SEMINAR ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI POLYMETHOXYFLAVON, COUMARIN VÀ ACID PHENOLIC TRONG cây AGERATUM CONYZOIDES BẰNG PP UPLC ESI QToF MS VÀ UPLC DAD

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆN ĐẠI

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
POLYMETHOXYFLAVON, COUMARIN VÀ
ACID PHENOLIC TRONG CÂY
AGERATUM CONYZOIDES
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
UPLC-ESI-QToF-MS VÀ UPLC-DAD


Nôi dung
1. Tổng quan
2. Giơi thiêu
3. Đối tượng –
phương pháp
4. Kêt qua – ban luân
5. Kêt luân
2


1. Tổng quan
3


UPLC-PDA/ ESI-QToF-MS

27 compounds
Axit chlorogen, Axit coumaric,
Coumarin, 5,6,7,3',4',5’
Hexamethoxyflavone, Nobiletin,
5'-Methoxynobiletin va Eupalestin.

4


2. Giơi thiệu
5


Định tính va định lượng đồng thời các polymethoxyflavone,
coumarin va acid phenolic trong cây Ageratum conyzoides bằng
phương pháp UPLC-ESI- QToF-MS va UPLC-DAD

6


Ageratum conyzoides
Asteraceae

Nhiều tác dụng dược lý

chống viêm, giảm đau và chống viêm khớp

Các nghiên cứu đã được thực hiện

Tìm thấy benzofurans, coumarin, monoterpenes,
pyrrolizidin alkaloids và flavonoid
polymethoxyflavon

?

Tập trung vao định tính va định lượng
các thanh phần chiêt xuất

Mục đích nghiên cứu

Polymethoxyflavon

Axit phenolic
7


3. Đối tượng va phương
pháp nghiên cứu
8


Hóa chất va nguyên liệu
Acetonitril và metanol (HPLC-grade)
Nước thẩm thấu ngược Milli-Q, acid formic
Chất chuẩn của: clorogenic acid hemihydrat,
coumarin, p-coumaric, lycopsamin
Polymethoxyflavon đô tnh khiêt > 97%
Lá Ageratum conyzoides đa được kiêm nghiêm

9


Chuẩn bị mẫu
Dich chiêt từ lá A. conyzoides được điều chê theo phương pháp cở truyền
Hịa tan một lượng dich

chiêt đâm đăc trong 50%
dung dich metanol đê đạt
nồng độ 200 µg/g.

Lá tươi (30 g) +
500 ml nước đun
sôi trong 15 phút.

3

1
2

Lọc và loại bỏ nước
thực hiện dưới áp suất
giảm, tạo ra 670 mg
dich chiêt đâm đăc

4
Lọc qua màng
micropore 0,22 μm và
được lưu trữ ở 4 ºC
10


Phân tích định tính
H-Class UPLC
Cột UPLC
BEH C18

 40 ºC
 0,35 mL /phút
 10 µL

Hệ thớng xử lý
dữ liệu

Bộ phận phát hiện
ion

Mass Lynx software
11


Phân tích định tính
Chương trình gradient dung mơi như sau:
Thời gian (phút)

Dung môi A

Dung môi B

0–1

90 – 78

10 – 22

1–2

78 – 65

22 – 35

2–8

65 – 15

35 – 85

8–9

15 – 2

85 – 98

9 – 9,5

2

98

9,5 – 9,6

2 – 90

98 – 10

+3

2 – 90

98 – 10
12


Phân tích định tính
• Quy trình phun sương được vân hành ở cả chê đơ ion dương và
ion âm
• Số khối: 100 – 1500 Da
• Thời gian quét mẫu: 1s
• Năng lượng va chạm: 15 – 25 eV
Thông sô

Quét ion +

Quét ion -

Điện áp đầu mao quản (kV)

3

2,5

Điện áp mẫu (kV)

40

40

Điện áp bu nguồn (kV)

80

80

Nhiệt độ hóa hơi dm (0C)

150

150

Nhiệt độ nguồn (0C)

80

80

Lưu lượng khí vào (L/h)

100

0

Lưu lượng khí hóa hơi (L/h)

1000

600

13


/>
Phân tích định tính

Waters Xevo® G2-XS QTof

14


Phân tích định lượng

Waters Empower 3 Chromatography Data
Acquity H-Class UPLC

Acquity UPLC BEH C18

 Nhiêt đô: 25 0C
 Pha đông theo chương trinh gradient
 Tớc đơ dong: 0,25 ml/phút
 Bươc sóng: Coumarin: 275 nm
Chất đánh dấu khác: 330 nm
 Khoang quét phổ UV: 550 – 190 nm
15


Phân tích định lượng

- Pha đơng:

 Dung mơi A: acid formic 0,1% + nước
 Dung mơi B: Acetonitril
- Chương trình gradient dung môi
Thời gian (phút)

Dung môi A

Dung môi B

0–4

90%

10

4 – 13

90 – 70

10 – 30

13 – 15

70

30

15 – 17

70 – 50

30 – 50

17 – 24

50 – 44

50 – 56

24 – 24,1

44 – 10

56 – 90

24,1 – 25

10

90

25 – 25,1

10 – 90

90 – 10

+ 5 phút rửa giải

10 – 90

90 – 10

16


Thẩm định quy trinh
Khoang tun tính

01
Đơ đúng

Đơ chính
xác

05

04

02

03

Giơi hạn
phát hiên

Giơi hạn
định lượng
17

Thẩm định quy trinh

KTT

LOD

LOQ

LOQ

 Mẫu chuẩn: nồng đô từ 0,05 – 5,0 µg/g với 9 nồng đơ khác nhau
 Hê số R2 được tính từ phương trình hồi quy bằng phương pháp
bình phương cực têu
 LOD, LOQ được xác đinh bằng cách têm liên têp các mẫu chuẩn đa pha
loang cho đên khi cường đô tín hiêu/nhiêu đường nền đạt 3:1 cho LOD
và 10:1 cho LOQ
18


Thẩm định quy trinh
Đô
lăp lại
 Đô lăp lại: trong ngày
 Đô lăp lại trung gian: giữa
các ngày (sau 3 ngày)
 Tiên hành trên 6 mẫu thử có
nồng đô chinh xác 200 µg/g
 RSD% < 2%

Đơ
đúng
 Mẫu thử thêm chuẩn
 3 mưc nồng đơ thấp, trung
bình và cao (80, 100, 120%)
 Sự phục hồi được tính bằng tỉ
lê giữa chất chuẩn tm lại/chất
chuẩn thêm vào
19


Ứng dụng quy trinh đã thẩm định
Hãm trong 15 phút

Định lượng tất ca các chất
chuyển hóa từ 3 dịch chiêt
khác nhau của lá cây
Ageratum conyzoides

Đun sôi trong 15 phút
Lo vi sóng trong 2 phút

20


4. Kêt qua - Ban luận

21

Phân tích định tính
Phân tích UPLC-ESI-QToF MS2chê độ ion hóa âm [ESI(-)] va dương [ESI (+)]
Positve mode
Alcaloid pyrrolizidin
Polymethoxyflavon
Negatve mode
Acid phenolic

22


Phân tích định tính
Coumarin

Alcaloid pyrrolizidine

C20H18O9

Polymethoxyflavone


Phân tích định tính
Polyphenol

Acid phenolic


Phân tích định lượng
5,6,7,3, 4, 5, 5hexomethoxyflavon

acid chlorogen

nobiletn

acid coumaric

5-methoxynobiletn

1,2-benzopyron
eupalestn.

25