Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của AND ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012


MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... a
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... c
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... d
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. TY THỂ........................................................................................................ 3
1.1.1. Hệ genome ty thể ................................................................................... 3
1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể ....................................................... 5
1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thƣ .................................................... 7
1.2. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................................ 10
1.2.1. Khái quát về ung thƣ đại trực tràng ...................................................... 10
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng ............................................... 11
1.2.3. Phân loại các dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học ......................... 12
1.2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20] ...................... 15
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG .. 16
1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể ..................................................... 17
1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể ................................................. 19
1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đốn bệnh ... 22
1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc ...................................................... 24
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................... 26
2.1. NGUYÊN LIỆU ......................................................................................... 26
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 26
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 26
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................ 27

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 28
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ............................................................. 28


2.2.2. Khuế ch đa ̣i đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằ ng PCR . 29
2.2.3. Phân tích RFLP .................................................................................... 31
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn 32
2.2.5. Tinh sạch ADN .................................................................................... 35
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 37
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY
THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................... 37
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng .................. 37
3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể ....................................... 38
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể .......... 38
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY
THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................... 40
3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể ..................................... 40
3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G .................. 41
3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G ....................... 42
3.2.4. Phân tić h mố i liên quan giữa đa hin
̀ h A10398G với các đă ̣c điể m bê ̣nh
học lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng ........................................ 46
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 59
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 61
PHỤ LỤC................................................................................................................. i
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân cùng đặc điểm lâm sàng ..................................... i
Phụ lục 2. Kết quả giải trình tự đoạn 10398 ........................................................ vi

Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

bp

Base pair (cặp bazơ)

CPEO

Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ
ngoài tiến triển mãn)

cs

Cộng sự

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

KSS

Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre)

LHON

Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di
truyền Leber)

LS

Leigh syndrome (Hội chứng Leigh)

MELAS

Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke -like
episodes (Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện
tƣơng tự đột quỵ)

MERRF

Myoclonus epilepsy and ragged red fibers (Chứng động kinh co giật
cơ và có sợi đỏ nham nhở)

mtDNA

Mitochondrial DNA (ADN ty thể)

NARP

Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa (Bệnh thần kinh, mất
điều hịa và thối hóa võng mạc)

ND3

NADH dehydrogenase 3

PCR

Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

a


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn)

ROS

Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

TBE

Tris borate EDTA

TNM

TumorNodeMetastasis

b


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thƣ đại trực tràng [29] .................... 13
Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác
nhau [29] ............................................................................................................... 15
Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng ............................................................................. 26
Bảng 4. Các hóa chất đƣơ ̣c sử dụng trong nghiên cƣ́u ............................................ 26
Bảng 5. Các thiết bị đƣơ ̣c sử dụng trong nghiên cƣ́u .............................................. 27
Bảng 6. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR ....................................... 29

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l ......................... 30
Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI .... 32
Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6]................. 33
Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] ...... 34
Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm 35
Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực
tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng ........................................................... 46

c


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75]. ........................................................ 4
Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] ........................................ 6
Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thƣ [19] ....................... 8
Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76]. ..................................................................... 11
Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng [77]. ........................... 15
Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể ngƣời [59]. ................................... 17
Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mơ ........................................ 37
Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 ............................................... 38
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII........................... 39
Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398............................................ 41
Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI ......................... 42
Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu khơng mang đột biến A10398G....................... 43
Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu khơng mang đột biến với trình tự ADN
chuẩn của ty thể ..................................................................................................... 44

Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G ................................. 44
Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty
thể ......................................................................................................................... 45
Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mơ. .................................. 48
Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính. ................................... 49
Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi. .......................................... 50

d


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u............................... 51
Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thƣớc u. ............................ 52
Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch. .................................... 53
Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM. ........................ 54
Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa. ....................... 55

e


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

MỞ ĐẦU

Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn. Ty thể đƣợc coi

là trung tâm năng lƣợng của tế bào, ở đây diễn ra q trình chuyển hóa các hợp chất
hữu cơ thành năng lƣợng mà tế bào có thể sử dụng đƣợc là ATP. Ngồi ra, ty thể
cịn đóng vai trị quan trọng trong nhiều q trình chuyển hóa khác nhƣ apoptosis
(q trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển q trình trao đổi
chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. Cho đến nay, ngƣời ta
đã thống kê đƣợc trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể
quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thƣờng đƣợc biểu hiện rất đa dạng,
chúng có thể liên quan đến rối loạn q trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là
những đột biến do thay đổi các nucleotide [57].
Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể
đƣợc xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y
học. Đặc biệt, hƣớng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể nhƣ một chỉ thị sinh học đang
phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh
chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các
dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thƣ – đề
tài thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Ung thƣ đại trực tràng là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế
giới, đứng hàng thứ hai sau ung thƣ phế quản ở nam giới và ung thƣ vú ở nữ giới.
Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm
khoảng 600000 trƣờng hợp mới đƣợc phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thƣ đại trực
tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thƣ đƣờng
tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thƣ dạ dày. Để đạt đƣợc hiệu quả điều trị tốt thì bệnh
nhân cần đƣợc chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày

1


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể,
đang ngày càng góp phần vào cơng tác chẩn đốn và điều trị bệnh có hiệu quả.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ
đại trực tràng”
với mục đích:
 Phát hiện đột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty thể ở bệnh nhân
ung thƣ đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
 Đánh giá mối liên quan giƣ̃a đột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty
thể với các đặc điểm lâm sàng của bê ̣nh ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời
Việt Nam.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1. TY THỂ
Ty thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng lƣợng trong chất dinh
dƣỡng thành năng lƣợng trong ATP. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn. Ty
thể đƣợc Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 đƣợc Benda đặt tên là
mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thƣờng có

dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng [3].
Ty thể đƣợc coi là trung tâm năng lƣợng của tế bào vì là nơi chuyển hóa các
chất hữu cơ thành năng lƣợng tế bào có thể sử dụng đƣợc là ATP. Ngồi ra, ty thể
đóng vai trị quan trọng trong nhiều q trình chuyển hóa nhƣ: Apoptosis (q trình
tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển q trình trao đổi chất của
tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32].
1.1.1. Hệ genome ty thể
Ty thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di
truyền của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vịng có kích thƣớc
16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa
nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen,
chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có
13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy
hóa. Số gen cịn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trị trong sự dịch mã của ty
thể [10] (hình 1). Các chuỗi polypeptide cịn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng
của ty thể đều đƣợc ghi mã bởi genome nhân và đƣợc tổng hợp trong ribosome của
tế bào chất.
Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trƣng
riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dịng mẹ,
có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số
lƣợng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lƣợng trong mô [60]. Hệ

3


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

gen ty thể không có vùng intron và các gen khơng có, hoặc có rất ít các bazo khơng

mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trƣờng hợp không xuất hiện các codon kết thúc
mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen
ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thƣớc 1,1 kb chứa các yếu tố
quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã nhƣ chứa promoter phiên mã của
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi
vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hƣởng tới tính tồn vẹn của các chuỗi
polypeptide đƣợc mã hóa trong ty thể [41].

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75].

Các đặc điểm của hệ gen ty thể nhƣ khơng có intron, khơng có histon bảo vệ,
lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do đƣợc tạo ra
trong q trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN
ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên
phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến,
tạo nên hiện tƣợng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng
đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là nhƣ nhau.
Trong nhiều trƣờng hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện
lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngƣỡng đột biến

4


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

[51]. Vì vậy, xác định đƣợc mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý
nghĩa cao trong chẩn đốn bệnh ty thể.
1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể

Những đặc điểm của hệ gen ty thể đƣợc phát hiện từ đầu những năm 1980,
và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã đƣợc tìm thấy
[68]. Bệnh ty thể là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các
hƣ hại trong quá trình tạo ATP. Khi lƣợng ATP đƣợc sinh ra thấp hơn nhu cầu tối
thiểu của mơ thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hƣ hỏng của các protein tham gia
vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa. Số lƣợng các phân tử ADN ở các mơ, các cơ
quan là khác nhau do có nhu cầu năng lƣợng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh
hƣởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ƣơng, cơ
xƣơng, tim, thận, gan, tụy. Các bệnh đƣợc mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm
sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của
bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa
trẻ còn nhỏ [57]. Tuy nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phƣơng pháp sinh học
phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học
trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan
đến đột biến gen phổ biến ở ngƣời, ảnh hƣởng tới ít nhất 1 trên 5000 ngƣời trong
quần cƣ dân [22] (hình 2).

