ bắt đa mảnh phổ (Multiple
Reaction Monitoring: MRM): thế declustering: 122V, thế entrance 10V và năng
lƣợng va chạm 53V, thế mao quản 5500V, GS1 và GS2: 50 psi, nhiệt độ 500C. Điều
kiện sắc ký lỏng: cột C18 Zorbax Eclipse XDB (50 mm x2,1 mm, 1,8 mm), tốc độ
dòng chảy 0,2 mL/phút. Pha động bao gồm kênh A (dung dịch 0,1% formic acid
trong 20mM ammoniuom acetate (pH 3,5)) và kênh B (0,1% formic acid trong
ACN); phân tích theo chƣơng trình giải gradient: 40% B (0 phút), 100% B(6 phút),
100% B (8 phút), 40% B (8,5 phút). Kết quả thu đƣợc khối lƣợng phân tử ion (m/z)
là 395 (M + H)+, ion (m/z) 170, ion chính (m/z) 157 là dẫn xuất của SALC. Giới
hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,02 µg/mL.

Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [41] đã phát triển phƣơng pháp
LC-ESI-MS/MS sử dụng cột trao đổi ion. SALC đƣợc tách và xác định bằng hệ thống sắc ký
lỏng LC kết hợp thiết bị khối phổ QTRAP với nguồn ion hóa TurbolonSpray: GS1:
50psi, GS2: 30 psi, nhiệt độ probe: 5500C, thế mao quản 5000V. Điều kiện sắc ký
lỏng: cột CAPCELL PAK CR 1:4 (100 x 2,0 mm, 3 µm). Pha động: kênh A (2mM
đệm ammonium acetate (pH =3,5)) và kênh B (0,1% formic acid trong ACN), tốc
độ dòng 0,15 mL/phút. Kết quả phát hiện đƣợc mảnh m/z 162,0 – 145,0 của SALC.
Đƣờng cong chuẩn của SALC (r2=0,999) từ 5 đến 2500 ng/mL. Giới hạn phát hiện
của phƣơng pháp là 5,0 ng/mL. Khi tiến hành phân tách SALC, tác giả đã sử dụng
cột trao đổi ion thay vì cột C18 nhƣ các nghiên cứu phía trên. Đây là kỹ thuật mới,
đòi hỏi ngƣời thực hiện phải có những hiểu biết nhất định và tốn kém.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS sử dụng thiết bị
hiện đại, tƣơng đối đắt tiền nên không đƣợc trang bị nhiều trong các phịng thí
nghiệm. Mặt khác, vận hành thiết bị đòi hỏi kỹ thuật viên phải có kỹ thuật nhất
định, hiệu quả không cao.

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 15 Trường ĐHKH Tự nhiên

HPLC-FLD cho độ nhạy và hiệu suất cao nhƣng tính áp dụng thực tiễn không cao
do số lƣợng hệ thống HPLC ghép nối FLD đƣợc trang bị ít hơn so với detector PDA
nên sắc ký lỏng ghép nối detector PDA là tiền đề để nghiên cứu sau này.

1.3.2. Các phƣơng pháp xác định diallyl disulfide DADS

1.3.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV

Năm 2010, Tác giả Mun-su Kim và các cộng sự sử dụng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với detector UV để phân tích hàm lƣợng diallyl disulfide
(DADS) từ tỏi đen [35], thủy phân mẫu phân tích tại nhiệt độ phịng và chiết bằng
methanol. Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng pha thun C18 (3,9mmì150mm, 4àm), tc
dũng: 1mL/phỳt. Detector UV đƣợc thiết lập bƣớc sóng phát hiện là 210nm. Một
gradient rửa giải gồm nƣớc (kênh A), methanol (kênh B) đã đƣợc sử dụng để tách
DADS. Hàm lƣợng DADS là: 8,710 ± 0,45 µg/mL.

Trong phƣơng pháp phân tích này, tác giả đã tiến hành thủy phân mẫu bằng
cách đơn giản, hóa chất thơng dụng, dễ mua, chi phí giá thành thấp tuy nhiên dung
mơi chiết MeOH hòa tan nhiều tạp chất khác gây ảnh hƣởng lớn đến dung mơi phân
tích. Mặt khác giới hạn phát hiện của phƣơng pháp chƣa cao nên tính áp dụng thực
tiễn thấp.

1.3.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC/MS/MS)

Jiben Roy và các cộng sự [27] đã phát triển phƣơng pháp sắc ký lỏng khối
phổ chuỗi để xác định hàm lƣợng diallyl disulfide trong tỏi đen. Nghiên cứu này
cũng có giai đoạn thủy phân mẫu trong hỗn hợp nƣớc và methanol (tỷ lệ 1:1 về thể

tích), tốc độ ly tâm 2000 vòng/phút và lọc qua giấy lọc có kích thƣớc lỗ lọc 0,2 μm.
Sau đó, mẫu đƣợc bơm vào hệ thống sắc ký lỏng khối phổ chuỗi, detector MS-MS.
Trong nghiên cứu, tác giả đã sử dụng Cột Econosphere C-18 (10m, 250 mm x
10mm) và hệ dung môi pha động H2O:MeOH (1:1), tốc độ dòng 3 mL/phút. Thu

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 16 Trường ĐHKH Tự nhiên

1.3.2.3. Sắc ký khí (GC)

Năm 2013, Cathy J Watson và cộng sự đã phân tích DADS trong tỏi bằng
phƣơng pháp sắc ký khí với detector khối phổ (GC-MS). Sử dụng cột 30m, kích
thƣớc cột mao quản: đƣờng kính 250 µm, bề dày lớp film của pha pha tĩnh 0,25 µm.
Các thông số nhiệt độ đƣợc cài đặt: chƣơng trình lị ở 200C giữ trong 2 phút, rồi
tăng lên đến 2000C cứ tăng 100C/phút , tiếp tục tăng 350C/phút đến 3000C giữ nhiệt
độ này trong 1 phút. Tổng thời gian phân tích 27,85 phút. Khoảng quét từ 30-300
amu, tốc độ quét: 15,26 scan/giây. Nguồn ion hóa là 70eV. Khoảng tuyến tính
DADS là 0,5 – 50 µg/mL [17].

Năm 2014, Sung-Jin Lim và cộng sự đã sử dụng sắc khí khí với detector ion
hóa ngọn lửa để xác định ba hợp chất lƣu huỳnh hữu cơ là dimethyl disulfide,
diallyl disulfide và diallyl trisulfide trong thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh
học từ dịch chiết tỏi. Sau khi tách từ thuốc bảo vệ thực vật bằng cách chiết lỏng
lỏng với cột chiết pha rắn HLB và cột chiết pha rắn ENVI-Carb, tất cả các chất phân
tích đƣợc tách ra trên cột RTX-5 (30mx 250mm x250mm, RESTEK, Pennsylvania,
Mỹ); dòng Heli (99,999%, 3 mL/phút); nhiệt độ cột ban đầu ở 400C giữ trong 8
phút, 50C phút-1, 600C, 150C phút-1, 2300C (giữ trong 1 phút); nhiệt độ detector,
3000C; và thể tích tiêm 1 µL. Giới hạn định lƣợng của DADS là 0,063 mg/L. Độ thu
hồi DADS đạt 84,8±1,9% [46].

Đây là phƣơng pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao phù
hợp với chất dễ bay hơi và phân hủy nhƣ DADS. Bên cạnh đó, DADS là chất dễ bị
phân hủy, hàm lƣợng trong mẫu thấp nên khi sử dụng hệ thống GC ghép nối với
detector khối phổ cho kết quả chính xác hơn, tính đặc hiệu và hiệu suất cao hơn so
với các loại detector khác. Vì vậy, phƣơng pháp này đƣợc đề xuất để xác định hàm
lƣợng DADS trong tỏi đen.

</div>
(27)<div class='page_container' data-page=27>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

</div>
(28)<div class='page_container' data-page=28>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 18 Trường ĐHKH Tự nhiên

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Mục tiêu ghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là:

1. Xây dựng quy trình định lƣợng S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen bằng
HPLC-PDA.

2. Xây dựng quy trình định lƣợng Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen bằng
GC-MS.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm :

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ƣu để xác định hàm lƣợng SALC
trong tỏi đen bằng HPLC.

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ƣu để xác định hàm lƣợng DADS
trong tỏi đen bằng GC-MS.

- Đánh giá phƣơng pháp phân tích: độ đặc hiệu phƣơng pháp, khảo sát
khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới
hạn định lƣợng (LOQ), độ thu hồi, độ lặp lại.

- Áp dụng để phân tích hàm lƣợng SALC và DADS trong mẫu tỏi đen và
các sản phẩm từ tỏi đen.

2.1.3. Đối tƣợng

- Đối tƣợng mẫu: Tỏi đen và các sản phẩm làm từ tỏi đen đƣợc lấy ngẫu
nhiên trên thị trƣờng Hà Nội.

- Phƣơng pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên.
- Địa điểm: trên địa bàn nội thành Hà Nội.

- Khối lƣợng mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/ mẫu.
- Bảo quản và lƣu trữ mẫu: điều kiện thƣờng.

2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 
2.2.1. Hóa chất

</div>
(29)<div class='page_container' data-page=29>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 19 Trường ĐHKH Tự nhiên

 Chất chuẩn

- Chuẩn S-Allyl-L-Cystein (Sigma Aldrich, hàm lƣợng ≥98%). 
- Chuẩn Allyl disulfide (Sigma Aldrich, hàm lƣợng 80%). 
 Hóa chất dung môi

- Acetonitrile (Merck, Đức).
- Methanol (Merck, Đức).
- Amoni Acetate (Merk, Đức).
- Acetone (Merck, Đức).

- Nƣớc cất hai lần lọc qua màng 0,45µm sau đó rung siêu âm.
 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

 Phân tích hàm lƣợng S-allyl-L-cystein bằng HPLC-PDA

- Dung dịch chuẩn SALC: Cân khoảng 0,0100g SALC (M = 161g/mol)
cho vào bình định mức 50,0mL. Pha lỗng đến vạch bằng MeOH và lắc đều đƣợc
dung dịch chuẩn 200µg/mL. Dung dịch chuẩn bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh.

- Chuẩn bị mẫu tỏi đen để phân tích hàm lƣợng SALC: Cân khoảng 1,00 –
2,00 g mẫu tỏi đen đã đƣợc đồng nhất (bóc vỏ, nghiền nát). Tiến hành chiết lặp 2
lần bằng dung môi MeOH:H2O, tiến hành chiết lặp 2 lần bằng dung môi methanol

và nƣớc, rung siêu âm ở 700C và 60 phút, thu đƣợc dịch lọc định mức vào bình
50,0mL, lọc lấy dịch lọc và phân tích bằng hệ thống HPLC-PDA.

- Dẫn xuất FMOC-Cl 500µg/mL: Cân 0,0500g FMOC-Cl chuyển vào bình

định mức 50,0mL, định mức bằng ACN đến vạch và lắc đều, sau đó chuyển vào
bình thủy tinh tối màu.

- Pha động HPLC: Cân khoảng 0,770g amoni acetate vào bình định mức
500mL, định mức bằng nƣớc cất đến vạch và lắc đều, lọc qua bộ lọc và rung siêu
âm để khử bọt khí trƣớc khi phân tích sắc ký.