5


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở ngƣời
đƣợc phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc
đời, từ đứa bé mới sinh đến ngƣời trƣởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột
biến đƣợc di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đốn cho một ngƣời có

thể đƣợc dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột
biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột
biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới
các bệnh ở ngƣời, hầu hết trong số đó ảnh hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng và
ngoại biên. Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm
gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô
hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác
chung giảm kèm chứng loạn màu sắc.

6


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột
biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V. Ngƣời bệnh có biểu hiện chậm
phát triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hịa, yếu cơ thần kinh.
Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,
giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hội
chứng Leigh. Ngƣời bệnh có biểu hiện rối loạn thối hóa thần kinh tiến triển, biểu
hiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thƣơng ở một hoặc nhiều khu vực của
hệ thần kinh trung ƣơng.
Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ
(MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu). Bệnh có các
triệu chứng rối loạn thần kinh trung ƣơng, liệt nửa ngƣời, mù và nôn mửa.
Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra

bởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys). Ngƣời bệnh có biểu hiện tai
biến, co giật cơ, lƣỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhƣợc thần kinh do teo não, nhƣợc
cơ.
1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thƣ
Mối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thƣ đã đƣợc
Otto Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 1930, khi ông giả thiết rằng
sự tăng tốc độ của quá trình đƣờng phân hiếu khí trong nhiều loại mơ u là do sự hƣ
hại chuỗi hô hấp trong những tế bào này [70]. Theo Warburg, một số biến đổi của ty
thể có liên quan đến ung thƣ là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi
trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp.
Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại
oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS). Trong điều kiện các electron bị
thừa quá mức (ví dụ nhƣ khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ
enzym chuỗi hô hấp, các ROS đƣợc tạo ra rất nhiều. Sự tăng của ROS, hoặc stress
oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hƣ hại các thành phần lipid và
protein nội bào. Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố

7


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể
có thể gây ra sự biểu hiện khác thƣờng của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển
điện tử đƣợc mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận
chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện
tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến q trình tạo thành ATP và ROS,
làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến q trình điều hịa

protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào. Nhƣ vậy biến đổi của hệ gen ty
thể có liên quan đến bệnh ung thƣ [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã đƣợc xác
định trong nhiều loại ung thƣ khác nhau, nhƣ ung thƣ vú, đại trực tràng, buồng
trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở
vùng ghi mã và vùng khơng ghi mã [19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi
ADN ty thể đã đƣợc xác định trong ung thƣ. Các biến đổi này bao gồm: đột biến
điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lƣợng bản sao ADN ty
thể.

Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thƣ [19]

8


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Đột biến điểm
Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thƣ vú, Tan và cs (2002) đã giải
trình tự genome ty thể trên 19 cặp mơ ung thƣ và mơ bình thƣờng của cùng bệnh
nhân và đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột
biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) đƣợc xác định trong các gen 16S
rRNA, ND2 và ATPase 6 [58]. Trong số các đột biến trên, đột biến thêm hoặc mất
base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng ghi
mã và không ghi mã [55].
Đột biến ADN ty thể đƣợc tìm thấy ở bệnh ung thƣ đại trực tràng. Polyak và
cs đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5,
cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng nhƣ các gen rRNA 12S và 16S [53].
Với bệnh ung thƣ buồng trứng, Liu và cs đã xác định đƣợc 60% đột biến

ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột
biến điểm T→C hoặc G→A. Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA,
16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả
năng bị đột biến cao trong bệnh ung thƣ buồng trứng [45].
Phân tích ở bệnh ung thƣ dạ dày, Wu và cs đã xác định đƣợc 48% mang đột
biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất base
tại vị trí nucleotide 303-309 (vị trí D310) [72].
Mất đoạn
ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, nhƣ mất đoạn 4977 bp, đã đƣợc xác định ở
ung thƣ vú [14], ung thƣ đại trực tràng [21]. Trong một nghiên cứu khác, Burgart và
cs đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%)
bệnh nhân ung thƣ dạ dày [17].

9


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Thêm đoạn
Wu và cs đã xác định đƣợc đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp)
trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thƣ của 1 bệnh nhân ung thƣ dạ
dày [72]. Hai đột biến này đặc trƣng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã đƣợc phát hiện ở nhiều loại bệnh ung
thƣ. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thƣ tuyến giáp [47], ung thƣ phổi [15], ung
thƣ đại trực tràng [44]. Biến đổi theo hƣớng giảm số bản sao ADN ty thể đƣợc xác
định thấy ở bệnh ung thƣ vú [63], ung thƣ biểu mô tế bào gan [42], ung thƣ buồng
trứng [69]. Nhƣ vậy biến đổi về hàm lƣợng ADN ty thể có liên quan với loại ung

thƣ.
Ngƣời ta cho rằng số lƣợng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thƣ có thể
phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thƣ đó. Ví dụ nhƣ các đột biến trong
vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. Mặt
khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl
hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, nhƣ là một cách để đáp ứng lại sự mất
chức năng của ty thể [38].
1.2. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.2.1. Khái quát về ung thƣ đại trực tràng
Ung thƣ đại trực tràng hay còn gọi là ung thƣ ruột kết (colon cancer) bao gồm
ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao
gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) và đoạn
xuống (descending colon). Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối
giữa đại tràng và hậu môn (hình 4). Ung thƣ thƣờng xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng
và trực tràng, thƣờng hai loại ung thƣ này có liên hệ với nhau và khó có thể xác
định ung thƣ nào xảy ra trƣớc, ung thƣ nào xảy ra sau vì thế thƣờng đƣợc gọi chung
là ung thƣ đại trực tràng [79].

10


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76].
Ung thƣ đại trực tràng là một trong những loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế
giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán là do ung
thƣ. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử
vong. Tỉ lệ mắc bệnh khơng giống nhau, ƣớc tính tỉ lệ bệnh nhân ở các nƣớc phát

triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nƣớc đang phát triển. Trên thực tế, số lƣợng
bệnh nhân ở cả hai nhóm nƣớc đang gia tăng nhanh chóng do sự già hóa dân số và
đời sống ngày càng đƣợc nâng cao. Ung thƣ đại trực tràng thƣờng đƣơ ̣c phát hiện ở
giai đoạn sau 45–50 tuổi, ở tuổi 70 là đa số (khoảng ½ số ngƣời), tuy nhiên bệnh có
xu hƣớng trẻ hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rƣợu bia, thuốc lá
[78].
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng
Ung thƣ đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến khởi sinh. Có 2 dạng polyp
phổ biến ở ung thƣ đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thƣ
sau này và polyp ác tính, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi
thành u tuyến lớn và dần hình thành ung thƣ xâm lấn. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu
lại cho rằng nguy cơ mắc ung thƣ trực tràng tăng lên ở một số gia đình nhiều thành
viên là do ảnh hƣởng của dạng polyp không phải khối u [33]. Các nhà khoa học chỉ ra
rằng có rất nhiều ngun nhân hình thành ung thƣ đại trực tràng và tất cả đều dẫn đến

11


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

việc biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thƣờng. Thống
kê cho thấy có 2 nhóm ngun nhân chính gây ra bệnh này đó là:
 Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thƣ, bất hoạt các gen ức chế khối
u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình.
 Yếu tố khơng di truyền: các tác nhân vật lí, hóa học; q trình lão hóa, chế
độ ăn uống ít xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rƣợu, hút thuốc lá
thƣờng xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng,
gây viêm loét đại tràng.