- Đệm borat: Cân khoảng 0,720g di-Natriumtetraborat-Decahydrat
(Na2B4O7.10H2O, M = 361g/mol) vào bình định mức 100mL, định mức bằng nƣớc

cất đến vạch và lắc đều đƣợc đệm borat có nồng độ 20,0mM. Điều chỉnh đến pH =
8,00 bằng NaOH 0,100N và HCl 8,00N.

</div>
(30)<div class='page_container' data-page=30>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 20 Trường ĐHKH Tự nhiên

- Dung dịch chuẩn DADS:

 Dung dịch chuẩn gốc 8000 µg/mL: Cân chính xác 501,3 mg chất
chuẩn DADS trên cân phân tích vào bình định mức 50,00mL, hịa tan
và chuyển vào bình định mức 50,00mL bằng MeOH, định mức bằng
dung mơi hịa tan ở nhiệt độ phịng, lắc kỹ, bảo quản ở ngăn tủ lạnh
2-80C sử dụng đƣợc trong 6 tháng.

 Dung dịch chuẩn trung gian 80 µg/mL: Hút khoảng 1,00 mL dung
dịch chuẩn gốc DADS 800 µg/mL vào bình định mức 100 mL đã
chứa một ít dung mơi MeOH, định mức tới vạch bằng MeOH.

 Dung dịch chuẩn làm việc: Pha dãy dung dịch chuẩn DADS chạy sắc

ký (3,20 – 80,0 µg/mL) từ dung dịch chuẩn trung gian. Định mức
bằng MeOH ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hỗn hợp.

- Chuẩn bị mẫu tỏi đen để phân tích hàm lƣợng DADS: Cân khoảng 2,00 –

3,00 g mẫu tỏi đen. Tiến hành chiết lặp 2 lần bằng dung môi MeOH, lắc ngang
tốc độ 270 vòng/ phút trong 60 phút. Thu dịch lọc vào bình định mức 10mL,
định mức đến vạch bằng MeOH và phân tích trên hệ thống GC-MS.

2.2.2. Dụng cụ phân tích

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc, ống đong.
- Micropipet các loại: 200, 1000, 5000 µL.

- Màng lọc 0,45 µm.

- Vial 1,8mL dùng trong sắc kí.

- Ống ly tâm 15mL, 50mL có nắp đậy kín.

- Một số dụng cụ thông thƣờng khác trong phịng thí nghiệm.

2.2.3. Thiết bị phân tích

- Bộ lọc chân không, Hãng Pall (Mỹ).

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, hãng Water, model: e2695, với các
bộ phận: bộ bơm trộn dung môi, bộ loại khí, buồng điều nhiệt, detector PDA 2998.

- Hệ thống sắc ký khí khối phổ, hãng Thermo, model: Trace GC Ultra.

- Máy rung siêu âm có gia nhiệt hãng Elmasonic.

</div>
(31)<div class='page_container' data-page=31>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 21 Trường ĐHKH Tự nhiên

- Cột mao quản SPB-5MS Agilent (30m x 0,32mm; 0,25µm).
- Tiền cột C18 Symmetry Waters (20mm x 3,9mm; 5µm).

- Bể rung siêu âm cách thủy.

- Cân phân tích hãng Metler Toledo độ chính xác 0,0001g.
- Máy ly tâm lạnh của hãng Hettich, Gemany.

- Máy Vortex của hãng Genius 3.
- Tủ lạnh dùng để bảo quản mẫu.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

S-allyl-L-cystein là hợp chất trong phân tử có khung cacbon cồng kềnh, phân
cực do đó nếu sử dụng phƣơng pháp sắc ký khí thƣờng khó bay hơi, chất phân tích cần
phải đƣợc dẫn xuất hóa chuyển về dạng hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt. Nếu sử dụng
phƣơng pháp sắc ký lỏng kết hợp detector khối phổ thì trang thiết bị đắt tiền, chi phí
khấu hao lớn, yêu cầu kỹ thuật phân tích cao. Mặt khác trong tỏi đen hàm lƣợng
S-allyl-L-cystein có hàm lƣợng cao do đó phù hợp với tách bằng sắc ký lỏng. Chính vì
vậy, xác định hàm lƣợng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen sử dụng hệ thống phân tích sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) gắn với detector PDA của hãng Water (hình 2.1). Đây
là phƣơng pháp hiện đại, có độ tin cậy cao, có tính ứng dụng rộng rãi.

</div>
(32)<div class='page_container' data-page=32>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 22 Trường ĐHKH Tự nhiên

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [1, 15], các bƣớc cần xử lý để phân tích hàm
lƣợng SALC bằng phƣơng pháp HPLC-PDA nhƣ sau:

- Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung mơi để chiết chất phân tích.
- Lắc votex để mẫu và dung môi đƣợc đảo trộn đều.

- Rung siêu âm để tăng hiệu suất hòa tan chất phân tích vào dung môi
chiết.

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và phần cặn.

- Loại bỏ phần cặn, dịch thu đƣợc lọc qua giấy lọc để làm sạch chất phân
tích.

- Bơm vào hệ thống HPLC để phân tích hàm lƣợng chất S-allyl-L-Cystein
có trong mẫu.

2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Diallyl disulfide là hợp chất dễ bay hơi, không phân cực và hàm lƣợng chất
trong mẫu thấp nên phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ đƣợc sử dụng phổ biến. Do
vậy, tiến hành xác định hàm lƣợng DADS bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ
(sử dụng hệ thống phân tích sắc ký khí khối phổ nhƣ hình 2.4). Đây là phƣơng pháp
hiện đại, cho độ nhạy cao và độ chính xác cao.

</div>
(33)<div class='page_container' data-page=33>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 23 Trường ĐHKH Tự nhiên

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [31, 35, 46], các bƣớc cần xử lý để phân tích
hàm lƣợng DADS bằng phƣơng pháp GC-MS nhƣ sau:

- Đồng nhất mẫu.

- Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung môi methanol để chiết chất phân
tích.

- Lắc votex để mẫu và dung môi đƣợc đảo trộn đều.

- Lắc ngang trong khoảng thời gian 60 phút để tăng hiệu suất hịa tan chất
phân tích vào dung mơi chiết.

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và phần cặn.

- Loại bỏ phần cặn, dịch thu đƣợc lọc qua giấy lọc để làm sạch chất phân
tích.

- Bơm vào hệ thống GC để phân tích hàm lƣợng chất diallyl disulfide có
trong mẫu.

2.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP

a) Tính đặc hiệu (Selectivity)

Lần lƣợt phân tích các dung dịch: mẫu chuẩn SALC, DADS; mẫu trắng và

mẫu trắng thêm chuẩn SALC, DADS trên hệ thống HPLC (đối với SALC) và hệ
thống GC-MS (đối với DADS), tiến hành so sánh thời gian lƣu của mẫu chuẩn, mẫu
thực và mẫu thực thêm chuẩn.

b) Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic sắc ký vào nồng
độ SALC, DADS:

- Từ dung dịch chuẩn gốc SALC 200 µg/mL, tiến hành pha loãng thành

dung dịch chuẩn trung gian và dãy chuẩn làm việc nổng độ khác nhau từ 1,60
µg/mL đến 40,0 µg/mL.

- Pha lỗng dung dịch chuẩn gốc DADS 8000µg/mL thành các dung dịch
chuẩn có nồng độ lần lƣợt là 3,2; 4,0; 5,3; 8,0; 16; 32; 48; 80 µg/mL.

</div>
(34)<div class='page_container' data-page=34>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 24 Trường ĐHKH Tự nhiên

Sau khi lập đƣờng chuẩn xong cần kiểm tra bằng phƣơng pháp tính ngƣợc lại
nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn, từ đó tính các giá
trị độ chệch theo cơng thức:

Trong đó:

: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn.
Ct: Nồng độ tính ngƣợc theo đƣờng chuẩn của các điểm chuẩn.

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn.

c) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Xác định LOD của phƣơng pháp HPLC-PDA để xác định hàm lƣợng SALC
bằng cách lựa chọn mẫu tỏi đen có hàm lƣợng SALC thấp và phân tích 10 lần song
song. Sau đó xác định LOD thơng qua giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, đánh giá
LOD đã tính đƣợc thơng qua giá trị R. LOD đáng tin cậy khi 4<R<10 [7].

Do DADS có hàm lƣợng ít trong mẫu nên xác định LOQ của phƣơng pháp
GC-MS dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu khi phân tích dung dịch mẫu trắng thêm
chuẩn DADS ở nồng độ dƣới 3,2µg/mL. Từ đó xác định đƣợc giới hạn định lƣợng
của phƣơng pháp.

d) Độ lặp lại của phương pháp

Xác định độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích SALC bằng phƣơng pháp
HPLC và phân tích DADS bằng phƣơng pháp GC-MS, xử lý đồng thời 6 mẫu tỏi
đen có hàm lƣợng SALC và DADS, tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC,
GC-MS ở các điều kiện đã chọn. Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua
độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tƣơng đối [7].

e) Độ thu hồi của phương pháp

</div>
(35)<div class='page_container' data-page=35>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 25 Trường ĐHKH Tự nhiên

2.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Các kết quả thu đƣợc trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều đƣợc xử lí
bằng phần mềm Empower - thiết bị HPLC của Hãng Water; phần mềm
Xcalibur - thiết bị GC-MS của Hãng Thermo.

- Ứng dụng phần mềm tin học Microsoft Office Excel.
- Sử dụng các công thức xử lí thống kê trong phân tích.

 Tính kết quả trung bình (mean) của n lần:

n
x

n
i






 1
i

 Độ lệch chuẩn: SD =

 Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = 

x

s x 100 
 Giới hạn phát hiện: LOD = 3 × SD

 Giá trị R để đánh giá LOD: R =

 Giới hạn định lƣợng: LOQ = 3,3× LOD
 Độ thu hồi:













100

c
m
c
m

m

C

R

Trong đó: x là giá trị trung bình của mẫu.
xi là giá trị lần thử nghiệm i của mẫu.

n là số lƣợng mẫu đem phân tích.

Cm: nồng độ SALC, DADS có trong mẫu (mg/100g).

Cm+c: nồng độ SALC, DADS có thêm chuẩn (mg/100g).

m : khối lƣợng cân mẫu (g).

mc : khối lƣợng chất chuẩn thêm vào (g).

2.6. PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Hàm lƣợng SALC, DADS trong mẫu tỏi đen đƣợc tính theo cơng thức:
G = C×V×k/m/1000

</div>
(36)<div class='page_container' data-page=36>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 26 Trường ĐHKH Tự nhiên

G: Hàm lƣợng SALC, DADS có trong mẫu (mg/g; mg/mL).
C: Nồng độ SALC, DADS tính đƣợc từ đƣờng chuẩn (µg/mL).
V: Thể tích dịch chiết cuối cùng phân tích máy (mL).

K: Hệ số pha loãng.

</div>
(37)<div class='page_container' data-page=37>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 27 Trường ĐHKH Tự nhiên

CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Do rất khó khăn trong việc tìm đƣợc mẫu trắng phù hợp với những mẫu tỏi
đen mà khơng có hàm lƣợng hai chất S-allyl-L-cystein (SALC) và Diallyl disulfide
(DADS), vì vậy tiến hành khảo sát các điều kiện trên cơ sở các mẫu khảo sát đƣợc

chuẩn bị nhƣ sau:

1. Thành phần nền để khảo sát các điều kiện, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ
thu hồi để phân tích hàm lƣợng SALC đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:

0,4mL H2O + 0,2 mL đệm borat (số mM muối borat 20mM, pH=8) + 0,2 mL dẫn

xuất FMOC 500µg/mL

2. Thành phần nền để khảo sát các điều kiện, độ đặc hiệu, độ lặp lại và
độ thu hồi để phân tích hàm lƣợng DADS đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:

1mL MeOH/ vial

Sau đây, trong luận văn này chúng tôi thống nhất gọi mẫu khảo sát là mẫu
trắng.

3.1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG 
SALC TRONG TỎI ĐEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA

3.1.1. Khảo sát điều kiện của phƣơng pháp HPLC-PDA để xác định hàm 
lƣợng S-allyl-L-cystein

3.1.1.1. Lựa chọn điều kiện detector

</div>
(38)<div class='page_container' data-page=38>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 28 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.1.1.2. Lựa chọn điều kiện phân tích S-allyl-L-cystein bằng phương pháp

HPLC-PDA

Nhóm hợp chất acid amin có khả năng hấp thụ bƣớc sóng trong khoảng
220-280nm, tham khảo một số tài liệu (trích dẫn tài liệu vào đây) và điều kiện của phịng 
thí nghiệm, chúng tơi đã lựa chọn các điều kiện phân tích nhƣ sau:

- Cột sắc ký pha đảo C18 của hãng Water (15cm x 4,6mm x 5µm), sử dụng

thêm tiền cột.

- Pha động: kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: acetonitrile. 
- Detector PDA tại bƣớc sóng 265 nm.

- Tốc độ dịng: 1mL/phút. 
- Thể tích tiêm mẫu: 10µL.

Các thơng số này sẽ đƣợc giữ cố định trong suốt quá trình nghiên cứu.

3.1.1.3. Khảo sát điều kiện dẫn xuất hóa

S-allyl-L-cystein ít hấp thụ bƣớc sóng trong vùng tử ngoại (UV) và vùng khả
kiến (VIS). Chính vì vậy, lựa chọn dẫn xuất hóa để tăng khả năng tách của
S-allyl-L-cystein bằng hệ thống HPLC-PDA. Mặt khác, dẫn xuất FMOC là một trong
những dẫn xuất phổ biến nhất để phân tích các acid amin trong đó có SALC. FMOC
có rất nhiều ƣu điểm nhƣ: có thể hình thành dẫn xuất nhanh (5 phút), và các dẫn
xuất này ổn định lên đến 100 phút. Các phản ứng tiếp theo của FMOC-Cl với SALC
cho phép giảm sự ảnh hƣởng của FMOC-OH hình thành trong mơi trƣờng kiềm khi
tiến hành phân tích sắc ký [12]. Với những ƣu điểm của dẫn xuất FMOC và dựa vào
điều kiện của phịng thí nghiệm, lựa chọn dẫn xuất FMOC để phân tích hàm lƣợng
SALC trong tỏi đen bằng hệ thống HPLC-PDA.

a) Khảo sát số mM muối borat

</div>
(39)<div class='page_container' data-page=39>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 29 Trường ĐHKH Tự nhiên 
Bảng 3.1. Khảo sát số mM muối borat

Số mM muối 
borat

Diện tích pic 
(µV*s)

Thời gian lƣu 
(phút)

10mM 213572 6,987

20mM 228758 6,912

50mM 200030 6,913

100mM 179245 6,912

Hình 3.1. Sắc đồ xác định SALC bằng HPLC – PDA với số mM muối borat là 
20mM

Theo kết quả từ bảng 3.1 và hình 3.1, tại giá trị số mM muối borat 0,02M
cho diện tích pic lớn nhất. Đồng thời pic nhọn và cân đối. Vì vậy chọn số mM muối
borat là 20mM cho quá trình dẫn xuất SALC với FMOC. Theo kết quả nghiên cứu
của tác giả Fabiani và cộng sự [12], tác giả đã sử dụng số mM muối borat là
200mM cao hơn 10 lần so với số mM muối borat đã khảo sát, do đó tiết kiệm đƣợc
hóa chất borat, giảm chi phí làm thí nghiệm mà hiệu quả tách tốt.

b) Khảo sát pH đệm borat

</div>
(40)<div class='page_container' data-page=40>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 30 Trường ĐHKH Tự nhiên 
Bảng 3.2. Khảo sát pH đệm borat

pH Diện tích 
pic (µV*s)

Thời gian lƣu 
(phút)

8,0 292103 6,917

8,5 232084 6,907

9,0 131287 6,905

9,5 200030 6,913

10,0 144076 6,946

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic SALC vào pH đệm borat 
bằng 8

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Waters; chế độ 
gradient; Pha động: kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: ACN; tốc độ dịng 1mL/phút;

Thể tích tiêm mẫu: 10µL; Detector PDA tại bước sóng 265 nm.

</div>
(41)<div class='page_container' data-page=41>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 31 Trường ĐHKH Tự nhiên

Qua kết quả khảo sát cho thấy, tại giá trị pH đệm borat 8 cho diện tích pic
lớn nhất. Đồng thời pic nhọn và cân đối. Vậy chọn pH đệm borat bằng 8 cho quá
trình dẫn xuất SALC với FMOC. Kết quả này cũng phù hợp với tác giả A. Fabinami
[12] đã chọn pH dẫn xuất FMOC bằng 8,2.

c) Khảo sát thời gian dẫn xuất

Thời gian dẫn xuất là một yếu tố quan trọng, ảnh hƣởng trực tiếp đến tín hiệu
của chất phân tích. Vì vậy, thực hiện khảo sát ở các thời gian dẫn xuất khác nhau 0
phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút và thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.3.

Bảng 3.3. Khảo sát thời gian dẫn xuất FMOC

Thời gian dẫn xuất Diện tích pic 
(µV*s)

Thời gian 
lƣu (phút) 
(phút)

0,00

5,00 596728 6,513

10,00 592336 6,533

15,00 599972 6,524

20,00 605383 6,510

Kết quả khảo sát cho thấy thời gian hình thành dẫn xuất nhanh 5 phút và dẫn
xuất này tƣơng đối ổn định. Vì vậy, thời gian dẫn xuất FMOC ít nhất là 5 phút trƣớc
khi tiến hành phân tích mẫu bằng HPLC-PDA. Kết quả này cũng phù hợp với tác
giả A. Fabinami [12] đã chọn thời gian dẫn xuất ít nhất 5 phút.

3.1.1.4. Khảo sát chương trình rửa giải của pha động

Tỷ lệ thành phần dung mơi tạo ra pha động có ảnh hƣởng lớn đến q trình
rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực
rửa giải của dung mơi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lƣu của
chất phân tích. Bƣớc đầu tiên, tiến hành khảo sát SALC khi phân tích ở chế độ đẳng
dịng trong thời gian 40 phút với tỷ lệ dung môi CH3COONH4:ACN lần lƣợt theo tỷ

</div>
(42)<div class='page_container' data-page=42>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 32 Trường ĐHKH Tự nhiên

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát SALC khi phân tích ở chế độ đẳng dịng

Kênh A 
(CH3COONH4

20mM)

Kênh B

(ACN) Diện tích pic (µV*s) Thời gian lƣu (phút)

40 60 58172 4,166

60 40 1103360 11,305

- 5

0.00
0.02
0.04
0.06

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Waters; chế độ đẳng 
dòng; Pha động: kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: ACN; tốc độ dòng 1mL/phút;

Thể tích tiêm mẫu: 10µL; Detector PDA tại bước sóng 265 nm.

Hình 3.4. Sắc đồ xác định SALC khi khảo sát ở chế độ đẳng dòng với tỷ lệ dung mơi 
CH3COONH4:ACN = 40:60, thời gian phân tích 40 phút

-0.010
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040

Minutes

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Waters; chế độ đẳng 
dịng; Pha động: kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: ACN; tốc độ dịng 1mL/phút;

Thể tích tiêm mẫu: 10µL; Detector PDA tại bước sóng 265 nm.

</div>
(43)<div class='page_container' data-page=43>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 33 Trường ĐHKH Tự nhiên

Theo kết quả từ bảng 3.4, hình 3.4 và hình 3.5, khi tỷ lệ kênh B (ACN) lớn thì
SALC đƣợc rửa giải sẽ ra sớm, tỷ lệ kênh B nhỏ thì quá trình diễn ra chậm, tốn thời
gian phân tích, tốn dung mơi hóa chất, điện năng và chân pic lỗng. Vì vậy, tiến hành
khảo sát chƣơng trình rửa giải gradient theo các chế độ gradient khác nhau để tìm
đƣợc gradient phù hợp. Các chƣơng trình gradient đƣợc lựa chọn khảo sát nêu trong
bảng 3.5. Các kết quả sắc đồ tƣơng ứng nêu trong các hình 3.6 đến 3.9.

Bảng 3.5. Các chương trình dung mơi gradient

Gra 1 Thời gian (phút) 0,00 15,00 20,01 25,00

% CH3COONH4 20mM 30 80 30 Stop

Gra 2 Thời gian (phút) 0,00 15,00 20,01 25,00

% CH3COONH4 20mM 45 80 45 Stop

Gra 3 Thời gian (phút) 0,00 10,00 20,01 25,00

% CH3COONH4 20mM 70 20 75 Stop

Gra 4 Thời gian (phút) 0,00 20,00 20,01 25,00

% CH3COONH4 20mM 70 20 70 Stop

S
A
L
C

2
.7
0
1

2
1
1
4
8
1
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Hình 3.6. Sắc đồ chuẩn SALC 4 µg/mL 
theo chương trình dung môi gradient 1

S
A
L
C

4
.7
7
2

1
2
4
5
5
7
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Hình 3.7. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL 
theo chương trình dung mơi gradient 2

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Water; Pha 
động: kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: ACN; tốc độ dòng 1mL/phút; Thể tích

</div>
(44)<div class='page_container' data-page=44>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 34 Trường ĐHKH Tự nhiên

S
A
L
C

5
.2
1
0

1
9
3
2
7
1
AU
0.00

0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Hình 3.8. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL 
theo chương trình dung môi gradient 3

S
A
L
C

6
.5
5
5

1
7
3
9
8
7
AU
0.00

0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL 
theo chương trình dung mơi gradient 4

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Water; Pha động: 
kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: ACN; tốc độ dòng 1mL/phút; Thể tích tiêm mẫu:

10µL; Detector PDA tại bước sóng 265 nm.

Nhận xét:

- Trong chƣơng trình gradient 2 khi thực hiện sự thay đổi tỷ lệ giữa hai

thành phần pha động theo thời gian thì chất phân tích và dẫn xuất dƣ đã tách ra khỏi
nhau nhƣng chƣa hoàn tồn.

- Với chƣơng trình gradient 3 và 4, pic SALC và pic dẫn xuất dƣ đã tách

đƣợc khỏi nhau tƣơng đối, pic cân xứng rõ ràng, phân bố thời gian lƣu hợp lý. Do
vậy lựa chọn theo chƣơng trình gradient 3 và 4.