Ngoài 2 nhóm ngun nhân chính trên cịn có các ngun nhân khác nhƣ tuổi,
giới tính, chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thƣ đại trực tràng
[33].
1.2.3. Phân loại các dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học
Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000, các u biểu mô đại
trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thƣ biểu mơ, carcinoid (u nội tiết biệt hóa
cao), ung thƣ biểu mơ tuyến – carcinoid kết hợp. Ngồi ra, một số dạng hiếm gặp
khác nhƣ sacom (gồm các sacom cơ trơn, sacom mạch máu, sacom mỡ với tổn
thƣơng dạng khối lớn), u hắc tố ác tính, ung thƣ biểu mơ tế bào hình thoi (xuất hiện
riêng lẻ hay kết hợp với ung thƣ biểu mô tuyến hoặc ung thƣ biểu mô vảy và đƣợc
gọi là ung thƣ biểu mô – sacom), ung thƣ biểu mô tế bào sáng (xuất hiện riêng lẻ hay
kết hợp với một loại khác của ung thƣ đại trực tràng), ung thƣ biểu mô vảy đơn
thuần…Trong các dạng này thì ung thƣ biểu mơ tuyến là dạng rất hay gặp, chiếm
đến 95% trong tổng số các dạng ung thƣ đại trực tràng. Đây là dạng ung thƣ xuất
phát từ niêm mạc ruột với tổn thƣơng ban đầu có dạng nốt nhỏ, gồ cao, khi có phát
sinh từ một u tuyến, biểu hiện của nó đƣợc xác định theo các giai đoạn phát triển và
loại cấu trúc trƣớc đó là dạng polyp hay dạng nhú [7].
Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng:

12


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Việc xác định giai đoạn của ung thƣ cho biết kích thƣớc của khối u và mức độ
lan rộng của nó khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ quyết
định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thƣ. Hiện nay có một số hệ thống phân
giai đoạn ung thƣ đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới. Sự khác nhau giữa các hệ

thống này phụ thuộc vào mục đích của từng ngƣời sử dụng trong việc chẩn đoán và
bệnh án của từng bệnh nhân [20]. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đề cập
đến hệ thống TNM (Tumor–Lymph Node–Metastases). Đây là hệ thống phân loại
đƣợc áp dụng đối với các mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu.
Hệ thống TNM phân giai đoạn ung thƣ đại trực tràng dựa vào kích thƣớc, mức
độ lan rộng của khối u đến các hạch bạch huyết (Bảng 1). Trong đó:
T cho biết kích cỡ, mức độ lan sâu vào thành ruột của khối u.
N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chƣa và số lƣợng hạch bạch
huyết bị lây nhiễm.
M cho biết mức độ di căn của ung thƣ đến các cơ quan hoặc bộ phận khác của cơ thể.
Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thƣ đại trực tràng [29]

T – Khối u nguyên phát
Tx  U nguyên phát khơng đƣợc đánh giá
T0  Khơng có bằng chứng của u nguyên phát
Tis – Ung thƣ biểu mô tại chỗ: nội biểu mô hay xâm nhập lớp đệm
T1 – Ung thƣ biểu mô xâm nhập hạ niêm mạc
T2 – Ung thƣ biểu mô xâm nhập lớp đệm cơ niêm
T3 – Ung thƣ biểu mô xâm nhập qua lớp đệm cơ niêm tới dƣới thanh mạc hoặc vào mô
quanh đại tràng và trực tràng khơng có phúc mạc
T4 – U xâm nhập trực tiếp các cơ quan khác hoặc cấu trúc và/ hoặc gây thủng phúc
mạc tạng
N – Hạch lympho