- Tuy nhiên, tại sắc đồ phân tích định lƣợng SALC trong mẫu tỏi đen bằng

</div>
(45)<div class='page_container' data-page=45>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 35 Trường ĐHKH Tự nhiên

- 1

0.00

0.02
0.04
0.06
0.08
0.10

Minutes

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Water; Pha động: 
kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: ACN; tốc độ dịng 1mL/phút; Thể tích tiêm mẫu:

10µL; Detector PDA tại bước sóng 265 nm

Hình 3.10: Sắc đồ xác định hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen khi phân tích trên 
hệ thống HPLC-PDA

3.1.2. Khảo sát điều kiện chiết mẫu

Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết

Mức độ hịa tan của một chất trong các hệ dung mơi khác nhau là khác nhau.
Một chất có thể hịa tan kém trong dung mơi ngun chất, nhƣng lại có thể hịa tan
tốt hơn trong hệ dung mơi của chính nó. Do đó việc lựa chọn hệ dung mơi trong
tách chiết cũng có vai trị quan trọng. Nƣớc là dung mơi rẻ tiền, phổ biến, có khả
năng hịa tan khơng hạn chế trong alcohol. Do đó cần khảo sát khả năng chiết SALC
trong tỏi đen của hệ dung môi metanol-nƣớc theo các tỉ lệ khác nhau, nhằm tăng
hiệu quả quá trình chiết.

</div>
(46)<div class='page_container' data-page=46>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 36 Trường ĐHKH Tự nhiên 
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết methanol : nước

Tỉ lệ

methanol:nƣớc 0:100 40:60 50:50 70:30 100:0
Khối lƣợng mẫu

tỏi đen (g) 14,984 15,431 15,746 15,436 15,625
Hàm lƣợng

SALC (µg/g) 139,4 145,6 202,2 155,27 65,72

Qua kết quả khảo sát cho thấy, hàm lƣợng SALC thu đƣợc khi chiết ở tỉ lệ
dung môi methanol:nƣớc = 50:50 là tốt nhất. Vì vậy chọn tỉ lệ dung môi
methanol:nƣớc = 50:50 để chiết SALC trong mẫu tỏi đen.

0.00
0.05
0.10

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Điều kiện phân tích HPLC: Cột sắc ký C18 (15cm x 4,6mm x 5µm) của hãng Waters; chế độ 
gradient theo chương trình 4 (như mục 3.1.2.4); Pha động: kênh A: dung dịch amoni acetate 
20mM, kênh B: ACN; tốc độ dịng 1mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10µL; Detector PDA tại bước

sóng 265 nm.

Hình 3.11. Sắc đồ xác định SALC bằng phương pháp phân tích HPLC-PDA tỷ lệ 
dung mơi chiết MeOH:H2O = 50:50

3.1.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 
3.1.3.1. Độ đặc hiệu

</div>
(47)<div class='page_container' data-page=47>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 37 Trường ĐHKH Tự nhiên

- Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic nào có cùngthời gian
lƣu với pic của SALC trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn SALC.

- Đồng thời trên sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn xuất hiện pic SALC

đƣợc tách riêng rẽ.

Nhƣ vậy, quy trình đã thiết lập đáp ứng đƣợc yêu cầu về độ đặc hiệu khi
phân tích SALC.

- 1

0.00
0.10
0.20
0.30

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Hình 3.12. Sắc đồ của dung dịch chuẩn SALC

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Hình 3.13. Sắc đồ của dung dịch mẫu trắng

- 1

0.00
0.05

0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Hình 3.14. Sắc đồ của dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn SALC

</div>
(48)<div class='page_container' data-page=48>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 38 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.1.3.2. Khoảng tuyến tính và lập phương trình đường chuẩn

Với các điều kiện phân tích HPLC đã chọn, tiến hành khảo sát sự phụ thuộc
tuyến tính của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của SALC. Từ dung dịch chuẩn gốc
200 µg/mL, tiến hành pha loãng thành dung dịch chuẩn trung gian và dãy chuẩn làm
việc ở các nồng độ khác nhau từ 1,6 µg/mL tới 40 µg/mL. Sau đó tiến hành bơm
vào hệ thống HPLC. Thiết lập phƣơng trình tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích
pic của SALC theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính. Kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng
3.7.

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ SALC

Nồng độ SALC (µg/mL) 1,6 4,0 8,0 32,0 40,0

Diện tích pic SALC (µV*s) 18842 117893 191214 641118 1256034

Tại nồng độ lớn hơn 40 µg/mL, diện tích của pic SALC tăng lên khơng tuyến
tính với nồng độ chất phân tích tƣơng ứng. Do đó, xây dựng đƣờng chuẩn trong
khoảng từ 1,6 đến 40 µg/mL (hình 3.15).

Hình 3.15. Đường chuẩn của SALC

Ngoài ra, để khảo sát thêm độ phù hợp của đƣờng chuẩn, từ đƣờng chuẩn thu
đƣợc và từ diện tích pic chúng tơi đã tính lại nồng độ tƣơng ứng của SALC, từ đó xác
định các giá trị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu. Kết quả đƣợc nêu ở bảng 3.8.

Nhận xét: Từ kết quả trên bảng 3.8 và hình 3.15 ta thấy: đƣờng chuẩn có

</div>
(49)<div class='page_container' data-page=49>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 39 Trường ĐHKH Tự nhiên

đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic với nồng độ SALC
tƣơng ứng là đạt yêu cầu và đƣợc chấp nhận.

Bảng 3.8. Độ lệch của từng điểm chuẩn SALC dùng xây dựng đường chuẩn

Nồng độ ban

đầu Diện tích pic Nồng độ tính ngƣợc theo đƣờng chuẩn Độ lệch

(µg/mL) (µV*s) (µg/mL) (%)

1,6 18842 1,136 -0,290

4,0 117893 4,244 0,062

8,0 191214 6,544 -0,182

20,0 641118 20,658 0,033

40,0 1256034 39,948 -0,001

3.1.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Lựa chọn mẫu tỏi đen có hàm lƣợng SALC thấp và phân tích 10 lần song
song, và dịch lọc đƣợc định mức đến vạch 50mL sau đó phân tích trên hệ thống
HPLC. Giới hạn phát hiện tính theo độ lệch chuẩn SD, và đƣợc kiểm tra bằng giá trị
R. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả đo mẫu tỏi đen hàm lượng thấp

Lần 
PT

Khối

lƣợng cân tích pic Diện C lƣợng Hàm TB LOD R 
(g) (µV*s) (µg/mL) (µg/g) (µg/g)

1 4,4166 5871 0,845 9,566

10,04 0,5540 5,417

2 4,3807 6734 0,882 10,05

3 4,3418 6684 0,879 10,12

4 4,3174 6494 0,870 10,08

5 4,3302 6781 0,882 10,19

6 4,3663 6587 0,875 10,02

7 4,3382 6782 0,882 10,18

8 4,3307 6319 0,864 9,971

9 4,3215 6513 0,872 10,08

</div>
(50)<div class='page_container' data-page=50>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 40 Trường ĐHKH Tự nhiên

Theo AOAC, để đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính bằng R= = 5,417
Với 4<R<10 [7] thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính đƣợc là đáng tin
cậy.

Vậy LOD của phƣơng pháp là 0,5540 (µg/g).
LOQ = 3 x LOD = 3 x 0,5540 = 1,632 (µg/g).

3.1.3.4. Độ lặp lại

Khảo sát trên mẫu tỏi đen có phát hiện SALC. Xử lý đồng thời 6 mẫu và định
mức đến vạch của bình định mức 50mL, tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC ở
các điều kiện đã chọn. Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua độ lệch
chuẩn và độ lệch chuẩn tƣơng đối. Tiến hành làm lặp lại 6 lần với mẫu tỏi đen thu
đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.10 và bảng 3.11.

Bảng 3.10. Kết quả độ lặp lại khi phân tích hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen

Lần 
PT

Khối lƣợng 
cân

Diện tích

pic C Hàm lƣợng TB RSD

(g) (µV*s) (µg/mL) (µg/g) (µg/g) (%)

1 16,802 55587 2,589 77,04 76,26 3,414

2 16,361 50351 2,410 73,66

3 16,539 54257 2,544 76,89

4 16,834 58607 2,692 79,96

5 16,737 51186 2,438 72,85

6 16,421 53954 2,533 77,13

Bảng 3.11. Bảng đối chiếu kết quả độ lặp lại của phương pháp HPLC-PDA để phân 
tích hàm lượng SALC trong tỏi đen theo AOAC

Thông số Mức yêu cầu theo AOAC [6] % Kết quả

RSD Nồng độ 100 ppm ≤ 5,300% 3,414% (Đạt)

Nồng độ 10 ppm ≤ 7,300% 3,414% (Đạt)

</div>
(51)<div class='page_container' data-page=51>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 41 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.1.3.5. Độ thu hồi

Sử dụng mẫu tỏi dùng xác định độ lặp để tiếp tục xác định độ thu hồi. Tiến
hành thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau. Mỗi mức lặp lại 4 lần. Sau đó định
mức dịch lọc đến vạch 50mL của bình định mức 50mL bằng dung môi chiết. Các
kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.12 và 3.13 với các nền mẫu là tỏi đen.

Bảng 3.12. Kết quả độ thu hồi khi phân tích hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen ở 3 
mức nồng độ khác nhau

STT 
mẫu

Khối

lƣợng cân Cc

Diện 
tích

pic

C lƣợng Hàm suất R Hiệu

(g) (µg/mL) (µV*s) (µg/mL) (µg/g) (%)

1a 18,905 40,0 41361 3,650 96,539 97,1

1b 18,261 40,0 39989 3,597 100,133 102,6

1c 18,258 40,0 40149 3,603 99,223 103,5

1d 18,924 40,0 41425 3,652 96,508 97,0

2a 17,982 80,0 59484 4,349 120,946 101,0

2b 18,472 80,0 59967 4,368 118,242 97,5

2c 18,502 80,0 60325 4,382 118,424 98,1

2d 18,061 80,0 59982 4,368 120,949 101,4

3a 16,896 120 74811 4,941 146,228 98,9

3b 17,484 120 77065 5,028 143,798 98,8

3c 18,012 120 80052 5,144 142.783 100,2

3d 19,092 120 87092 5,415 141,823 104,7

Bảng 3.13. Bảng đối chiếu kết quả độ thu hồi của phương pháp HPLC-PDA để 
phân tích hàm lượng SALC trong tỏi đen theo AOAC

Thông số Mức yêu cầu theo AOAC [7] % Kết quả %

R(%) Nồng độ 0,1% 95-105 % 97,02-104,7 (đạt)

</div>
(52)<div class='page_container' data-page=52>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 42 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.1.4. Áp dụng phân tích S-allyl-L-cystein trong một số mẫu thực tế

Từ các điều kiện đã đƣợc tối ƣu (mục 3.1.1), đảm bảo cho phân tích hàm
lƣợng S-allyl-L-cystein bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-PDA.
Do vậy, triển khai áp dụng phƣơng pháp phân tích một số mẫu thực tế đang đƣợc
lƣu hành trên địa bàn Hà Nội để kiểm nghiệm một số mẫu tỏi đen, các sản phẩm từ
tỏi đen theo quy trình nhƣ hình 3.16. Kết quả phân tích hàm lƣợng SALC trong một
số mẫu thực tế nhƣ bảng 3.14 và hình 3.17.

Hình 3.16. Quy trình tách và xác định hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen [12]

Đồng nhất mẫu

Cân 1 – 2g mẫu/ ống ly tâm 50mL

Phần bã

Gạn dịch trong vào bình 50mL

Thêm 25mL MeOH:H2O=50:50

Lắc Vortex, 1 phút

Rung siêu âm ở 700C, 60 phút
Ly tâm 6000 v/p, 5 phút

Thêm 15mL MeOH:H2O=50:50

Lắc Vortex, 1 phút

Rung siêu âm ở 700C, 60 phút
Ly tâm 6000 v/p, 5 phút

Định mức 50mL bằng MeOH:H2O = 50:50

Lọc qua giấy lọc, kích thƣớc lỗ lọc 0,45µm

0,4 mL dịch chiết + 0,2 mL số mM muối 
borat 20mM (pH=8) + 0,2 mL FMOC Cl 
500ppm

Phân tích

trên thiết 
bị HPLC

</div>
(53)<div class='page_container' data-page=53>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 43 Trường ĐHKH Tự nhiên 
Bảng 3.14. Kết quả phân tích hàm lượng SALC trong một số mẫu thực tế

Tên mẫu Dạng mẫu Xuất xứ Hàm lƣợng (µg/g)

TĐ1 Củ tỏi Việt Nam 27,081

TNB1 Củ tỏi Nhật Bản 26,358

TNB2 Củ tỏi Nhật Bản 20,842

TĐHQ1 Củ tỏi Hàn Quốc 39,464

TĐKO1 Củ tỏi Việt Nam 32,871

- 1

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10

Minutes

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

sóng 265 nm.

Hình 3.17. Sắc đồ của dung dịch mẫu TĐ1 khi phân tích trên hệ thống HPLC-PDA

Các kết quả đã nêu ở trên cho thấy hàm lƣợng của các mẫu tỏi đen những
vẫn dao động trong khoảng tuyến tính đã khảo sát từ 1,6 – 40 µg/mL. Theo kết quả
nghiên cứu nhƣ đã nêu mục 1.1.3, kết quả dao động nhƣ vậy do một trong các
nguyên nhân sau:

- Nguồn nguyên liệu tỏi đen khác nhau.

- Quá trình lên men khác nhau, đặc biệt quá trình sấy do SALC rất dễ hỏng
trong quá trình sấy khi ở nhiệt độ cao và lâu.

</div>
(54)<div class='page_container' data-page=54>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 44 Trường ĐHKH Tự nhiên

trong sản phẩm không bị phân hủy. Để loại nƣớc sau quá trình lên men, các nhà sản
xuất có thể sử dụng biện pháp sấy ở áp suất giảm hoặc sử dụng các thiết bị hút ẩm
khác. Bên cạnh đó, nhà sản xuất cần thƣờng xuyên phải lấy mẫu để kiểm tra chất
lƣợng và tính đồng nhất của sản phẩm để cải thiện quy trình sản xuất tỏi đen nhằm
tránh giảm hàm lƣợng SALC trong quá trình gia nhiệt.

3.2. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG 
DADS TRONG TỎI ĐEN BẰNG GC - MS

3.2.1. Lựa chọn các điều kiện của phƣơng pháp GC-MS để xác định hàm 
lƣợng DADS

3.2.1.1. Lựa chọn cột tách

Cột tách có vai trị quan trọng trong việc tách các chất khỏi nhau. Tùy thuộc
vào bản chất của hỗn hợp phân tích mà lựa chọn cột tách với pha tĩnh thích hợp.
Theo nghiên cứu Sung Jin Lim[46], để phân tích DADS có thể chọn cột mao quản
nhƣ RTX5. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, lựa chọn cột tách mao quản
SPB-5MS với các thông số nhƣ sau:

- Chiều dài cột: 30m.

- Đƣờng kính trong: 0,32mm.
- Bề dày lớp phim: 0,25µm.

3.2.1.2. Lựa chọn chương trình nhiệt độ cột tách

Qua tham khảo và nghiên cứu tài liệu [46], tiến hành chọn chƣơng trình nhiệt
độ cột tách nhƣ sau: nhiệt độ cột ban đầu ở 400C giữ trong 6 phút, tiếp tục tăng
100C phút-1 cho đến khi đạt nhiệt độ 2000C, giữ trong 2 phút.

- Khí mang: Heli với vận tốc 1,0mL/phút.
- Thể tích bơm mẫu 1µL.

- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 2500C.
- Kiểu bơm: bơm khơng chia dịng.

- Nhiệt độ đƣờng chuyển giữa GC và MS: 2600C.
- Nguồn EI 70eV, nhiệt độ nguồn ion 2000C.
- Chế độ Full scan 30-120 amu.

</div>
(55)<div class='page_container' data-page=55>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 45 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.2.2. Khảo sát điều kiện chiết mẫu

Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết

Qua tài liệu tham khảo và nghiên cứu sơ bộ cho thấy (theo mục 1.2.2.1), Diallyl
disulfide (DADS) là chất dễ bay hơi nên không sử dụng nhiệt độ trong q trình chiết
để tránh chất bị chuyển hóa sang chất khác và thất thốt trong q trình chiết. DADS là
chất dễ hịa tan trong các dung mơi nhƣ ethanol, acetone, methanol… Mặt khác, DADS
là một hoạt chất khó tan trong hexan và diethyl ether do khả năng phân tán kém trong
những dung mơi này. Do đó, cần tiến hành khảo sát khả năng chiết DADS trong tỏi đen
với các dung môi khác nhau ethanol, acetone và methanol, nhằm tăng hiệu suất của quá
trình chiết. Quá trình chiết tiến hành trong 100 phút. Dịch chiết đƣợc định mức bằng
dung mơi chiết vào bình định mức 10mL. Kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.15 và sắc ký đồ
nêu ở hình 3.18.

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết ethanol, acetone và methanol

Dung môi chiết Ethanol Acetone Methanol 
Khối lƣợng mẫu

tỏi đen (g) 3,0681 3,1684 3,1253

Hàm lƣợng DADS

(µg/g) 27,260 25,888 28,604

Hình 3.18. Sắc đồ xác định DADS khi chiết bằng dung môi MeOH

Qua kết quả khảo sát cho thấy, hàm lƣợng DADS thu đƣợc khi chiết ở tỉ lệ
dung môi methanol là tốt nhất. Vậy chọn dung môi methanol để chiết DADS trong
mẫu tỏi đen.

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

lat

ive

nce

RT: 12.61
MA: 841006

15.76

</div>
(56)<div class='page_container' data-page=56>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 46 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.2.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 
3.2.3.1. Độ đặc hiệu

Lần lƣợt phân tích các dung dịch: mẫu chuẩn, mẫu trắng và mẫu trắng thêm
chuẩn trên hệ thống GC-MS với các điều kiện nhƣ trên. Kết quả thu đƣợc nhƣ hình
3.19 và hình 3.20.

₋ Sắc đồ mẫu trắng khơng có pic nào trùng thời gian lƣu với các pic trong
sắc đồ mẫu chuẩn DADS.

₋ Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn có pic trùng thời gian lƣu với pic trong sắc
đồ mẫu chuẩn DADS. Đồng thời pic này đều có phổ khối với các mảnh
ion đặc trƣng có tỉ lệ giống nhau.

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
RT: 12.66
MA: 390577
15.83

13.03 13.78 15.96 18.26 18.78 20.46 21.00 22.30 23.00
NL:
1.10E5

m/z=

38.50-39.50+

78.50-79.50 MS
Std-4ppm

Điều kiện phân tích GC-MS: Cột mao quản C18 (30m x 0,32mm x 0,25µm); chế độ gradient nhiệt 
độ (như mục 3.2.1.2); tốc độ dịng 1mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: 1µL; Nguồn EI 70eV, nhiệt độ

nguồn ion 2000C, chế độ Full scan 30-120 amu; định lượng ở chế độ lọc ion: 39 và 79. 
Hình 3.19. Sắc đồ của dung dịch chuẩn DADS 4,0 µg/mL

Blank-spk #138 RT:12.67 AV:1 NL:6.65E3
T:+ c Full ms [30.00-120.00]

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
31.81
38.85
40.85
43.86
36.81 44.83

54.92 63.85 78.94

47.84 68.89 84.88 97.08 112.80

</div>
(57)<div class='page_container' data-page=57>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 47 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.2.3.2. Xây dựng đường chuẩn

Các dung dịch dùng để dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng từ dung dịch
chuẩn gốc có nồng độ 800 µg/mL. Các dung dịch này có nồng độ biến thiên trong
khoảng 3,2 đến 80 µg/mL. Số liệu để dựng đƣờng chuẩn dựa vào sự phụ thuộc của
diện tích pic vào nồng độ DADS. Kết quả về sự phụ thuộc giữa diện tích pic và
nồng độ DADS đƣợc chỉ ra ở bảng 3.16, 3.17 và hình 3.21.

Bảng 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ DADS

Nồng độ 
DADS 
(µg/mL)

3,2 4,0 5,3 8,0

Diện tích pic

(µV*s) 235614 390577 453210 826174
Nồng độ

DADS 
(µg/mL)

16 32 48 80

Diện tích pic

(µV*s) 1480324 3141195 4716256 7928251

Hình 3.21. Đường chuẩn của DADS xác định bằng phương pháp GC-MS

</div>
(58)<div class='page_container' data-page=58>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 48 Trường ĐHKH Tự nhiên

dựng đƣờng chuẩn. Theo AOAC [7], độ chệch không đƣợc lệch quá ±15% để tránh
sự sai số khi tính tốn hàm lƣợng chất.

Bảng 3.17. Độ lệch của từng điểm chuẩn DADS dùng xây dựng đường chuẩn

Nồng độ ban đầu Diện tích pic Nồng độ tính ngƣợc theo đƣờng chuẩn Độ lệch

(µg/mL) (µV*s) (µV*s) (%)

3,2 235614 2,859 -10,653

4,0 390577 4,416 10,388

5,3 453210 5,045 -4,818

8,0 826174 8,791 9,883

16 1480324 15,361 -3,994

32 3141195 32,043 0,133

48 4716256 47,863 -0,286

80 7928251 80,124 0,155

Nhận xét: Từ kết quả trên bảng 3.17 và hình 3.21 ta thấy: đƣờng chuẩn có

R2 > 0,995, các giá trị độ lệch chuẩn so với điểm chuẩn ban đầu cũng đều nằm trong
giới hạn ±15% theo yêu cầu của nhiều tổ chức Mỹ, Canada, AOAC. Nhƣ vậy,
đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic với nồng độ DADS
tƣơng ứng là đạt yêu cầu và đƣợc chấp nhận.

Qua tham khảo kết quả của tác giả Cathy J Watson [17] cho thấy khoảng
tuyến tính 0,5-50 µg/mL nhỏ hơn khoảng tuyến tính đã khảo sát mà cùng sử dụng
phƣơng pháp GC-MS. Sự sai khác này có thể do rất nhiều nguyên nhân: sử dụng
chƣơng trình gradient nhiệt độ khác nhau, cột mao quản khác nhau…

3.2.3.3. Giới hạn định lượng (LOQ)

</div>
(59)<div class='page_container' data-page=59>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 49 Trường ĐHKH Tự nhiên

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20

25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.68
MA: 17575
18.75
19.04
20.46
20.14

14.67
21.13
12.87
14.73
13.00 15.56
16.40
17.25 19.10
23.37
21.31
NL:
8.17E3
m/z=

38.50-39.50+
78.50-79.50
MS
Blank-spk

nguồn ion 2000C, chế độ Full scan 30-120 amu; định lượng ở chế độ lọc ion: 39 và 79.