13


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Nx – Hạch bạch huyết vùng không đƣợc đánh giá
N0 – Không di căn hạch bạch huyết vùng
N1 – Di căn 1 đến 3 hạch bạch huyết vùng
N2 – Di căn 4 đến nhiều hơn hạch bạch huyết vùng
M – Di căn xa
Mx – Di căn xa khơng đƣợc đánh giá
M0 – Khơng có di căn xa
M1 – Di căn xa

Nói chung, ung thƣ đại trực tràng đƣợc chia làm các giai đoạn (hình 5) [29]:
 Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thƣờng đƣợc tìm thấy trong các lớp
trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thƣờng có thể trở thành ung thƣ và
lây lan vào các mơ bình thƣờng gần đó. Giai đoạn 0 cũng đƣợc gọi là ung thƣ biểu
mô tại chỗ.
 Giai đoạn I: Ung thƣ đã bắt đầu lây lan, nhƣng vẫn còn trong lớp lót bên trong.
 Giai đoạn II: Ung thƣ đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc trực
tràng nhƣng chƣa lây lan đến các hạch bạch huyết.
 Giai đoạn III: Ung thƣ đã lan đến hạch bạch huyết nhƣng chƣa lan đến những
phần xa của cơ thể.
 Giai đoạn IV: Ung thƣ đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ thống bạch
huyết, đƣợc gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thƣ đại trực tràng thƣờng di căn đến
là phổi và gan.

14


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng [77].

Tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ở các giai đoạn bệnh đƣợc thể hiện trong bảng 2.
Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác
nhau [29]

Giai đoạn

Khả năng sống sót sau 5 năm

TNM

Giai đoạn 0

Tis N0 M0

100%

Giai đoạn I

T12N0M0

8095%

Giai đoạn IIA

T3N0M0

7275%

Giai đoạn IIB

T4N0M0

6566%

Giai đoạn IIIA

T12N1M0

5560%

Giai đoạn IIIB

T34N1M0

3542%

Giai đoạn IIIC

T bất kỳ, N2M0

2527%

Giai đoạn IV

T bất kỳ, N bất kỳ, M1

07%

1.2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20]
Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các kỹ
thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đốn, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi
hiệu quả điều trị ung thƣ đại trực tràng. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh này bao
gồm:

15


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

 Chẩn đoán lâm sàng có thể dựa trên các triệu chứng: tiêu chảy hoặc táo bón,
có máu lẫn trong phân, phân chặt, khó chịu chung ở bụng (căng phồng hoặc co
thắt), đầy hơi thƣờng xun, sụt cân khơng rõ lý do.
 Chẩn đốn hình ảnh: phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay đó là nội soi đại
tràng sigma bằng ống soi mềm giúp nhìn rõ các khối u và làm sinh thiết.
 Chẩn đốn mơ học và tế bào học: phƣơng pháp này cho phép phân biệt giữa
các tế bào bình thƣờng, loạn sản và ung thƣ biểu mô tại chỗ. Phổ biến hơn cả là kỹ
thuật chọc hút kim nhỏ.
 Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Một số các xét nghiệm phổ
biến có thể kể tới là xét nghiệm sinh hóa phát hiện kháng nguyên ung thƣ (CEA),
xét nghiệm máu trong phân (FOBT).
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã
hóa và vùng khơng mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Năm
1998, Polyak và cs đã xác định đƣợc đột biến ADN ty thể ở các vùng mã hóa: ND1,
ND4L, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng nhƣ các gen rRNA 12S

và 16S [53].
Trong một nghiên cứu khác, Mansoureh và cs khi phân tích cặp mô thƣờng
và mô bệnh của 30 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, đã phát hiện 15 mẫu mang đột
biến trên vùng ND1, trong đó có 7 đột biến khác nhau. Đột biến T4216C chiếm
27%, khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thƣờng và mô bệnh [49].
Alonso và cs (1997) xác định sự có mặt của đột biến ADN ty thể (23%) trên
vùng D-Loop. Những đột biến này là đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp,
và đột biến thêm 2 bp [9]. Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên
cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng thấy rằng
88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) hoặc giữa các
pyrimidine (C, T), 11,4% còn lại là đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một
purin với một pyrimidine). Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA.

16