Hình 3.22. Sắc đồ của DADS tại mức dưới định lượng

3.2.3.4. Độ lặp lại

Tiến hành phân tích đồng thời 6 lần mẫu sản phẩm tỏi đen theo quy trình đã
xây dựng ở trên. Thu dịch lọc và định mức đến vạch của bình định mức 10mL. Sau
đó phân tích trên hệ thống GC-MS Đánh giá độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn

tƣơng đối RSD. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.18, 3.19.

Bảng 3.18. Kết quả độ lặp lại khi phân tích hàm lượng DADS trong mẫu tỏi đen

Mẫu

Khối

lƣợng cân Diện tích pic C lƣợng Hàm TB RSD 
(g) (µV*s) (µg/mL) (µg/g) (µg/g) (%)

1 3,3202 2180709 17,043 51,330 50,939 3,439

2 3,5702 2287535 17,846 49,957

3 3,1199 2079565 16,292 52,219

4 3,1527 2125822 16,635 52,765

5 3,1655 1929060 15,174 47,936

</div>
(60)<div class='page_container' data-page=60>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 50 Trường ĐHKH Tự nhiên 
Bảng 3.19. Bảng đối chiếu kết quả độ lặp lại của phương pháp GC-MS để phân tích

hàm lượng DADS trong tỏi đen theo AOAC

Thông số Mức yêu cầu AOAC [7] % Kết quả

RSD Nồng độ 100 ppm ≤ 5,300% 3,439% (Đạt)

Nồng độ 10 ppm ≤ 7,300% 3,439% (Đạt)

Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu khi xác định hàm lƣợng DADS.

3.2.3.5. Độ thu hồi

Tiến hành đánh giá độ thu hồi của nền mẫu tỏi đen ở 3 mức nồng độ.

- Mức 1: thêm 0,01mL DADS 8000µg/mL. 
- Mức 2: thêm 0,02mL DADS 8000µg/mL. 
- Mức 3: thêm 0,05mL DADS 8000µg/mL.

Sau đó tiến hành định mức dịch lọc đến vạch của bình định mức 10mL bằng
MeOH, phân tích trên hệ thống GC-MS thu đƣợc bảng kết quả nhƣ bảng 3.20.

Bảng 3.20. Kết quả độ thu hồi khi phân tích hàm lượng DADS trong mẫu tỏi đen

STT 
mẫu

Khối

lƣợng cân Cc

Hệ 
số 
pha 
lỗng

Diện tích

pic C

Hàm 
lƣợng

Hiệu 
suất R 
(g) (µg) (µV*s) (µg/mL) (µg/g) (%)

1a 29,564 8,0 2 1973391 15,503 104,880 99,7

1b 30,567 8,0 2 2039493 15,994 104,650 102,6

1c 29,831 8,0 2 2033317 15,948 106,924 104,4

2a 29,917 20 2 3513214 26,936 180,073 96,6

2b 29,764 20 2 3480736 26,695 179,378 95,6

2c 27,615 20 2 3612459 27,673 200,421 103,2

3a 29,957 40 2 6297598 47,610 317,855 99,9

3b 31,235 40 2 6487290 49,018 313,868 102,6

3c 30,683 40 2 6345150 47,963 312,635 100,4

</div>
(61)<div class='page_container' data-page=61>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 51 Trường ĐHKH Tự nhiên

3.2.4. Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế

Diallyl disulfide là chất dễ bay hơi nên không sử dụng nhiệt độ trong quá
trình chiết để tránh làm mất chất phân tích. Mặt khác, dựa vào q trình khảo sát
thực nghiệm, đã đƣa ra đƣợc quy trình thực nghiệm phân tích hàm lƣợng DADS
bằng hệ thống GC-MS [46] (Hình 3.23.)

Hình 3.23. Quy trình tách và xử lý mẫu tỏi đen để phân tích hàm lượng DADS

Đồng nhất mẫu

Cân 2 – 3g mẫu/ ống ly tâm 15mL

Phần bã

Thêm 5mL MeOH
Lắc Vortex, 1 phút

Lắc ngang tốc độ 270 vòng/ phút, 60 phút
Ly tâm 6000 v/p, 5 phút

Định mức 10mL bằng MeOH
Thêm 3mL MeOH

Lắc Vortex, 1 phút

Lắc ngang tốc độ 270 vòng/ phút, 60 phút
Ly tâm 6000 v/p, 5 phút

Gạn dịch trong bình 10mL

Thu dịch trong

Lọc qua giấy lọc, kích thƣớc lỗ lọc 0,45µm

1 mL dịch chiết

</div>
(62)<div class='page_container' data-page=62>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 52 Trường ĐHKH Tự nhiên

Các thông số kỹ thuật của thiết bị GC-MS:

- Cột tách: Cột mao quản SPB-5MS (30m × 0,32mm x 0,25µm). 
- Detector khối phổ.

- Pha động: Phân tích theo chƣơng trình gradient: nhiệt độ cột ban đầu ở

400C giữ trong 6 phút, tiếp tục tăng 100C phút-1cho đến khi đạt nhiệt độ
2000C, giữ trong 2 phút.

- Thể tích bơm 1µL.

- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 2500C.

- Kiểu bơm: bơm khơng chia dịng, 1 phút. 
- Transferline: 2600C.

- Nguồn IE 70eV, nhiệt độ 2000C.

- Chế độ Full scan 30-120 amu.

- Định lƣợng ở chế độ chọn lọc ion 39 và 79.

Triển khai áp dụng phƣơng pháp phân tích đã xây dựng ở trên để kiểm
nghiệm một số mẫu tỏi đen thành phẩm sau khi lên men và tiến hành so sánh với
các nghiên cứu khác. Kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.21, hình 3.24.

Bảng 3.21. Kết quả phân tích hàm lượng DADS trong một số mẫu thực tế

Tên mẫu Dạng mẫu Xuất xứ Hàm lƣợng DADS 
(µg/g)

TD1-2996-dva Củ Hàn Quốc 56,31

TD2-2996-dvb Củ Việt Nam 66,94

</div>
(63)<div class='page_container' data-page=63>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 53 Trường ĐHKH Tự nhiên

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

lat

ive

RT: 12.87
MA: 7905091

12.97
13.06

13.59

14.24 14.41 16.46
16.64

14.99 17.07 17.68 20.57 21.10

21.89
18.86

NL:
3.78E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS
2996DVc_2,4
805g_10ml01

nguồn ion 2000C, chế độ Full scan 30-120 amu; định lượng ở chế độ lọc ion: 39 và 79. 
Hình 3.24. Sắc đồ của dung dịch mẫu TD3-2996dvc khi phân tích trên hệ thống

GC-MS

</div>
(64)<div class='page_container' data-page=64>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 54 Trường ĐHKH Tự nhiên

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trên cở sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định hàm lƣợng
S-Allyl-L-cystein bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector PDA
và Diallyl disulfide bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp detector khối phổ, chúng
tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:

1. Đã xây dựng quy trình định lƣợng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen bằng
phƣơng pháp HPLC-PDA:

- Lựa chọn đƣợc các điều kiện của phƣơng pháp HPLC-PDA để xác định

hàm lƣợng SALC: cột sắc ký C18 Symmetry Waters (15 cm x 4,6mm x 5µm); pha
động kênh A dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B là ACN, chƣơng trình rửa giải
gradient, detector PDA, phát hiện và định lƣợng SALC tại λ = 265 nm.

- Lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết MeOH: H2O = 50:50 để tách SALC.

- Thẩm định phƣơng pháp phân tích HPLC-PDA: Xây dựng khoảng tuyến

tính SALC từ 1,6 µg/mL đến 40 µg/mL; giới hạn phát hiện 0,5540µg/g; giới hạn

định lƣợng 1,632 µg/g; độ lặp lại và độ thu hồi đáp ứng yêu cầu của AOAC.

- Khảo sát đƣợc các điều kiện cho phân tích DADS bằng phƣơng pháp

GC-MS: cột mao quản SPB-5MS (30m x 0,32mm x 0,25µm); chƣơng trình rửa giải
gradient nhiệt độ, chế độ Full scan 30-120 m/z, chế độ chọn lọc ion từ 39 – 79.

2. Đã xây dƣng quy trình định lƣợng Diallyl disulfide trong tỏi đen bằng
phƣơng pháp phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

- Lựa chọn đƣợc các điều kiện của phƣơng pháp GC-MS để xác định hàm

lƣợng DADS: cột mao quản SPB-5MS (30m x 0,32mm x 0,25µm); chƣơng trình
rửa giải gradient nhiệt độ, chế độ Full scan 30-120 m/z, chế độ chọn lọc ion từ 39 –
79.

- Xây dựng khoảng tuyến tính DADS từ 3,2 µg/mL đến 80 µg/mL; hệ số

</div>
(65)<div class='page_container' data-page=65>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 55 Trường ĐHKH Tự nhiên

3. Đã áp dụng quy trình tối ƣu để phân tích hàm lƣợng SALC và DADS
trong một số mẫu tỏi đen và sản phẩm từ tỏi đen lƣu hành trên thị trƣờng Hà Nội, và
phát hiện có chất nghiên cứu trong nền mẫu.

</div>
(66)<div class='page_container' data-page=66>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 56 Trường ĐHKH Tự nhiên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Chử Văn Mến, Vũ Bình Dƣơng, Trịnh Nam Trung, Đào Văn Đôn (2012),

“Nghiên cứu định lƣợng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen Lý Sơn bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Y dược học Quân sự, 9, tr. 7-12.

2. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr.

181-182.

3. Hồ Anh Sơn, Vũ Bình Dƣơng (2014), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch

chiết tỏi đen đối với một số cơ quan lympho trên chuột bị chiếu xạ”, Tạp chí

Y – dược Quân sự, tr. 31-38.

4. Hội đồng Dƣợc điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt Nam, Bộ Y tế, Hà Nội. 
5. Nguyễn Đức Vƣợng, Lê Thị Bạch Liên, Trần Thị Bích Ngọc, Từ Thị Mỹ

Hƣờng, Đinh Xuân Lãm (2015), “Nghiên cứu lên men tỏi đen từ tỏi trắng xã
Quảng Hòa – Quảng Trạch – Quảng Bình”, Tạp chí thơng tin khoa học và

cơng nghệ Quảng Bình, 1, tr. 56-59.

6. Nguyễn Văn Ri (2013), Các phương pháp tách, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Hà Nội.

7. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi

sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

8. Vũ Bình Dƣơng (2013), “Nghiên cứu thành phần hóa học của tỏi đen Lý Sơn”,

Tạp chí Y dược lâm sàng 108 , 8(4), tr. 103-107.

9. Vũ Bình Dƣơng, Vũ Xuân Nghĩa, Phạm Xuân Phong (2013), “Nghiên cứu khả

năng bảo vệ cơ quan tạo máu của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên chuột
bị chiếu xạ”, Tạp chí Dược học, 446, tr. 12-16.

10. Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Văn Long (2013), “Đánh giá tác dụng chống oxy

hóa của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên động vật thực nghiệm”, Tạp chí

</div>
(67)<div class='page_container' data-page=67>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 57 Trường ĐHKH Tự nhiên

Tiếng Anh

11. A. Bordia, 1 S. K. Verma, 1 K. C. Srivastava (1998), “Effect of garlic

(Allium sativum) on blood lipids, blood sugar, fibrinogen and fibrinolytic
activity in patients with coronary artery disease”, Prostaglandins,

Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 58(4), pp. 257-263.

12. A. Fabiani, A. Versari, G.P. Parpinello, M. Castellari, and S. Galassi (2002),

“High-performance liquid chromatographic analysis of free amino acids in
fruit juices using derivatization with 9-fluorenylmethyl-chloroformate,

Journal of Chromatographic Science, 40, pp. 14-18.

13. Airo Tsubura, Yen-Chang Lai, Maki Kuwata, Norihisa Uehara and Katsuhiko

Yoshizawa (2011), “Anticancer Effects of Garlic and Garlic-derived
Compounds for Breast Cancer Control”, Anti-Cancer Agents in Medicinal

Chemistry, 11, pp. 249-253.

14. Ana L. Colín-Gonález, Ricardo A. Santana, Carlos A. Silva-Islas, Maria E.

Chánez-Cárdenas, Abel Santamaría, and Perla D. Maldonado (2012), “The 
antioxidant mechanisms underlying the aged garlic extract and
S-Allylcystein Induced Protection”, Hindawi Publishing Corporation,

Oxidative Medicine and Cellular Longevity, pp. 1-16.

15. Arnault et al (2005), “Analytical method for appreciation of galic therapeutic

potential and for validation of a new formulation”, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37(5), pp. 963-70.

16. B. Ray, N.B. Chauhan, and D.K. Lahiri (2011), “The “Aged Garlic

Extract”(AGE) and one of its active ingredients S-Allyl-L-Cysteine (SAC)
as potential preventive and therapeutic agents for Alzheimer’s Disease
(AD)”, NIH Public Access Author Manuscript, 18(22), pp 3306–3313.

17. Cathy J Watson, David de Souza, Claudio Silva, Dedreia Tull, Suzanne M

Garland and Larry L Lawson (2013), “Attempt to Detect Garlic Allyl
Sulphides from Saliva after Consumption of Garlic Tablets Using GC-MS”,

</div>
(68)<div class='page_container' data-page=68>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 58 Trường ĐHKH Tự nhiên

18. Chan Wok Sohn, Hyunae Kim, Bo Ram You, Min Jee Kim, Hyo Jin Kim, Ji

Yeon Lee, Dai-Eun Sok, Jin Hee Kim, Kun Jong Lee, and Mee Ree Kim
(2012), “High Temperature- and High Pressure-Processed Garlic Improves
Lipid Profiles in Rats Fed High Cholesterol Diets”, Journal of Medicinal

Food, 15(5), pp. 435-440.

19. Dannan Wang et al (2010), “Black Garlic (Allium Sativum) Extracts Enhance

the Immune System”, Medicinal and Aromatic Plant Science and

Biotechnology, Global Science Book, pp. 37 – 40.

20. Eikai Kyo, Naoto Uda, Shigeo Kasuga, Yoichi Itakurav (2001),

“Immunomodulatory effects of aged garlic extract”, The American Society

for Nutritional Sciences, pp. 1075s-1079s.

21. Feng-Yao Tang, En-Pei Chiang, and Man-Hui Pai (2010), “Consumption of

S-Allylcysteine inhibits the growth of human non-small-cell lung carcinoma in
a mouse xenograft model”, Journal Agricultural and Food Chemistry, 
58(20), pp. 11156-11164.

22. Francisca Pérez-Severiano, Mayra Rodríguez-Pérez, José Pedraza-Chaverrí

Perla D.Maldonado, Omar N. Medina-Campos, Alma Ortiz-Plata, Aurora
Sánchez-Garcı´a, Juana Villeda-Hernández, Sonia Galván-Arzate, Penélope
Aguilera, Abel Santamaría (2004), “S-Allylcysteine, a garlic-derived
antioxidant, ameliorates quinolinic acid-induced neurotoxicity and oxidative
damage in rats”, Neurochemistry International, 45, pp. 1175-1183.

23. Ganapathy Saravanan, Ponnusamy Ponmurugan (2010), “Beneficial effect of

S-allylcysteine (SAC) on blood glucose and pancreatic antioxidant system in
streptozotocin diabetic rats”, Plant Foods Hum Nutrient, 65, pp.374–378.

24. Ganapathy Saravanan, Ponnusamy Ponmurugan, Mustapha Shabana Begum
(2013), “Effect of S-allylcysteine, a sulphur containing amino acid on iron
metabolism in streptozotocin induced diabetic rats”, Journal of Trace

Elements in Medicine and Biology, 27 (2), pp. 143-147.

25. Jai-Sing Yang, Guang-Wei Chen, Te-Chun Hsia, Heng-Chien Ho, Chin-Chin

</div>
(69)<div class='page_container' data-page=69>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 59 Trường ĐHKH Tự nhiên

Lui, Jing-Gung Chung (2009), “Diallyl disulfide induces apoptosis in human
colon cancer cell line (COLO 205) through the induction of reactive oxygen
species, endoplasmic reticulum stress, caspases casade and
mitochondrial-dependent pathways”, Food and Chemical Toxicology, 47(1), pp. 171-179.

26. Jeong-Eun Lee, Ryung-Ah Lee, Kwang-Ho Kim, and Joo-Ho Lee (2011),
“Induction of apoptosis with diallyl disulfide in AGS gastric cancer cell
line”, Journal of the Korean Surgical Society, 81(2), pp. 85-95.

27. Jiben Roy et al (2006), “Chemical constituents and antimicrobial activity of a

traditional herbal medicine containing garlic and black cumin”, African

Journal of Traditional, 3(2), pp. 1-7.

28. Jin-Ichi Sasaki (2015), “Overview of the Black Garlic Movement in the Fields

of Research and Marketing”, Journal of Life Science, 9, pp. 65-74.

29. Ji-Sang Kim, Ok-Ju Kang, Oh-Cheon Gweon (2013), “Comparison of phenolic

acids and flavonoids in black garlic at different thermal processing steps”,

Journal of Functional Foods, 5, pp. 80-86.

30. Kevin T. P. Ng, Dong Yong Guo, Qiao Cheng, Wei Geng, Chang Chun Ling,

Chang Xian Li, Xiao Bing Liu, Yuen Yuen Ma, Chung Mau Lo, Ronnie T.
P. Poon, Sheung Tat Fan, Kwan Man (2012), “A garlic derivative,
S-allylcysteine (SAC), suppresses proliferation and metastasis of
hepatocellular carcinoma”, Plos one, 7(2), pp. e31655.

31. L. D. Lawson (1998), “Garlic: a review of its medicinal effects and indicated

active compounds”, In Phytomedicines of Europe: Chemistry and Biological

Activity, L.D.Lawson and R.Bauer, Eds., ACS Symposium Series, American 
Chemical Society, Washington, DC, USA, 691, pp. 179–209.

32. Lee-Yan Sheen, Shiow-Fen Sheu, Shun-Jen Tsai, Raymond H .C. Meng and

Chong-Kuei Lii (1999), “Effect of garlic active principle, diallyl disulfide,
on cell viability, lipid peroxidation, glutathione concentration and its related
enzyme activities in primary rat hepatocytes”, American Journal of Chinese

</div>
(70)<div class='page_container' data-page=70>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 60 Trường ĐHKH Tự nhiên

33. Mei-chin Yin, Wen-shen Cheng (2003), “Antioxidant and antimicrobial effects

of four garlic-derived organosulfur compounds in ground beef”, Meat

Science, 63, pp. 23-28.

34. Michael H. Brodnitz, John V. Pascale, and Linda Van Derslice (1971), “Flavor

Components of Garlic Extract”, Journal Agriculture Food Chemistry, 19(2), 
pp. 273-275.

35. Min-Ju Kim, Woo-Suk Bang, Keun-Sung Kim, and Sung-Soo Park (2012),

“Determination of S-Allyl-L-cystein, Diallyl Disulfide, and Total Amino

Acids of Black Garlic after Spontaneous Short-term Fermentation”, Journal

Korean Society Food Science Nutrition, 41(5) , pp. 661-665.

36. Mohammad Ashafaq, Mohd. Moshahid Khan, Syed Shadab Raza, Ajmal

Ahmad, Gulrana Khuwaja, Hayate Javed, Andleeb Khan, Farah Islam, M.
Saeed Siddiqui, Mohammed M. Safhi, Fakhrul Islam (2012), “S-allyl
cysteine mitigates oxidative damage and improves neurologic deficit in a rat
model of focal cerebral ischemia”, Journal of Nutrition & Intermediary
Metabolism, 32(2), pp. 133-143.

37. Omkumar R. V., Kadam S. M., Banerji A. and Ramasarma T. (1993), “On the

involvement of intramolecular protein disulfide in the irreversible
inactivation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase by diallyl
disulfide”, Biochimica et Biophysica Acta, 1164, pp. 108-112.

38. Pandrangi Anupama (2015), “Cancer Chemoprevention by Garlic - A Review”,

Hereditary Genet, 4(2), pp. 1000147.

39. Qingjun Chu, Davy T.W. Lee, Sai Wah Tsao, Xianghong Wang and Yong

Chuan Wong (2006), “S-allylcysteine, a water-soluble garlic derivative,
suppresses the growth of a human androgen-independent prostate cancer
xenograft, CWR22R, under in vivo conditions”, Journal Complilation

40. Sang Eun Bae, Seung Yong Cho, Yong Duk Won, Seon Ha Lee, Hyun Jin Park

</div>
(71)<div class='page_container' data-page=71>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 61 Trường ĐHKH Tự nhiên

properties of black garlic during heat treatment”, Food Science and

Technology , 55, pp. 397–402.

41. Sanghee Lee et al (2014), “Development and Validation of S-Allyl-L-Cysteine

in Rat Plasma Using a Mixed-Mode Reversed-Phase and Cation-Exchange
LC–ESI–MS/MS Method: Application to Pharmacokinetic Studies”,

Journal of Chromatographic Science Advance Access, 57, pp. 1-6.

42. Sanghee Lee, Miyoung Yoo, Sunyoung Kim, Dongbin Shin (2014),

“Identification and quantification of S-allyl-L-cysteine in heated garlic juice
by HPLC with ultraviolet and mass spectrometry detection”, Journal Korea

Food Research Institute, 57, pp. 516 – 521, 2014.

43. Sang Eun Bae, Seung Yong Cho, Yong Duk Won, Seon Ha Lee, Hyun Jin Park

(2012), “A comparative study of the different analytical methods for
analysis of S-allyl cysteine in black garlic by HPLC”, Food Science and

Technology , 46, pp. 532–535.

44. Shin Chet Chuah, Philip K. Moore and Yi Zhun Zhu (2007), “S-allylcysteine

mediates cardioprotection in an acute myocardial infarction rat model via a
hydrogen sulfide-mediated pathway”, AJP-Heart Circ Physiol, 293, pp. 
H2893-H2701.

45. Sook Choi, Han Sam Cha and Young Soon Le (2014), “Physicochemical and

Antioxidant Properties of Black Garlic”, Journal of Molecules”, 19, pp. 
16811 – 16823.

46. Sung-Jin Lim, Ji-Hye Lee, Jin-Hyo Kim, Geun-Hyoung Choi, Nam-Jun Cho

and Byung-Jun Park (2014), “Determination of dimethyl disulfide, diallyl
disulfide, and diallyl trisulfide in biopesticides containing Allium Sativum
extract by gas chromatography”, Korean Journal of Environmental

Agriculture, 33(4), pp. 381-387.

47. Toru Imai, Yasuhiro Kosuge, Hiroaki Saito, Taketo Uchiyama, Taira Wada,

</div>
(72)<div class='page_container' data-page=72>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa 62 Trường ĐHKH Tự nhiên

independent of calpain inhibition”, Journal of Pharmacological Sciences, 
xxx, pp. 1-4.

48. Xin An, Xiuhai Zhang, Hongjun Yao, Hongyang Li, Jianwu Ran (2015),

“Effects of diallyl disulfide in elephant garlic extract on breast cancer cell
apoptosis in mitochondrial pathway”, Journal of Food and Nutrition

Research, 3(3), pp. 196-201.

49. Young-Min Lee et al (2009), “Antioxidant effect of garlic and aged black garlic

in animal model of type 2 diabetes mellitus”, Journal Nutrion Research and

Practice, 3(2), pp. 156–161.

50. Yukihiro Kodera, Ayumi Suzuki, Omasu Imaza, Shigeo Kasuga, Isao Sumioka,

</div>
(73)<div class='page_container' data-page=73>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên I
PHỤ LỤC

1.Sắc đồ khảo sát điều kiện tối ƣu của phƣơng pháp HPLC-PDA 
1.1. Khảo sát chƣơng trình rửa giải của pha động

- 5

0.00
0.02
0.04
0.06

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

- 2

0.00
0.10
0.20
0.30

0.40
0.50

Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

- 1

0.00

0.10
0.20
0.30
0.40
0.50

Minutes

</div>
(74)<div class='page_container' data-page=74>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên II

- 1

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50

Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

- 1

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50

Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

1.2. Khảo sát nồng độ đệm borat

6.5

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50

Minutes

</div>
(75)<div class='page_container' data-page=75>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên III

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

</div>
(76)<div class='page_container' data-page=76>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên IV

1.3. Khảo sát pH đệm borat

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30

Minutes

</div>
(77)<div class='page_container' data-page=77>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên V

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

1.4. Khảo sát thời gian dẫn xuất

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08

Minutes

</div>
(78)<div class='page_container' data-page=78>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên VI

- 6

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

1.5. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết

- 6

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

</div>
(79)<div class='page_container' data-page=79>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên VII

- 6

0.00
0.05
0.10
0.15
0.20

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

0.00
0.05
0.10

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

</div>
(80)<div class='page_container' data-page=80>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên VIII

0.00
0.02
0.04

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

1.6. Độ đặc hiệu

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 1

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

</div>
(81)<div class='page_container' data-page=81>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên IX

- 1

0.00
0.10
0.20
0.30

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

1.7. Khoảng tuyến tính và lập phƣơng trình đƣờng chuẩn

- 1

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 1

0.00
0.05
0.10

0.15

Minutes

</div>
(82)<div class='page_container' data-page=82>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên X

- 6

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 1

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

1.8. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng

0.002
0.004
0.006
0.008

Minutes

</div>
(83)<div class='page_container' data-page=83>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XI

0.002
0.004
0.006
0.008

Minutes

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

0.002
0.004
0.006
0.008

Minutes

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

0.002

0.004
0.006
0.008

Minutes

</div>
(84)<div class='page_container' data-page=84>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XII

- 5

0.002
0.004
0.006
0.008

Minutes

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

1.9. Độ lặp lại

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 5

0.002
0.004
0.006
0.008

Minutes

</div>
(85)<div class='page_container' data-page=85>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XIII

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

</div>
(86)<div class='page_container' data-page=86>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XIV
1.10. Độ thu hồi

- 6

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

S

A

LC

- 6

.7

15 -

39

98

9

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 6

0.00
0.05
0.10
0.15

Minutes

</div>
(87)<div class='page_container' data-page=87>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XV
1.11. Sắc đồ phân tích một số mẫu thực

- 6

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10

Minutes

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

- 3

0.000
0.010
0.020
0.030

0.040

Minutes

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

6.9

15 -

96

68

3

0.00
0.10
0.20
0.30
0.40

Minutes

</div>
(88)<div class='page_container' data-page=88>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XVI
2. Sắc đồ khảo sát điều kiện tối ƣu của phƣơng pháp GC-MS

2.1. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.64
MA: 783664

15.78
23.24

12.98 13.57 16.07 18.41 19.28 20.72 21.68 22.49

NL:
1.78E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-c-3,0681g-10ml-EtOH

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.55
MA: 765788
12.37
15.76

12.89 14.10 16.05 17.23 18.71 19.48 20.66 21.82 22.39

NL:
3.19E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-b-3,1684g-10ml-Acetone

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10

20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nce
RT: 12.61
MA: 841006
15.76

12.98 13.56 16.07 18.13 18.80 19.80 21.76 22.43 23.32

</div>
(89)<div class='page_container' data-page=89>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XVII
2.2. Độ đặc hiệu

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc

e
12.12
12.16
12.22
12.28
12.37
12.52
12.58
12.78
13.74
13.88
14.39

15.01 15.84 16.78

17.67 18.65 20.02 21.10 21.87 22.70
NL:
2.16E5
m/z=

38.50-39.50+
78.50-79.50
MS Blank

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
RT: 12.66
MA: 390577
15.83

13.03 13.78 15.96 18.26 18.78 20.46 21.00 22.30 23.00

NL:
1.10E5
m/z=

38.50-39.50+

78.50-79.50 MS
Std-4ppm

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re

lat
ive
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.66
MA: 212294
15.83

12.94 13.72 17.14 18.35 18.78 21.02 21.86 22.48 23.32

</div>
(90)<div class='page_container' data-page=90>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XVIII

Blank-spk #138 RT:12.67 AV:1 NL:6.65E3

T:+ c Full ms [30.00-120.00]

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

m/z
0
5
10
15
20
25

30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
31.81
38.85
40.85
43.86
36.81 44.83

54.92 63.85 78.94

47.84 68.89 84.88 97.08 112.80

2.3. Khoảng tuyến tính và lập phƣơng trình đƣờng chuẩn

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.66
MA: 213346

15.83

12.94 13.72 17.14 18.78 20.91 21.86 22.48 23.32

NL:
5.92E4
m/z=

38.50-39.50+

78.50-79.50 MS
Std-3,2ppm

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re

lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.66
MA: 390577
15.83

13.03 13.78 15.96 18.26 18.78 20.46 21.00 22.30 23.00

</div>
(91)<div class='page_container' data-page=91>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XIX

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80

90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.65
MA: 461390
15.82

12.98 13.64 16.83 17.93 18.78 20.15 21.20 22.47 23.09

NL:
1.20E5
m/z=

38.50-39.50+

78.50-79.50 MS
Std-5,3ppm

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.65
MA: 826174
15.81

13.04 14.04 16.00 17.55 18.76 20.44 22.46 22.98

NL:
2.74E5
m/z=

38.50-39.50+

78.50-79.50 MS

Std-8ppm

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.63
MA: 1520324
15.80

12.97 13.64 15.96 17.59 18.75 20.45 21.74 22.47 22.98

</div>
(92)<div class='page_container' data-page=92>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XX

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.59
MA: 3141195

15.79

13.09 15.25 15.96 17.67 18.74 20.12 21.78 22.45 22.96

NL:
1.24E6
m/z=

38.50-39.50+

78.50-79.50 MS
Std-32ppm

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re

lat
ive
A
bu
nd
an
ce
RT: 12.63
MA: 7928251
15.79
22.44

13.50 15.21 16.28 18.25 18.73 19.79 21.68 23.28

</div>
(93)<div class='page_container' data-page=93>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XXI

2.4. Giới hạn định lƣợng (LOQ)
RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25

30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lati
ve
Ab
und
anc
e
RT: 12.68
MA: 17575
18.75
19.04
20.46
20.14
14.67
21.13

12.87
14.73
13.00 15.56
16.40

17.25 19.10 23.37

21.31
NL:
8.17E3
m/z=

38.50-39.50+
78.50-79.50
MS
Blank-spk

2.5. Độ lặp lại

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25

30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.68
MA: 2110954
14.12
17.41
13.86

14.82 17.14 20.50

16.64 18.16 19.50 20.67 22.89

NL:
9.13E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-b-3,1002g-10ml

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.68
MA: 2287235
14.12
17.41
13.86

14.82 16.64 17.14 18.16 19.50 20.50 20.67 22.89

</div>
(94)<div class='page_container' data-page=94>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XXII

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da

nc
e
RT: 12.71
MA: 1929060
14.11 17.40
13.86
12.95
14.81 17.15
18.67 20.38

16.64 20.92 21.85 23.10

NL:
7.51E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-e-3,0655g-10ml

2.6. Độ thu hồi

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5

10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.67
MA: 1973391
14.10 17.40

13.85

14.80 16.63 17.13 18.13 18.31 20.50 20.66 22.35 22.90

NL:
7.03E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-1a-2,9564g-10ml-2

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.68
MA: 2039493
14.11 17.40
13.85
12.92 14.79
17.12 20.50

16.63 18.14 18.30 21.31 22.80

</div>
(95)<div class='page_container' data-page=95>

Luận văn thạc sĩ Chun ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XXIII

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lati
ve
Ab

un
da
nc
e
RT: 12.69
MA: 2033317
17.40
14.11
13.85

14.79 16.63 17.13 18.66 20.49 20.90 21.84

NL:
8.44E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-1c-2,9831g-10ml-2

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15

20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.69
MA: 3513214
14.12
17.41
13.87

14.83 16.66 18.68 20.51 20.68 23.28

NL:
1.26E6
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS

M-2a-2,9917g-10ml-2

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nc
e
RT: 12.61
MA: 6487290
12.85
12.98
13.07 22.72
15.28 22.17

13.30 19.09 19.17

22.10

14.27 17.11 17.73 20.92 22.96

</div>
(96)<div class='page_container' data-page=96>

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Nguyễn Thị Thu Hoa Trường ĐHKH Tự nhiên XXIV

2.7. Sắc đồ phân tích một số mẫu thực

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
Ab
un
da
nce
RT: 12.87
MA: 7905091

12.97
13.06
13.59

14.24 14.41 16.46

16.64

14.99 17.07 17.68 20.57 21.10

21.89
18.86
NL:
3.78E5
m/z=
38.50-39.50+
78.50-79.50
MS
2996DVc_2,4
805g_10ml01

RT:12.00 - 24.03

12 14 16 18 20 22 24

Time (min)
0
10
20
30

40
50
60
70
80
90
100
Re
lat
ive
A
bu
nd
an
ce
RT: 12.97
MA: 7574938
13.37
13.57 14.16
16.37 16.48
14.43
16.76
14.76
16.97

</div>

Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định hàm lượng S-allyl-L-cystein (SALC), Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen

chƣa

có nghiên cứu cụ thể nào để phân tích hàm lƣợng DADS trong tỏi đen.















100

<i>m</i>

<i>m</i>

<i>C</i>

<i>C</i>

<i>R</i>

S

A

LC

- 6

.7

15

-

39

98

9

6.9

15

-

96

68

3

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về